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Investigation into the membrane interactive properties of the escherichia coli low molecular weight penicillin-binding proteinsHarris, Frederick January 1998 (has links)
Various results have suggested that in Escherichia coli murein assembly may involve a protein complex(es) which could include low molecular mass penicillin-binding prpteins (PBPs). These proteins include PBP4, PBP5 and PBP6 which are penicillin sensitive enzymes associated with the periplasmic face of the inter membrane. The levels of these associations have been linked to enzymic activity and elucidation of the mechanism(s) involved in these associations may help identify and understand the regulation of this putative protein complex. It is currently accepted that the membrane associations of PBP5 and PBPÔ involve C-terminal amphiphilic cz-helices and such helices are ubiquitously employed in the lipid associations of membrane interactive protein molecules. Whether such helical structure features in the membrane associations of PBP4 or indeed if this protein is membrane bound or soluble, are, as yet, open questions. The focus of this research has been to investigate the lipid and membrane interactions of PBP4, PBP5 and PBP6 and in particular, to investigate the role played by these interactions of the C-terminal region of these proteins. Haemolytic analysis has shown that peptide homologues of the PBP5 and PBP6 C-terminal regions, P5 and P6, are active at the membrane interface and CD analysis has shown that these peptides possess a capacity for a-helix formation. CD and pressure - area isotherm analysis of monolayers formed from PS and P6 have shown that these peptides are able to adopt a-helical structure at an air - water interface. Monolayer studies have shown that P5 and P6 are able to interact with lipids and that these interactions are characterised by minor requirements for anionic lipid and the involvement of predominantly hydrophobic forces which are enhanced by low pH. Similar characteristics were revealed when perturbant washes and Western blotting were used to investigate the interactions of PBP5 with membranes derived from a mutant E. coli strain, HDL 11, in which the level of anionic lipid can be controlled. Overall, these results strongly support the hypothesis that C-terminal amphiphilic a-helices feature in PBP5 and PBP6 membrane anchoring. Molecular area determinations have implied that a peptide homologue of the PBP4 C-terminal region, P4 is able to adopt a-helical structure and this was confirmed by CD analysis. P4 showed no haemolytic activity but the peptide was found to interact generally with lipid monolayers. These monolayer interactions were characterised by a requirement for anionic lipid and involved predominantly electrostatic forces, which were enhanced by low pH. Similar characteristics but with no detectable requirement for anionic lipid were revealed when perturbant washes and chemiluminesence were used to investigate the interactions of PBP4 with membranes of the overproducing strain HB 10 I/pBK4 and those of HDL1 1. It is suggested that the PBP4 C-terminal region may play a role in PBP4 - membrane anchoring. Using chemiluminesence, no soluble form of PBP4 could be detected in the wild type E. coli, MRE600, suggesting that in wild type strains, PBP4 is exclusively membrane bound. It is suggested that PBP4 - membrane anchoring occurs at a specific binding site and overall, may differ fundamentally from that of PBP5 and PBP6.
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Plasma membrane sterols and fatty acids : effects on membrane properties and H'+-ATPase of Ustilago maydisHernandez Lopez, Agustin January 1996 (has links)
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Phosphatidylethanolamine regulates the function and the structure of LmrP, a bacterial multidrug transporter protein associated to antibiotic resistanceHakizimana, Pierre 05 September 2008 (has links)
The multidrug transporter LmrP, member of the major facilitator superfamily (MFS), confers L. lactis and recombinant E. coli cells resistance to an array of cytotoxic compounds including antibiotics. LmrP mediates drug extrusion from the plasma membrane by an electrogenic proton/drug exchange reaction, whereby a positively charged substrate may move towards the external medium in exchange for two or more protons moving towards the cytoplasm. Recent studies have suggested that MFS transporters require phosphatidylethanolamine (PE) for function and proper topology. However, the specificity of the PE requirement, as well as the contribution of the electrochemical gradient (the driving force of the substrate transport) to this lipid requirement was not addressed. Here we report a new approach for addressing PE specific requirement for the function and the structure of membranes transporters. We used methyl-PE and dimethyl-PE analogs of PE to show that only replacement of the three hydrogens by methyl moieties leads to changes in the biochemical and biophysical properties of the reconstituted protein. This suggests that LmrP does not depend on the bulk properties of the phospholipids tested but solely on the hydrogen bonding ability of the headgroup. We then show that a single point mutation in LmrP, D68C, is sufficient to recapitulate precisely every biochemical and biophysical effect observed when PE is replaced by phosphatidylcholine (PC) ( including energy transfer between the protein tryptophan residues and the lipid headgroups). We conclude that the negatively charged Asp-68 is likely to participate in the interaction with PE and that such interaction is required for proton gradient sensing, substrate binding, and transport. Because Asp-68 belongs to a highly conserved motif in the Major Facilitator Superfamily (which includes LacY and EmrD), this interaction might be a general feature of these transporters that is involved in proton gradient sensing and lipid dependence.
