Research of protein-protein interactions produce vast quantities of data and there exists a large number of databases with data from this research. Many of these databases offers the data for download on the web in a number of different formats, many of them XML-based. With the arrival of these XML-based formats, and especially the standardized formats such as PSI-MI, SBML and BioPAX, there is a need for searching in data represented in XML. We wanted to investigate the capabilities of XML query tools when it comes to searching in this data. Due to the large datasets we concentrated on native XML database systems that in addition to search in XML data also offers storage and indexing specially suited for XML documents. A number of queries were tested on data exported from the databases IntAct and Reactome using the XQuery language. There were both simple and advanced queries performed. The simpler queries consisted of queries such as listing information on a specified protein or counting the number of reactions. One central issue with protein-protein interactions is to find pathways, i.e. series of interconnected chemical reactions between proteins. This problem involve graph searches and since we suspected that the complex queries it required would be slow we also developed a C++ program using a graph toolkit. The simpler queries were performed relatively fast. Pathway searches in the native XML databases took long time even for short searches while the C++ program achieved much faster pathway searches.

O estudo de processos de tradução do código genético em proteínas desperta o interesse pelo seu papel central no metabolismo celular, em particular, o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como a selenocisteína e a pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos 20 aminoácidos canônicos para um total de 22 aminoácidos. A selenocisteína (Sec, U) é um aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação ocorre através de um processo cotraducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase, usualmente interpretado como códon de parada. Essa incorporação requer uma complexa maquinaria molecular distinta entre os três domínios da vida em que as selenoproteínas estão presentes: Bactéria, Arquéia e Eucária. Em Escherichia coli, a via se inicia com a aminoacilação do tRNA específico para a incorporação de selenocisteínas (SelC, tRNASec) com um resíduo de L-serina pela seril-tRNA sintetase (SerRS) formando o tRNA carregado Ser-tRNA[Ser]Sec que é entregue ao complexo homodecamérico selenocisteína sintase (SelA) responsável pela conversão Ser-Sec utilizando a forma biológica de selênio entregue pela enzima selenofosfato sintetase (SelD). Uma vez carregado com L-selenocisteína, o Sec-tRNASec é então carreado pelo fator de elongação específico para selenocisteínas (SelB) para a sua incorporação na cadeia polipeptídica nascente na posição UGA adjunta ao elemento SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence), uma estrutura em grampo presente no RNA mensageiro que indica o códon de inserção de selenocisteínas. Uma vez que elementos contendo selênio são tóxicos para o ambiente celular, interações entre as enzimas da via se fazem necessárias, onde as enzimas participantes em procariotos são conhecidas e caracterizadas individualmente, no entanto, suas interações macromoleculares nas diferentes etapas ainda não foram caracterizadas. Este projeto visa à caracterização macromolecular e estrutural das interações entre as enzimas SelA e SelB com os RNAs participantes tRNASec e SECIS além do ribossomo de E. coli. Para isso, amostras de SelA, SelB, tRNASec, SECIS e ribossomo foram obtidas através de diferentes metodologias. Para SelA e tRNASec foram utilizados protocolos já estabelecidos enquanto que, para SelB, fez-se necessário a otimização do protocolo previamente publicado e, consequentemente, nova caracterização biofísica através de metodologias como dicroísmo dircular (CD) e fluorescência intrínseca (IFS). Para análise das interações, medidas de espectroscopia de anisotropia de fluorescência (FAS), ultracentrifugação analítica (AUC) e calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação dos parâmetros de interação dos diferentes complexos estudados. Somado a isso, experimentos de cinética GTPásica foram realizados na formação dos complexos e, além disso, foram gerados modelos estruturais utilizando diferentes metodologias como espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) além de estudos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação deste aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de elucidar o mecanismo sequencial de eventos, provendo conhecimento e desenvolvendo metodologias para sistemas complexos de interação proteína-proteína e proteína-RNA. / The study of genetic code processes in proteins is a central role in cell metabolism, in particular the study of the synthesis pathway of new amino acids, such as selenocysteine and pyrrolisine, which resulted in the expansion of the genetic code of the 20 canonical amino acids for 22 amino acids. Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents a major biological form of selenium element and its incorporation through a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA-codon, usually interpreted as stop-codon. This incorporation requires a complex molecular machinery distinct between the three domains of life in which, as selenoprotein has present: Bacteria, Archaea and Eukaria. In Escherichia coli, an initiation pathway with an aminoacylation of the tRNA specific for the incorporation of selenocysteines (SelC, tRNASec) with an L-serine residue by seril-tRNA synthetase (SerRS) resulting in the charged tRNA Ser-tRNA[Ser] Sec that is delivered to the homodecameric complex selenocysteine synthase (SelA), responsible for Ser-Sec conversion using the biological form of selenium delivered by the enzyme selenophosphate synthetase (SelD). Once loaded with L-selenocysteine, Sec-tRNASec is then carried by the selenocysteine-specific elongation factor (SelB) for incorporation into the nascent polypeptide chain at the UGA position attached to the SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence) element, staple structure that indicates the insertion codon of selenocysteines. Since elements containing selenium are toxic to the cell, interactions between how pathway enzymes are made, where the enzymes participating in concepts are known and characterized individually, however, their macromolecular interactions in the different steps have not yet been characterized. This project aims at the macromolecular and structural characterization of the interactions between SelA and SelB enzymes with the RNAS tRNASec and SECIS participants in addition to the E. coli ribosome. For this, as samples of SelA, SelB, tRNASec, SECIS and ribosome were obtained through different methodologies. For SelA and tRNASec, protocols were used to determine parameters for SelB, it was necessary to optimize a previously published protocol and, consequently, a new biophysical characterization through methodologies such as circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence spectroscopy (IFS). To analyze the interactions, measurements of fluorescence anisotropy spectroscopy (FAS), analytical ultracentrifugation (AUC) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to determine the interaction parameters of different complexes studied. In addition, GTPases activity experiments were carried out in the formation of the complexesand, in addition, we have generated models that characterize different methodologies such as small angles X-ray scattering (SAXS) and transmission electron microscopy (TEM). The proposed studies will aid in understanding the mechanism of incorporation of this amino acid into bacteria as well as the other domains of life besides elucidating the sequential mechanism of events, providing knowledge and development of methodologies for complex protein-protein and RNA-protein interaction systems.

A existência de uma maior variedade de aminoácidos codificados pelo código genético tem estimado estudos sobre os mecanismos de síntese, reconhecimento e incorporação desses resíduos nas cadeias polipeptídicas nascentes. Um exemplo é a via de incorporação de selenocisteína evento cotraducional dirigido pelo códon UGA. Em bactérias, essa via conta com uma complexa maquinaria molecular composta por: Selenocisteína Sintase (SelA), Fator de Elongação Específico de Reconhecimento (SelB), Selenofosfato Sintetase (SelD), tRNA específico (SelC ou tRNAsec), sequência específica no mRNA (Sequência de Inserção de Selenocisteínas - SECIS) e Aminoacil tRNA Sintetase (aaRS). Pelo fato do selênio ter uma toxicidade elevada em ambientes celulares, é fundamental a compreensão do mecanismo catalítico e razão estequiométrica na formação dos complexos da via na etapa de incorporação junto ao tRNAsec, bem como sua caracterização estrutural foram os objetivos deste trabalho. A proteína SelA foi expressa e purificada para utilização em análises envolvendo microscopia de força atômica, microscopia eletrônica de transmissão com contraste negativo e em gelo vítreo foram realizadas nos complexos SelA e SelA-tRNAsec, visando obter um modelo estrutural e a razão estequiométrica dos complexos. A fim de compreender o mecanismo de passagem do selênio, ensaios de anisotropia de fluorescência e de microcalorimetria, corroborados pelas análises de troca de hidrogênio-deutério acoplado a espectrometria de massa e espectroscopia de infravermelho, elucidaram a formação e estequiometria do complexo ternário SelAtRNA sec-SelD. Tentativas de cristalização e análises cristalográficas também foram realizadas, no entanto, sem sucesso. Com os resultados obtidos foi possível propor que o reconhecimento de SelD e, consequentemente, a entrega do selenofosfato, seja uma etapa crucial da via de incorporação de selenocisteínas. / The existence of a greate variety of amino acids encoded by the genetic code has stimulated the study of the mechanisms of synthesis, recognition and incorporation of these residues in the nascent polypeptide chains. An example of genetic code expansion is the selenocysteine incorporation pathway an event cotraducional by the UGA codon. In bacteria, this pathway has a complex molecular machinery comprised: Selenocysteine Synthase (SelA), Specific Elongation Factor (SelB), Selenophosphate Synthetase (SelD), tRNA-specific (SelC or tRNAsec), Specific mRNA Sequence (SElenocysteine Insertion Sequence - SECIS) and Aminoacyl tRNA Synthetase (aaRS). Because selenium has high toxicity in cellular environments; it is essential for cell survival the association of this compound with proteins, in this case, selenoprotens and the associated proteins involved in the selenocysteine synthesis. Therfore the understanding of the catalytic mechanism, stoichiometric ratio, protein complex formation with the tRNAsec, and its structural characterization were the objectives of this work. The SelA protein was expressed and purified to used in analyzes involving atomic force microscopy, transmission electron microscopy with negative stain and in vitreous ice were performed in the complex SelA and SelA-tRNAsec in order to obtain a structural model of the complex and the stoichiometric ratio of its components. To study the selenium association with protein of the synthesis pathway, fluorescence anisotropy assays and isothermal titration calorimetry corroborated by the analysis hydrogen-deuterium exchange coupled to mass spectrometry and infrared spectroscopy were employed.Crystallization attempts were made and preliminary crystallographic analyzes were also performed, however, so far unsuccessfuly. The results obtained were possible to develop the hypothesis about the SelD recognition and, consenquently, the selenophosphate delivery, a crucial stage of the selenocysteine incorporation pathway.