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Etude in silico des gouttelettes lipidiques et de leur interaction avec des protéines périphériques via des hélices amphipathiques / In silico study of lipid droplet and their interaction with peripheral proteins through anphipathic helicesBacle, Amélie 29 November 2016 (has links)
Les gouttelettes lipidiques (GL) sont des organites intracellulaire qui jouent un rôle central dans le métabolisme des lipides. Elles sont également impliquées dans des maladies telles que l'obésité ou le diabète. Les GL ont une structure unique : une monocouche de phospholipides (PL) qui entoure un cœur de lipide neutre composé de triglycérides (TAG) et d'esters de cholestérol (CE). Certaines protéines sont recrutées sur les GL mais également à la surface d'autres organites, alors que d'autres protéines ciblent spécifiquement la surface des GL. Il a été montré que quelques une de ces protéines seraient sensibles à une haute tension de surface, soit une augmentation de l'aire par lipide, dans des GL reconstituées. Comment les propriétés de surface d'une GL diffèrent d'une membrane ? Comment la surface d'une GL répond à l'augmentation de la tension de surface ?Comment les protéines interagissent avec la surface des GL ? Nous avons réalisé des simulations de dynamique moléculaire atome-unifié de système tricouche qui mime la surface d'une GL afin de caractériser les propriétés de surface de cet organite. Plusieurs simulations ont été effectuées à différentes tension de surface en augmentant l'aire par lipide. Les propriétés de surface ont été caractérisées en terme de défauts de \textit{packing} (i.e. vides interfaciaux à l'interface membrane/eau). Aucune différence n'a été observé avec une bicouche à l'équilibre. Cependant, la tension de surface promeut l'insertion de lipides neutres dans la monocouche et augmente significativement les défauts de \textit{packing}. Des simulations préliminaires sur l'interaction d'une protéine modèle, la périlipine 4, qui se lie aux GLs \textit{in vivo} via une longue hélice amphipathique 11/3 ont été faites. Les premiers résultats montrent que la protéine adopte une structure plus flexible dans une interface huile/eau que dans une interface membrane/eau. Des essais de dimérisation montrent que la répartition des résidus chargés serait importante pour le processus d'oligomérisation. Pris globalement, ces résultats apportent une compréhension moléculaire quantitative sur l'effet de la tension de surface sur la monocouche de GL et des résultats préliminaires sur l'interaction protéine/GL. Notre travail constitue une première étape vers la description du comportement et de la structure des propriétés de surface des GL et peut être utile à la compréhension du ciblage protéique vers la surface de GL. / Lipid droplets (LD) are intracellular organelles that have a central role in lipid metabolism andimplication in diseases such as obesity and diabetes. LDs have a unique architecture: aphospholipid (PL) monolayer that surrounds a neutral lipid core composed of triacylglycerols (TAG)and cholesteryl esters (CE). Some proteins are recruited both to LDs and to other cellularorganelles, whereas others are targeted specifically to the surface of LDs. It has been shown thatsome of these proteins could be sensitive to a high surface tension (ST), increase in the area perlipid, in reconstituted LD. How do surface properties differ between a membrane and an LD? Howdoes the LD surface respond to an increase in ST? How do proteins interact with LDs? Weperformed united-atom molecular dynamics simulations on trilayer systems that mimic the LDsurface to investigate the surface properties of this organelle. Several simulations were performedat different ST by increasing the area per lipid. Surface properties were characterized in terms ofpacking defects (i.e interfacial voids at the membrane-water interface). No difference was observedwith a bilayer at equilibrium. However, high ST promoted the insertion of neutral lipids into themonolayer and a significant increase of packing defects. Preliminary simulations has been done oninteraction of a model protein called perilipin 4, which binds to LDs \textit{in vivo} using a long 11/3amphipathic helix. The first results show that the protein adopts a more flexible conformation on oilwaterinterface than in bilayer-water interface. Attempts of dimerisation show that the localization ofthe charged residues may be involved in the oligomerisation process. Taken together, our resultsprovide a quantitative molecular understanding of how ST affects the LD surface and preliminaryresults on protein-LD interaction. Our work constitutes a first step towards characterizing thebehavior and structure of LD surface properties and will be useful for a better understanding onhow some specific proteins are targeted to LD.
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Interaction dystrophine-membrane : structure 3D de fragments de la dystrophine en présence de phospholipides / Dystrophin-membrane interaction : 3D structure of dystrophin fragments in the presence of phospholipidsDos Santos Morais, Raphael 27 October 2017 (has links)
La dystrophine est une grande protéine membranaire périphérique qui assure un rôle de soutien du sarcolemme permettant aux cellules musculaires de résister aux stress mécaniques engendrés lors des processus de contraction/élongation. Des mutations génétiques conduisent à sa production sous forme tronquée voire à un déficit total en protéine engendrant de sévères myopathies actuellement incurables. Concevoir des thérapies adaptées passe par une meilleure compréhension du rôle biologique de la dystrophine. Par une approche structure/fonction, notre objectif est de déterminer les bases moléculaires impliquées dans les interactions de la dystrophine avec les lipides membranaires du sarcolemme. Grâce à une approche de diffusion aux petits angles (SAXS et SANS) combinée à de la modélisation moléculaire, nous montrons dans un premier temps que les bicelles constituent un modèle expérimental particulièrement adapté aux analyses de structures de protéines qui y sont associées. Ce développement méthodologique original a été exploité dans un deuxième temps pour caractériser les modifications structurales subies par la dystrophine lorsqu’elle interagit avec les lipides. Nous montrons particulièrement que la liaison aux lipides induit l’ouverture significative de la structure en triple hélice « coiled-coil » de la répétiton 1 du domaine central, et proposons en conclusion un modèle tout atome de la protéine en présence de bicelles. Ces travaux de thèse (i) constituent un apport méthodologique significatif pour l’étude de protéines membranaires, (ii) contribuent à une meilleure compréhension du rôle biologique de la dystrophine en vue de thérapies dédiées aux patients atteints de myopathies. / Dystrophin is a large peripheral membrane protein that provides a supporting role for sarcolemma allowing muscle cells to withstand the mechanical stresses generated during contraction / elongation processes. Genetic mutations lead to dystrophin production in truncated form or even to a total deficit in the protein leading to severe myopathies currently incurable. Designing adapted therapies requires a huge knowledge of the biological role of dystrophin. Using a structure / function approach, our aim is to determine the molecular bases involved in the interactions of dystrophin with the membrane lipids of the sarcolemma. Using a small-angle scattering approach (SAXS and SANS) combined with molecular modeling, we show that bicelles constitute a versatile membrane mimic that is particularly adapted to analyze the structure of membrane proteins. This original methodological development was exploited to characterize the structural changes undergone by dystrophin upon lipid binding. We highlight in particular that the lipid binding induces a significant opening of the coiled-coil structure of the repeat 1 of the central domain and, in conclusion, we propose an all-atom model of the protein bound to a bicelle. These thesis works (i) constitute a significant methodological contribution for the study of membrane proteins, (ii) contribute to a better understanding of the biological role of dystrophin for therapies dedicated to patients with myopathies.