Orientador: Fabio Cesar Gozzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-13T13:49:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Iglesias_AmadeuHoshi_D.pdf: 8088319 bytes, checksum: 8f6da7c324d46a34a7ce5354e6670443 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A Espectrometria de Massas (MS) é hoje a principal técnica de caracterização de estrutura primária de proteínas devido às vantagens intrínsecas da técnica. As técnicas de cross-linking e footprinting visam desfrutar de tais vantagens para obtenção de informações estruturais de complexos protéicos. Nesse projeto foram realizados estudos de fragmentação de peptídeos contendo como cross-linker o DSS, reagente mais utilizado para esse propósito. Os mecanismos de fragmentação foram propostos baseados na dissociação de peptídeos modelos sintetizados para gerar espécies que mimetizassem experimentos com proteínas. Esses estudos permitiram a identificação de íons marcadores, que foram posteriormente utilizados em experimentos de Varredura de Íons Precursores para auxiliar na detecção de peptídeos modificados. Para realização dos experimentos de footprinting, foi desenvolvida uma linha de luz no LNLS. Posteriormente, foi proposto um novo método de quantificação de cinética de oxidação baseado nos dados de LC-MS, levando em consideração todos os produtos de oxidação formados. Esses métodos foram utilizados no estudo de interação das proteínas Tif34 e Tif35 do fator de iniciação de tradução de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos indicam que Tif34 apresenta dois possíveis sítios de interação para a proteína Tif35 / Abstract: Mass Spectrometry (MS) is the most important tool for analyses related to protein primary structure. Cross-Linking and footprinting aim to bring those advantages to gain insights in the spatial structure of protein complexes. In this work the fragmentation of peptides containing DSS, the most used cross-linker, was studied. Fragmentation mechanisms were proposed based on the dissociation of model peptides which were synthesized in order to generate species that would resemble species found in experiments with proteins. Diagnostic ions were identified which allowed the use of Precursor Ion Scan to detect those species. In order to perform footprinting experiments, a new beamline was developed at the LNLS. A new method for quantitation of oxidation kinetics was developed based on LC-MS analysis, which considers every single oxidation product that can be generated. Those methods were thereafter used in the study of the interaction between Tif34 and Tif35, proteins which compose a translation initiation factor of Saccharomyces cerevisiae. The results indicate that Tif34 presents two different sites for the interaction with Tif35 / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

As septinas compõem o quarto componente do citoesqueleto das células eucarióticas, atrás da actina, miosina e filamentos intermediários. São proteínas filamentosas que se arranjam em forma de fibras e anéis, desempenhando um papel estrutural na célula. Os seres humanos expressam 13 septinas, que são divididas em 4 grupos diferentes de acordo com sua estrutura primária: grupo I (SEPT3, SEPT9, SEPT12); grupo II (SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11, SEPT14); grupo III (SEPT1, SEPT2, SEPT4, SEPT5) e grupo IV (SEPT7), sendo que SEPT13 foi caracterizada como um pseudogene de SEPT7. O filamento fisiológico mais bem estudado é composto por SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9 (nesta exata sequência), e é usado como a base para a descrição da formação canônica, onde se acredita que septinas do mesmo grupo ocupam o mesmo lugar no filamento. Entretanto, ensaios de duplo-híbrido identificaram muitas interações não canônicas inesperadas entre septinas como SEPT9-SEPT6 e SEPT9-SEPT8, sugerindo estes também possam existir in vivo. Além destes, estudos mostraram a existência de interações entre septinas do grupo I e grupo II, e especialmente no caso SEPT11-SEPT12, a interação deixa de existir ao inserir uma mutação sítio-dirigida na interface G destas proteínas. O presente trabalho investiga a interação entre SEPT3, uma septina do grupo I, com todas aquelas do grupo II. Esta interação foi estudada por análises de