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Dynamique et mécanique de complexes dystrophine-actine-lipides membranaires / Dynamics et mecanics of dystrophin complexes with actin and mambrane lipidsMias-Lucquin, Dominique 24 September 2018 (has links)
La dystrophine est une protéine filamenteuse qui contribue à la structuration des cellules musculaires en créant un lien entre le cytosquelette et le sarcolemme. Avec l’actine du cytosquelette et les lipides membranaires, la dystrophine représente l’un des éléments d’un complexe macromoléculaire, localisé sous la membrane plasmique, dont le rôle est la prévention des dommages qui pourraient être induits à force de contractions-relâchements répétés. De tels dommages, notamment des ruptures du sarcolemme, sont observés chez des personnes atteintes de myopathies de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD), des maladies causées par des mutations qui altèrent l’expression ou la fonction de la dystrophine. Ces myopathies sont actuellement incurables et une connaissance approfondie de la relation structure-fonction de la dystrophine et de ses interactions avec ses partenaires s’avère absolument nécessaire à la mise au point de nouvelles stratégies de thérapies géniques. Cette protéine se compose de quatre domaines fonctionnels, dont un domaine central filamentaire, constitué de 24 répétitions successives d’un même motif structural, un faisceau de trois hélices alpha ou « coiled-coil ». Or, il a été récemment montré que la structure de ce domaine central n’est pas strictement linéaire et que certaines régions inter-répétitions (linker) forment des coudes, délimitant ainsi des sous-domaines d’interaction spécifiques. Cette thèse a pour objectif de comprendre l’origine de cette diversité de conformations inter-répétition dans un domaine structuralement homogène, et d’explorer comment elle permet à certaines régions de se différencier afin d’interagir avec l’actine et/ou les lipides membranaires. / Dystrophin is a filamentous protein involved in muscular cells structure which links the cytoskeleton to the sarcolemma. Together with cytoskeletal actin and membrane lipids, dystrophin is a part of a macromolecular complex, located under the sarcolemma, which prevents damages induced during repeated muscle contractions and relaxations. Such damages, including sarcolemma disruption, are found in people with Duchenne muscular dystrophy (DMD) and Becker muscular dystrophy (BMD), diseases caused by mutations altering dystrophin expression or function. There is currently no treatment to cure these myopathies, and a deep understanding of the structure-function of the dystrophin and its interactions with its partners is necessary to the development of gene therapy strategies. Structuraly, this protein is composed of four functionnal domains, including a long filamentous central domain, composed of 24 successive coiled-coil repeats. It was recently showed that the central domain is not rod shaped and some inter-repeats regions (linker) are kinked, delimiting specific interaction sub-domains. This thesis aims to bring knowledge about the basis of the conformationnal diversity of linkers in a structuraly homogenous domain in human dystrophin. We explore how dystrophin delimits some regions that interact with f-actin and/or membrane lipids.
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Design and Synthesis of Metabolically Stabilized Lipid Probes for the Investigation of Protein–Lipid Binding InteractionsRajpal, Ashdeep Kaur 01 May 2011 (has links)
Protein–lipid binding interactions play crucial roles in various physiological and pathological processes, making it very important to study these interactions at the molecular level. However, investigation of these interactions is complicated by several issues, including the inherent complexity of membranes as well as the diverse mechanisms by which proteins interact with the membrane surfaces. As a result, many of these interactions remain poorly characterized. Synthetic probes are useful tools employed for studying protein–lipid binding interactions. This thesis will detail the design and synthesis of metabolically stabilized analogues of various signaling lipids, which mimic the natural species and are not easily modified by enzymes present in biological systems. A modular approach is employed for synthesizing these lipid probes, giving access to a wide range of derivatized lipid probes that can then be used for several studies. Although a wide variety of metabolically stabilized lipid analogues have been synthesized, their activity has not yet been characterized and quantified in detail. So, there is a great need to synthesize biologically active phosphorothioate and phosphonate analogues of various signaling lipids in order to properly characterize and compare the binding affinities and activity of these analogues. Synthesis of metabolically stabilized lipid analogue would take us one step closer towards understanding protein–lipid interactions in biological systems and in trying to find answers to the myriad of questions pertaining to these systems.
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Structural characterisation of highly specific membrane protein-lipid interactions involved in cellular function / Caractérisation structurale d'une interaction protéine-lipide hautement spécifiqueKemayo Koumkoua, Patricia 30 September 2015 (has links)
Les membranes cellulaires sont des systèmes complexes composés de lipides variés qui interagissent avec les protéines pour accomplir une fonction. Leur adressage spécifique dans la cellule est crucial pour le fonctionnement cellulaire. Les vésicules COP (coat protein) sont impliquées dans leur transport dans les premières étapes de la voie de sécrétion. Récemment, une interaction très spécifique a été identifiée entre le domaine transmembranaire de la protéine p24 (p24TMD) abondante dans la membrane des vésicules COP et la sphingomyéline C18:0. Cette spécificité a été identifiée dans le cas d’interaction protéine-protéine et protéine-acide nucléique comme impliquée dans la régulation de fonctions cellulaires, C’est pourquoi nous avons décidé d'étudier sur cette interaction. A cet effet, le p24TMD a été obtenu par synthèse chimique et sa structure étudiée par RMN du solide en présence de la sphingomyèline avec pour but ultime de comprendre la fonction. / Cell membranes are complex systems composed of variety of lipids that interacts with proteins to trigger cellular function. The delivery of these lipids to the right compartment is crucial for cells to work efficiently. The coat protein (COP) complex vesicles are involved in lipids traffic in the early stages of the secretory pathway. Recently, a highly specific interaction has been found between the transmembrane domain of p24 protein (p24TMD) abundant in COPI membrane and sphingomyelin C18:0. As such highly specific interaction have been reported for protein-protein and protein-nucleic acid interactions to be involved in regulation of cell functions, we decide to investigate this specific interaction. The p24TMD was obtained chemically and investigated by solid state NMR in presence of sphingomyelin with the ultimately goal to understand the function behind.
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Identifizierung von geeigneten equinen Seren zur Zellkultivierung durch massenspektrometrische Bestimmung von Lipid-BiomarkernDitz, Timo 11 February 2022 (has links)
Bei der Zellkultivierung wird dem artifiziell hergestellten Grundmedium meist tierisches Serum hinzugefügt, um ein adäquates Wachstum der Zellen zu gewährleisten. So liefert das Serum zusätzliche Nährstoffe, essenzielle Wachstumsfaktoren und eine Vielzahl weiterer Moleküle. Die Seren werden kommerziell aus tierischem Vollblut hergestellt und normalerweise vor ihrer Auslieferung auf bestimmte Parameter, wie zum Beispiel Aminosäure-Gehalt und Albumin-Konzentration, getestet. Trotz dieser Testung seitens der vertreibenden Unternehmen bestehen große Qualitätsunterschiede bei den Zellkulturanwendungen. Somit sind Forschungslabore häufig gezwungen Probeseren anzufordern und diese in eigenen zeitaufwendigen und kostenintensiven Zellkulturversuchen zu testen, bevor ein Serum ausgewählt und in den eigentlichen Versuchen eingesetzt werden kann. Auch die serumvertreibenden Unternehmen müssen demzufolge alle Serumchargen bis zum Abschluss der Testversuche in ausreichenden Mengen bereithalten, was einen bedeutenden Mehraufwand darstellt.
Aus diesen Gründen wäre es eine entscheidende Vereinfachung, wenn ein geeigneter Biomarker zur Testung der Serumtauglichkeit gefunden werden könnte, der diese aufwendigen Vorversuche ersetzt. Ein potenzieller Biomarker könnte das Glycerophospholipid Lysophosphatidylcholin (LPC) sein. Seine stressbedingte Bildung, vorrangig aus Phosphatidylcholin (PC), im Rahmen von Entzündungen, oxidativem Stress oder ungünstigen Lagerungsbedingungen könnte als Indikator für qualitätsmindernde Prozesse im Serum dienen. Des Weiteren könnte das vermehrte LPC selbst einen entscheidenden Einfluss auf das Wachstum von Zellen haben und somit die Qualität der Seren widerspiegeln.