coexpressão e copurificação em resina de afinidade ao cobalto, onde apenas a SEPT3 possuía uma extensão de seis histidinas em seu N-terminal. Esta primeira análise mostrou que SEPT3 não foi copurificada com todos os membros do grupo II dando uma clara evidência de variação de afinidade dentro do grupo. Usando esta abordagem, SEPT6, SEPT10 e SEPT14 não mostraram interação com SEPT3, enquanto SEPT8 e SEPT11 copurificaram com SEPT3, mas não em concentrações estequiométricas. Para os complexos SEPT3-SEPT8 e SEPT3-SEPT11, uma segunda etapa de purificação foi realizada por meio de cromatografia de exclusão molecular, onde um pico de grande variância em relação à média indicou um valor de massa molecular entre monômeros e dímeros. Os mesmos, quando avaliados por espalhamento de luz a múltiplos ângulos mostraram variação na massa molecular ao longo do pico de eluição conforme ele era eluído. Tal variação era compatível com a eluição de dímeros no início até monômeros no final. Os estudos da interação entre SEPT3-SEPT8 por ultracentrifugação analítica indicou uma tendência de associação em altas concentrações das proteínas, compatível com a constante de dissociação determinada por termoforese em microescala, na ordem de dezenas de micromolar. Tais resultados levantaram questões acerca da relevância fisiológica destes complexos e reforçam a importância de um estudo mais aprofundado na formação dos complexos não canônicos de septinas para o desenvolvimento celular. / The septins are accepted to be the fourth cytoskeleton component of the eukaryotic cells, after actin, myosin and intermediate filaments. They are filament forming proteins that are organized in fibers and rings, having a structural role in the cell. Humans express 13 septins, which are divided into 4 different groups according to their primary structure: group I (SEPT3, SEPT9, SEPT12); group II (SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11, SEPT14); group III (SEPT1, SEPT2, SEPT4, SEPT5) e group IV (SEPT7). SEPT13 was later characterized as a SEPT7 pseudogene. The best characterized filament is built up from SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9 (in this exact sequence), and is used as a basis for the description of the so-called canonical arrangement, which accepts that septins from the same group can occupy the same position within the filament. However yeast two-hybrid assays identified several unexpected interactions such as SEPT9-SEPT6 and SEPT9-SEPT8, raising the possibility that these could also exist in vivo. Furthermore, studies have shown the existence of interactions between group I and group II, and especially in the SEPT11-SEPT12, the interaction dissolves when a mutation in the G interface is inserted. The present work investigates the interaction between SEPT3, a group I septin, with all of those from group II. This interaction was studied through co-expression and co-purification methods using metal affinity chromatography, where only the SEPT3 contained the six histidines extention. This initial analysis showed that SEPT3 did not co-purify with all group II members, clearly pointing to variability in the affinity within group. Using this approach SEPT6, SEPT10 e SEPT14 showed no interaction with SEPT3, whilst SEPT8 and SEPT11 co-purified with SEPT3, but not in stoichiometric concentrations. For the SEPT3-SEPT8 and SEPT3-SEPT11 complexes, a second purification stage was performed using size exclusion chromatography, where a broad peak was observed corresponding to a molecular mass value which was intermediate between a dimer and a monomer. The same complexes, when evaluated by multiple angle light scattering revealed a variation in the molecular mass across the peak as it eluted. Such variation was compatible with elution of dimers at the beginning and monomers at the end. Studies for the SEPT3-SEPT8 interaction via analytical ultracentrifugation suggested a trend to associate in high protein concentration, consistent with the dissociation constant found by microscale thermophoresis, which was of the order of ten micromolar. The results raise questions concerning the physiological relevance of these complexes and reinforce the importance of further studies on the non-canonical assembly of septin complexes for cellular development.