Die Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) eignet sich aufgrund ihrer Robustheit gegenüber Verunreinigungen und der hohen Messgeschwindigkeit für die Detektion beider Moleküle in biologischen Materialen. Zur weiteren Vereinfachung der Bestimmung der LPC-Konzentration mittels MALDI-TOF MS wird oft auf den Zusatz eines internen Standards verzichtet, um zusätzliche Fehlerquellen zu vermeiden. Hierbei wird LPC ausschließlich relativ zur PC-Konzentration ermittelt (PC/LPC-Verhältnis).
Da es sich bei Serum um eine komplexe, biologische Probe handelt, könnten Molekülinteraktionen wie beispielsweise Protein-Lipid-Interaktionen Grund für unterschiedliche PC/LPC-Verhältnisse sein. Albumin als ubiquitär im Serum vorhandenes Protein kann eine Vielzahl von Molekülen binden, darunter auch bestimmte Lysophospholipide. Somit ist es wichtig zu klären, inwieweit Albumin eine adäquate Detektion von Lysophosphatidylcholin verhindern beziehungsweise beeinflussen kann.
Die hier publizierte Arbeit konnte zeigen, dass Albumin-Zusatz (von Pferd und Rind) zu einem Anstieg des detektierten PC/LPC-Verhältnisses im „intakten“ Serum führt. Umgekehrt sinkt das PC/LPC-Verhältnis beim enzymatischen Verdau des Albumins wieder, weil nun mehr LPC detektiert werden kann. Der Einfluss von Pepsin und Trypsin, die durch den enzymatischen Verdau des Albumins zu einer verbesserten LPC-Detektion führen, wurde unter verschiedenen Bedingungen (Konzentration, Inkubationszeit, Temperatur) verglichen. Abschließend wurde ein verbessertes Protokoll für die MALDI-TOF MS-Messungen des PC/LPC-Verhältnisses im „intakten“ Serum durch einen vorausgehenden Pepsin-Verdau vorgeschlagen. Dabei muss vor allem darauf geachtet werden, möglichst niedrige Temperaturen zu verwenden, um die temperaturbedingte Konversion von PC zu LPC zu minimieren.
Sowohl das ursprüngliche als auch das erweiterte Messprotokoll fand im zweiten Teil der Arbeit Anwendung. Hier wurde die aufwendige konventionelle Qualitätstestung von Pferdeseren mittels Zellkultur mit der massenspektrometrischen Messung von LPC als Biomarker verglichen, um eine etwaige Vereinfachung der Serumselektion zu evaluieren. Die verwendeten FDCPmix-Zellen sind murine hämatopoetische Vorläuferzellen, die beispielsweise zur Untersuchung der hämatopoetischen Stammzellnische verwendet werden. Ähnlich wie die hämatopoetischen Stammzellen selbst, stellen die FDCPmix-Zellen hohe Anforderungen an die Zellkulturbedingungen. Wird inadäquates Medium bzw. Serum verwendet, können Wachstum und Differenzierungspotential negativ beeinflusst werden, wodurch die Zellen nicht mehr für weitere Versuche geeignet sind. Folglich ist die achtsame Auswahl des Pferdeserums essenziell. Acht Pferdeseren von verschiedenen Anbietern wurden zur Kultivierung nach derzeitigem Goldstandard eingesetzt. Als Evaluationsparameter für die Qualität des jeweiligen Serums wurden Zellwachstum, Differenzierungspotenzial nach Kultivierung und die Fähigkeit Zellkolonien im semifesten Medium (colony forming units - CFUs) zu bilden, verwendet. Hierbei zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Seren. Insbesondere in der Fähigkeit CFUs auszubilden und im Wachstum waren die größten Unterschiede zu erkennen. Diese Zellkultur-Ergebnisse wurden mit MALDI-TOF MS-Messungen des PC/LPC-Verhältnisses vor und nach Pepsinverdau im „intakten“ Serum verglichen. Jedoch korrelierte das PC/LPC-Verhältnis nicht mit den Ergebnissen der Zellkulturexperimente. Dies ist mit den Unterschieden in der PC-Konzentration zwischen den verschiedenen Seren zu erklären. Enthält ein Serum generell viel PC, so kann trotz eines hohen PC/LPC-Verhältnisses die LPC-Konzentration im Serum zu hoch sein und die Zellkultivierung negativ beeinflussen. Deshalb wurde LPC mit Hilfe eines internen Standards quantifiziert. Bei den für die Kultivierung ungeeigneten Seren lag, sowohl vor als auch nach Proteinverdau, eine hohe LPC-Konzentration vor. Umgekehrt konnten die Pferdeseren mit geringen LPC-Konzentrationen mit günstigen Zellkultur-Ergebnissen assoziiert werden. Dieser negative Einfluss einer hohen LPC-Konzentration konnte durch die artifizielle Zugabe von LPC zur Zellkultur weiter bestätigt werden. Im Gegensatz zum nicht manipulierten Kontrollmedium zeigten die Proben mit artifiziell erhöhter LPC-Konzentration vor allem eine deutlich geringere Fähigkeit CFUs auszubilden, welches ein Kernkriterium für die Verwendbarkeit des Serums ist. Insgesamt konnte folglich der negative Einfluss von LPC auf die Zellkultur gezeigt werden, was seine Eignung als Indikator für die Serumqualität bestätigt.