As metaloproteases AAA/FtsH são componentes chave do controle da qualidade das proteínas inseridas nas membranas de mitocôndrias e cloroplastos. Em Arabidopsis thaliana, as proteases FtsH presentes nas membranas dos tilacóides formam um complexo heterohexamérico composto pelas subunidades FtsH1/FtsH5 (tipo A) e FtsH2/FtsH8 (tipo B). Este complexo está envolvido na reciclagem de proteínas foto-danificadas, especialmente da proteína D1, centro de reação do PSII. Algumas linhas de evidências indicam ainda que existe um limiar de concentração das proteases FtsH, necessário para a correta formação e desenvolvimento dos cloroplastos. Apesar da extensiva caracterização genética e molecular das proteases FtsH, o mecanismo regulatório do complexo FtsH dos cloroplastos não foi totalmente elucidado até o momento, contudo existem evidências de que a sua ativação pode estar relacionada a alta incidência luminosa e a outras condições de estresse. A presença de fatores proteicos auxiliares, foi testada como hipótese alternativa por nosso grupo, através do uso da protease FtsH5 como isca em um ensaio de duplo híbrido de leveduras. Este ensaio identificou uma proteína interagente putativa, nomeada FIP (FtsH5 Interacting Protein), a qual comprovadamente interage com FtsH5 e está localizada nas membranas dos tilacóides. De modo a investigar o papel regulatório putativo de FIP sobre a atividade do complexo FtsH, nós analisamos os padrões de expressão em uma ampla gama de condições de estresse a partir de dados públicos de microarranjos de DNA. Os perfis de expressão indicam que FIP pode ser um regulador negativo da atividade do complexo. Os resultados também sugerem que o complexo pode estar envolvido na resposta do cloroplasto a diferentes tipos de condições de estresse. O estudo da história evolutiva das proteínas interagentes FtsH5 e FIP evidenciou que as sequências homólogas a FIP são encontradas exclusivamente em musgos e plantas superiores, sugerindo assim que a origem de FIP pode estar relacionada a colonização terrestre. Todos os genes codificantes das proteases FtsH do complexo foram usados como \"query\" na busca por sequências homólogas, permitindo a classificação das proteases FtsH nos tipos A e B por inferência filogenética Bayesiana. Análises filogenéticas Bayesianas também foram feitas para FIP e as proteases FtsH tipos A e B, independentemente. A análise Mirrortree suportou a existência de coevolução entre FIP e as proteases FtsH tipo A. Por outro lado, nenhuma correlação foi encontrada entre FIP e as proteases FtsH tipo B, o que corrobora nossas observações experimentais anteriores. Além disso, o agrupamento portador de homólogos FIP pôde ser recuperado em uma filogenia mais completa das proteases FtsH do tipo A. Análises subsequentes mostraram que ambas as proteínas interagentes estão extensivamente sobre seleção negativa e que proteases FtsH tipo A são bastante conservadas, principalmente nos seus domínios internos. / Eukaryotic AAA/FtsH metalloproteases display a key role in the protein quality control of membrane-inserted proteins in mitochondria and chloroplasts. In Arabidopsis thaliana, chloroplast thylakoidal membranes FtsH proteases form a heterohexameric complex made by FtsH1/FtsH5 (type A) and FtsH2/FtsH8 (type B) subunits. This complex is involved in protein turnover of photo-damaged proteins, in particular the D1 protein at the PSII reaction center. Several lines of evidence also indicate that a FtsH threshold level is necessary for the proper formation and development of chloroplasts. Despite extensive genetic and molecular characterization of the FtsH proteases, the regulatory mechanism of the FtsH complex in chloroplasts has not yet been fully elucidated, however, there are evidences that its activation might be related to high light incidence and other stress conditions. The presence of auxiliary protein factors, as an alternative hypothesis, was tested by our group, through the use of the protease FtsH5 as bait in a yeast two-hybrid assay. This essay identified a putative interacting protein named FIP (FtsH5 Interacting Protein), which has been proved to interact with FtsH5 and be located at the thylakoid membranes. In order to investigate a putative regulatory role of FIP on FtsH complex activity, we analyzed gene expression patterns in a wide range of stress conditions from public DNA microarray data. The expression profiles indicate that FIP could be a negative regulator of the FtsH complex activity. The results also suggest that the complex may be involved in the chloroplast response to different types of stress conditions. In order to shed some light on the evolutionary history of FtsH5 and FIP interacting proteins, we have shown that FIP\'s homologous sequences were exclusively found in mosses and higher plants, suggesting that FIP origin might be related to the plant terrestrial colonization. All Arabidopsis FtsH complex-encoding genes were used as \"query\" sequences in search for homologous sequences, allowing us to classify the FtsH proteases in type A and B by Bayesian phylogenetic inference. Bayesian phylogenetic analyses were also run for FIP and FtsH types A and B proteases, independently. Mirrortree analysis supported coevolution between FIP and type A FtsH proteases. On the other hand, no correlation was found between FIP and type B FtsH homologues, which support our previous experimental observations. In addition, the FIP bearing cluster could be recovered in a more complete type A FtsH phylogeny. Subsequent analyzes have shown that both interacting proteins are extensively under negative selection and that type A FtsH are very conserved, mainly in its inner domains.