Zusätzlich zur LPC-Konzentration wurden weitere Mediator- und Signalmoleküle untersucht, die im Zuge des PC/LPC-Stoffwechsels entstehen können und unter anderem Entzündungsprozesse beeinflussen. Bei der Konversion von PC zu LPC durch die Phospholipase A2 oder durch oxidativen Stress wird die Fettsäure (z.B. Arachidonsäure oder Linolsäure) an der sn-2-Position vom Glycerolrückgrat freigesetzt und steht zur weiteren Metabolisierung durch beispielsweise Cyclooxygenasen oder Lipoxygenasen zur Verfügung. Hierbei können Eikosanoide wie Thromboxane, Prostaglandine oder Leukotriene entstehen. Daher wurden die Pferdeseren weiterhin auf Eikosanoide mittels Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS getestet. Hierbei zeigte sich, dass erhöhte Thromboxan B1-, Thromboxan B2- und 12-S-Hydroxy-Heptadecatriensäure-Konzentrationen ebenfalls auf eine ungünstige Serumqualität hinweisen. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Seren mit hohen LPC-Konzentrationen und daher schlechten Zellkultur-Ergebnissen ebenfalls hohe Konzentrationen an Linolsäure aufweisen. Diese Fettsäure wird typischerweise bei der Konversion von im Pferdeserum vorkommenden PC zu LPC aus der sn-2-Position freigesetzt. Somit scheint neben der LPC-Konzentration auch das Eikosanoidprofil qualitative Aussagen über das jeweilige Pferdeserum zu erlauben.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl niedrige absolute LPC- als auch niedrige entzündungsfördernde Eikosanoid-Level mit einer günstigen Serumqualität korrelieren. Jedoch benötigt die Bestimmung des Eikosanoidprofils im Gegensatz zur LPC-Bestimmung anspruchsvollere Messmethoden wie LC-MS/MS. Die LPC-Konzentration kann mittels MALDI-TOF MS zuverlässig ermittelt werden. Diese robuste, schnelle und preiswerte Methode ermöglicht die direkte Messung im „intakten“ Serum. Dabei ist die Zugabe eines internen Standards zur Bestimmung der absoluten LPC-Konzentration notwendig, da sich das PC/LPC-Verhältnis als ungeeignet für die Qualitätsevaluation von Zellkulturseren erwiesen hat.:Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
1 Einführung
1.1 Allgemeine Einleitung
1.2 Factor dependent cells Paterson mixed potential (FDCPmix-Zelllinie)
1.3 Phosphatidylcholin und Lysophosphatidylcholin
1.4 Eikosanoide
1.5 Massenspektrometrie
1.5.1 MALDI-TOF Massenspektrometrie
1.5.2 ESI-IT Massenspektrometrie
1.6 Ziele der Dissertation
2 Publikationsmanuskripte
2.1 Determination of the Phosphatidylcholine/Lysophosphatidylcholine Ratio in Intact Serum by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry with Prior Enzymatic Albumin Digestion
2.2 Phospholipase A2 products predict the hematopoietic support capacity of horse serum
3 Zusammenfassung der Arbeit
4 Literaturverzeichnis
5 Nachweis über Anteile der Co-Autoren
6 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
7 Lebenslauf
8 Publikationen
9 Danksagung
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Der Einfluss des Cholesterolgehaltes der Diskmembranen des Stäbchenaußensegmentes auf die ersten Schritte der visuellen SignaltransduktionWaterstradt, Katja 17 July 2009 (has links)