Orientadores: Everson Alves Miranda, Pedro de Alcântara Pessôa Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-24T01:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hirata_GiseleAtsukoMedeiros_D.pdf: 4140620 bytes, checksum: 01025f5b18791e6b6698c34eea1dcda4 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O segundo coeficiente virial osmótico, B22, tem sido considerado um preditor para o processo de cristalização. Uma faixa relativamente estreita de valores negativos de B22, -1x10-4 a -8x10-4 mL.mol/g2, é ideal à formação de cristais de acordo com George e Wilson (1994). Essa faixa de valores de B22 é denominada de "janela de cristalização", sendo utilizada para classificar condições adequadas de solvente à formação de cristais. Para valores maiores que -1x10-4 mL.mol/g2, a interação proteína-proteína não é suficientemente forte para a cristalização e nenhuma fase sólida é formada, enquanto para valores menores que -8x10-4 mL.mol/g2, as interações proteína-proteína são muito intensas e precipitados amorfos são formados. Dessa forma, os valores de B22 se tornaram um critério de seleção para a cristalização de proteínas, uma vez que esse coeficiente pode ser determinado por diversos métodos. Este trabalho teve como objetivo determinar experimentalmente diagramas de fases de proteínas (lisozima, insulina suína e bovina) e identificar nesses diagramas, através de análise dos valores do B22, as condições nas quais ocorre a formação de precipitado amorfo, cristalino ou outras fases (por exemplo, fase líquida). O "salting-out" foi o método escolhido para precipitar as proteínas, pois é considerado um dos mais simples e importantes métodos para induzir a cristalização. O sal volátil carbamato de amônio foi o agente de "salting-out" escolhido. As técnicas de espalhamento de luz estático (SLS) e cromatografia de auto-interação (SIC) foram usadas para determinar os valores de B22 para as proteínas em diferentes soluções aquosas de sal a 15 e 25 °C. O fenômeno de "salting-out" foi observado nos diagramas para as três proteínas estudadas. Valores negativos de B22 e altos valores da constante de "salting-out" - entre 1,07 a 3,77 kg/mol - confirmaram que o sal volátil carbamato de amônio empregado neste estudo é um bom agente precipitante. Os valores do B22 para a insulina suína (-250x10-4 a -18x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -187x10-4 a -45,2x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C) e insulina bovina (-999x10-4 a 6,7x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -533x10-4 a -16,7x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C) indicaram a precipitação, o que também foi confirmado pelos ensaios de cristalização. Já para a lisozima, obteve-se formação de cristais independente do valor de B22 encontrado (-20,4x10-4 a -3,6x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -400x10-4 a -14,4x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C). Além disso, os modelos teóricos disponíveis na literatura utilizados para a obtenção de uma estimativa do parâmetro B22 são adequados e válidos para as condições em que a medida experimental não é possível, podendo ser aplicados para o sistema proteína/sal volátil. Dessa forma, este trabalho mostrou que não existe uma "janela de cristalização universal" válida para todos os sistemas e o uso do sal volátil carbamato de amônio como agente de cristalização é uma alternativa ao uso de sais convencionais. / Abstract: The osmotic second virial coefficient, B22, has been used as a predictor of crystallization. A relatively narrow range of negative B22 values, -1x10-4 to -8x10-4 mL.mol/g2, is the ideal range for crystal formation according to George and Wilson (1994). This range, referred to as the "crystallization slot", has been used to classify suitable conditions under which proteins will assemble into crystals. For B22 values greater than -1x10-4 mL.mol/g2, the protein-protein interaction is very weak and no solid phase is formed, while for values less than -8x10-4 mL.mol/g2, the protein-protein interactions are very intense and amorphous precipitates are formed. Thus, the B22 value has become a selection criterion for protein crystallization, since this coefficient can be determined by various methods. This study aimed to determine the experimental phase diagrams for proteins (lysozyme and bovine and porcine insulin) and to identify those diagram conditions under which amorphous precipitate, crystals or other phases (for example, liquid phase) are formed, based on the values of B22. The salting-out method to precipitate proteins was chosen because it is considered one of the simplest and most important methods to induce crystallization. The volatile salt ammonium carbamate was chosen as the salting-out agent. Traditional static light scattering (SLS) and the novel self-interaction chromatography (SIC) technique were used to determine B22 values for the proteins in different aqueous salt solutions at 15 and 25 °C. The salting-out phenomenon was observed in the phase diagrams for the three proteins studied. Negative B22 values and high values of the salting-out constant - between 1.07 to 3.77 kg/mole (Cohn, 1925) - confirmed that ammonium carbamate was a good precipitant agent. The B22 values for porcine (-250x10-4 to -18x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -187x10-4 to -45.2 x10-4 mol.ml/g2 at 15 °C) and bovine (-999x10-4 to 