Das Außensegment der Stäbchenzelle ist aus einem Stapel von flachen Membransäckchen, den Diskmembranen, aufgebaut. Entlang dessen existiert ein Cholesterolgradient mit 24 mol% Cholesterol in den basalen Diskmembranen und 5 mol% in den apikalen. Das Außensegment enthält alle Proteine der Signaltransduktion. Der Photorezeptor Rhodopsin ist als integrales Membranprotein in die Diskmembran eingebettet. Das G-Protein Transducin und das Effektorprotein, die Phosphodiesterase (PDE), sind periphere Proteine mit Lipidankern und somit reversibel mit der Membranoberfläche assoziiert. Um den Einfluss des Cholesterolgehaltes der Diskmembranen auf diese drei Proteine zu untersuchen, wurden Diskmembranen mit unterschiedlichem Cholesterolgehalt präpariert (Simulation des Cholesterolgradienten). Die Untersuchungen zur transversalen Verteilung des Cholesterols in der Diskmembran ergaben eine schnelle Transmembranbewegung mit einer Halbwertzeit von weniger als einer Minute bei 35 °C. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass es zu kopfgruppenspezifischen Wechselwirkungen von Cholesterol mit dem Phospholipid Phosphatidylcholin kommt. Cholesterol verschiebt das Meta I-Meta II-Gleichgewicht (nach Lichtaktivierung von Rhodopsin) auf die Seite von Meta I (inaktiv). In dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass durch die Anwesenheit des Transducins das Gleichgewicht vollständig auf die Seite von Meta II (aktiv) verschoben wird, da Transducin spezifisch die Meta-II-Form stabilisiert. Somit kann die verminderte Meta II-Bildung des Rezeptors in Diskmembranen mit hohem Cholesterolgehalt durch Transducin ausgeglichen werden. Lediglich die Geschwindigkeit der Transducinaktivierung ist verlangsamt. Durch den erhöhten Cholesterolgehalt werden die Membraneigenschaften für eine Bindung der beiden peripheren Proteine Transducin und PDE über deren Lipidanker optimiert. Somit kann die Signaltransduktion auch in den basalen Diskmembranen des Stäbchenaußensegmentes stattfinden. / The rod outer segment consists of a stack of flat membrane saccules called disc membranes. Along this stack a cholesterol gradient exists with 24 mol% cholesterol in the basal and only 5 mol% in the apical disc membranes. The outer segment contains all the proteins necessary for signal transduction. The photoreceptor rhodopsin as integral membrane protein is embedded in the disc membrane. The G protein transducin and the effector protein phosphodiesterase (PDE) are soluble proteins with lipid modifications, which are associated reversibly to the membrane surface. Disc membranes with different cholesterol contents were prepared to simulate the cholesterol gradient along the rod outer segment and to investigate the influence of disc membrane cholesterol content of these three proteins. Investigations of the transversal distribution of cholesterol in the disc membrane revealed a fast transmembrane movement with a half life of less than one minute at 35 °C. Further, head group specific interactions between cholesterol and phosphatidylcholine could be shown. The Meta I Meta II equilibrium after light activation of rhodopsin was shifted to the Meta I (inactive) site in membranes with high cholesterol. In this work it was shown that in the presence of transducin this equilibrium is shifted completely to the Meta II (active) site because transducin stabilizes specifically the Meta II form of the receptor. Hence the reduced Meta II formation in disc membranes with high cholesterol could be compensated by transducin. The speed of transducin activation is decelerated. By the increased cholesterol content membrane properties are optimized to the binding of transducin and PDE via their lipid modifications. Thus the signal transduction can take place also in disc membranes with high cholesterol.
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