6.7x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -533x10-4 to -16.7x10-4 mol.ml/g2 at 15 °C) insulin indicated precipitation that was confirmed experimentally. However, lysozyme was obtained as crystals, regardless of the B22 values found (-20.4x10-4 to -3.6 x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -14.4x10-4 to -400x10-4 mol.ml/g at 15 °C). In addition, thermodynamic models available in the literature and suitable for the conditions under which experimental measurements were done provided a good fit to the data. Thus, this work showed that there is no universal "crystallization slot" applicable to all systems and that for crystallization agent, volatile salt ammonium carbamate can serve as an alternative to conventional salts. / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutora em Engenharia Quimica

Orientador: Orientador : Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:58:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_AlissonCampos_D.pdf: 4487510 bytes, checksum: eec48cf16c52d89f7324a6a56476ca59 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Durante os primeiros dias do desenvolvimento pós-natal, os miócitos cardíacos perdem a capacidade de proliferação, sendo o crescimento adicional do coração decorrente de hipertrofia e não hiperplasia dos miócitos cardíacos. No entanto, em situações de estresse os miócitos cardíacos diferenciados podem apresentar desdiferenciação e reestabelecimento do ciclo celular. Os mecanismos envolvidos nesse fenômeno são ainda pouco compreendidos. No presente estudo, demonstramos que a ativação do fator de transcrição MEF2C (Myocyte Enhancer Factor 2-C) tem papel crítico no processo de desdiferenciação de miócitos cardíacos. Essa conclusão foi obtida por meio de experimentos de ganho de função pela superexpressão de MEF2C em miócitos ventriculares de ratos neonatos em cultura (MVRNs). Demonstramos que a superexpressão de MEF2C em MVRNs induziu a desdiferenciação e a ativação de mecanismos envolvidos na progressão do ciclo celular. Esses resultados foram obtidos por meio de experimentos de microarranjo de DNA, PCR em tempo real, western blotting e análise do fenótipo celular por microscopias de luz, confocal e eletrônica de transmissão. Esses fenômenos foram atenuados pela superexpressão da quinase de adesão focal (FAK), uma proteína que reconhecidamente exerce efeitos pró-hipertróficos em miócitos cardíacos adultos. Experimentos in vivo e in vitro demonstraram a interação direta entre o fator de transcrição MEF2C e a FAK. Estudos com base em ensaios de reação cruzada associada à espectrometria de massas, dinâmica molecular, espalhamento de raios-X a baixos ângulos e mutação sítio dirigida, demonstraram que as hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interagem diretamente com a domínio de ligação ao DNA do dímero de MEF2C. Estudos de afinidade e de gel shift demonstraram que a porção FAT da FAK desloca a interação MEF2C/DNA in vitro. Ensaios de gene repórter demonstraram que a FAK, mediada pela região C-terminal, diminui a atividade transcricional de MEF2C em células C2C12. O conjunto de dados demonstra que a ativação do fator de transcrição MEF2C em MVRNs induz a desdiferenciação e ativação de mecanismos de progressão do ciclo celular e que a FAK impede esses efeitos através da interação inibitória no domínio de ligação de MEF2C ao DNA / Abstract: During the first days of postnatal development, cardiac myocytes lose their ability to proliferate, and the further growth of the heart is due to hypertrophy and not hyperplasia of cardiac myocytes. However, in response to stress, cardiac myocytes may have dedifferentiation and re-establishment of the cell cycle. The mechanisms involved in this phenomenon are still poorly understood. In the present study, we demonstrated that activation of the transcription factor MEF2C (myocyte enhancer factor 2-C) plays a critical role in the process of dedifferentiation of cardiac myocytes. This conclusion was obtained by gain-of-function experiments through overexpressing MEF2C in neonatal rat ventricular myocytes in culture (NRVMs). We also showed that overexpression of MEF2C in NRVMs induced the dedifferentiation and activation of mechanisms involved on cell cycle progression. These results were obtained by DNA microarray experiments, real time PCR, western blotting and cell phenotype analysis by light microscopy, confocal and electronic transmission. These effects were attenuated by overexpression of focal adhesion kinase (FAK) protein known to exert pro-hypertrophic effects on adult cardiac myocytes. In vivo and in vitro experiments demonstrated the direct interaction between the transcription factor MEF2C and FAK. A model based on crosslinking technology coupled with mass spectrometry, small angle X-ray scattering and the site directed mutation analyses indicated that alpha-helices 1 and 4 of FAK FAT domain interacts directly with the DNA binding domain of MEF2C dimer. Affinity studies and gel shift assay demonstrated that the FAK FAT domain displaces the MEF2C/DNA interaction in vitro. Reporter gene assays demonstrated that FAK, mediated by the C-terminal region, decreases the transcriptional activity of MEF2C in C2C12 cells. The data set shows that the activation of the transcription factor MEF2C in MVRNs induces dedifferentiation and activation of cell cycle progression and that FAK prevents these effects by inhibitory interaction with DNA binding domain of MEF2C / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências

HSP70 is one of the most important families of molecular chaperone that regulate the folding and transport of client proteins in an ATP dependent manner. The ATPase activity of HSP70 is stimulated through an interaction with its family of HSP40 co-chaperones. There is evidence to suggest that specific partnerships occur between the different HSP40 and HSP70 isoforms. While some of the residues involved in the interaction are known, many of the residues governing the specificity of HSP40-HSP70 partnerships are not precisely defined. It is not currently possible to predict which HSP40 and HSP70 isoforms will interact. We attempted to use bioinformatics to identify residues involved in the specificity of the interaction between the J domain from HSP40 and the ATPase domain from the HSP70 isoforms from humans. A total of 49 HSP40 and 13 HSP70 sequences from humans were retrieved and used for subsequent analyses. The HSP40 J domains and HSP70 ATPase domains were extracted using python scripts and classified according to the subcellular localization of the proteins using localization prediction programs. Motif analysis was carried out using the full length HSP40 proteins and Multiple Sequence Alignment (MSA) was performed to identify conserved residues that may contribute to the J domain – ATPase domain interactions. Phylogenetic inference of the proteins was also performed in order to study their evolutionary relationship. Homology models of the J domains and ATPase domains were generated. The corresponding models were docked using HADDOCK server in order to analyze possible putative interactions between the partner proteins using the Protein Interactions Calculator (PIC). The level of residue conservation was found to be higher in Type I and II HSP40 than in Type III J proteins. While highly conserved residues on helixes II and III could play critical roles in J domain interactions with corresponding HSP70s, conserved residues on helixes I and IV seemed to be significant in keeping the J domain in its right orientation for functional interactions with HSP70s. Our results also showed that helixes II and III formed the interaction interface for binding to HSP70 ATPase domain as well as the linker residues. Finally, data based docking procedures, such as applied in this study, could be an effective method to investigate protein-protein interactions complex of biomolecules.

Abstract DNA replication is a process in which a cell duplicates its genome before cell division, and must proceed accurately and in organized manner to guarantee maintenance of the integrity of the genetic information. DNA polymerases are enzymes that catalyse the synthesis of the new DNA strand by utilizing the parental strand as a template. In addition to chromosomal replication, DNA synthesis and therefore DNA polymerases are also needed in other processes like DNA repair and DNA recombination. The DNA polymerase is an essential DNA polymerase in eukaryotes and is required for chromosomal DNA replication. It has also been implicated in DNA repair, recombination, and in transcriptional and cell cycle control. The regulation of the human enzyme was explored by analysing its expression, phosphorylation and protein-protein interactions. Expression of both the A and B subunits of the human DNA polymerase ε was strongly growth-regulated. After serum-stimulation of quiescent fibroblasts, the steady-state mRNA levels were up-regulated at least 5-fold. In actively cycling cells, however, the steady-state mRNA and protein levels fluctuated less than 2-fold, being highest in G1/S phase. The promoter of the B subunit gene was analysed in detail. The 75 bp core promoter was essentially dependent on the Sp1 transcription factor. Furthermore, mitogenic control of the promoter required an intact E2F binding element, and binding of E2F2, E2F4 and p107 was demonstrated in vitro. A down-regulation element, located immediately downstream from the core promoter, bound E2F1, NF-1 and pRb transcription factors. A model of the promoter function is presented. Topoisomerase IIβ binding protein 1 (TopBP1) was found to be associated with human DNA polymerase ε. TopBP1 contains eight BRCT domains and is homologous to Saccharomyces cerevisiae Dpb11, Schizosaccharomyces pombe Cut5, Drosophila melanogaster Mus101 and the human Breast Cancer susceptibility protein 1 (BRCA1). TopBP1 is a phosphoprotein, whose expression is induced at the G1/S border and is required for chromosomal DNA replication. It co-localizes in S phase with BRCA1 into discrete foci, which do not represent sites of ongoing DNA replication. However, if DNA is damaged or replication is blocked in S phase cells, TopBP1 and BRCA1 re-localize into proliferating cell nuclear antigen (PCNA) containing foci that represent stalled replication forks. Finally, phosphorylation of DNA polymerase ε was described and at least three immunologically distinct and differentially phosphorylated forms were shown to exist. Phosphorylation is on serine and threonine residues and shows a cell cycle dependent fluctuation, but is not affected by DNA damage or by inhibition of DNA replication. BRCA1 co-immunoprecipitates with a hypophosphorylated form of DNA polymerase ε. In contrast, TopBP1 was shown to be associated with a hyperphosphorylated form.