Nos últimos anos, um estilo de vida celular vem ganhando destaque no mundo científico: o biofilme. O biofilme é uma comunidade celular em que as células permanecem aderidas a um substrato e envoltas em uma matriz de biopolímeros. Bactérias no estado de biofilme possuem algumas características alteradas, como o aumento da resistência a antibióticos e a facilidade de troca de genes de resistência, sendo um grande inconveniente na área médica e industrial. O patógeno humano Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa causadora de infecções associadas a pacientes que apresentam o sistema imune debilitado, sendo muito comum em casos de fibrose cística. Além disso, P. aeruginosa é um organismo modelo no estudo de formação de biofilme, podendo produzir três tipos distintos de exopolissacarídeos: alginato, PSL e PEL. Devido ao pouco conhecimento do polissacarídeo PEL, a cepa P. aeruginosa PA14 vem sendo amplamente estudada, uma vez que essa é a única cepa em que PEL é o principal polímero responsável pela estabilidade da matriz de polissacarídeos. No processo de produção e exportação de PEL, sete proteínas são necessárias: Pel(A-G). Segundo predições computacionais e comparações com outros tipos de complexos biossintéticos de exopolissacarídeos, um modelo de arranjo molecular das proteínas Pel foi proposto, embora algumas proteínas não possuam uma função bem determinada no processo de síntese de PEL. Nesse contexto, o trabalho buscou estudar as proteínas envolvidas na formação de PEL para a melhor elucidação do mecanismo de ativação, produção e exportação desse polissacarídeo, com destaque para a enzima glicosiltransferase PelF e a investigação de uma possível interação de PelF com a proteína reguladora de produção do polissacarídeo, PelD, e a transportadora de membrana interna, PelG. Foram realizados diversos testes de interação entre PelF, PelG e construções solúveis de PelD por cromatografia de exclusão molecular, crosslinking e pull-down que não apresentaram interações entre tais construções, indicando que frações de membrana de PelD ou outros parceiros de interação podem ser necessários para a formação do complexo de síntese e exportação de PEL da membrana interna. Adicionalmente, mutantes de PelD sítio-dirigidos foram construídos em P. aeruginosa PA14 e tiveram sua capacidade de formação de biofilme avaliadas para investigação do mecanismo de ativação de PelD. A diminuição da formação de biofilme de mutantes de algumas regiões de PelD como a hélice S (resíduos 158-176), o core hidrofóbico ocupado pela hélice S e resíduos que estabilizam a ligação de c-di-GMP nos levou a propor um mecanismo de ativação desse importante regulador proteico de formação de biofilme em P. aeruginosa nunca descrito anteriormente. / In the last years, a cellular lifestyle has been in the spotlight in the scientific world: the biofilm. Biofilm is a cellular community in which cells are attached to a substrate and surrounded by a biopolymeric matrix. Bacteria in a biofilm lifestyle has some altered characteristics, as a higher antibiotics tolerance and facility in resistance genes exchange, turning them into a big problem in medical and industrial fields. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative bacterium which causes infections associated to patients with an impaired immune system, as frequently found in patients with cystic fibrosis. Moreover, P. aeruginosa is a model organism in biofilm formation studies, producing three distinct types of exopolysaccharides: alginate, PSL and PEL. Since there is few information about PEL polysaccharide, the strain PA14 has been broadly studied because this is the unique strain in which PEL is the main polymer that gives stability of the polysaccharide matrix. In the process of PEL production and exportation, seven proteins are required: Pel(A-G). Computational predictions and comparison with other similar exopolysaccharides biosynthetic complexes led to a model of molecular complex of Pel proteins, though some proteins do not have a clear role in the PEL synthesis process. In this context, the work aimed to study the proteins related to PEL synthesis for a better understanding of the mechanism of production and exportation of this polysaccharide, focusing on the glycosyltransferase PelF and the investigation of its possible interaction with PelD, the regulatory protein of the polysaccharide production, and PelG, the putative inner membrane transporter. Several interaction assays were performed with PelF, PelG and soluble constructs of PelD using size exclusion chromatography, crosslinking and pull-down. No interaction was detected, showing that membrane fractions of PelD or other interaction partners can be required to the inner membrane complex of synthesis and export of PEL. Additionally, site-directed mutants of PelD in P. aeruginosa PA14 were constructed to evaluate their biofilm formation ability and investigate PelD activation mechanism. Mutants in regions as S-helix (residues 158-176), hydrophobic core occupied by the S-helix and residues of c-di-GMP stabilization presented a decrease of biofilm formation compared to the wild type strain. Those results allowed us to propose an activation mechanism of this important regulator of biofilm formation in P. aeruginosa never described before.

Ramnolipídios (RHLs) são biossurfactantes produzidos por Pseudomonas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de produção de ramnolipídios por isolados de Pseudomonas considerando os efeitos das fontes de carbono ou nitrogênio tanto na concentração de ramnolipídios produzida como na composição deste. De 47 isolados bacterianos, cinco foram selecionados qualitativamente para avaliação da produção de ramnolipídios, analisando 48 combinações diferentes de meio mineral. A produção de polihidroxialcanoatos (PHAs) também foi avaliada. Glicose e óleos de canola e linhaça foram as fontes de carbono que promoveram a maior formação de RHLs. Nitrato de sódio se mostrou a melhor fonte de nitrogênio para produção desse tensoativo. A análise do PHA e do RHL purificados revelou a presença de 3-hidroxi-6-dodecenoato (3HDd<font face=\"Symbol\">D6), um composto proveniente exclusivamente da <font face=\"Symbol\">b-oxidação do ácido linoleico. Esses resultados indicam que a <font face=\"Symbol\">b-oxidação de ácidos graxos também contribui com intermediários metabólicos para a biossíntese de RHLs, ao contrário ao reportado na literatura. / Ramnolipids (RHLs) are biosurfactants produced by Pseudomonas. The aim of this study was to evaluate the production of rhamnolipids by Pseudomonas isolates, considering the effects of carbon and nitrogen sources on their concentration and composition. From 47 bacterial isolates, five were selected qualitatively for to evaluate the RHLs production, analyzing 48 different combinations of mineral medium. The production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) was also evaluated. Linseed oil, canola oil and glucose were the carbon sources that promoted formation the largest amounts of RHLs. From plant oils, sodium nitrate proved to be the best nitrogen source for RHLs production. The analysis of purified PHA and RHL revealed the presence of the 3-hydroxy-6-dodecenoate, a compound derived exclusively from <font face=\"Symbol\">b-oxidation of linoleic acid. These results indicate that the <font face=\"Symbol\">b-oxidation of fat acids, contributes with intermediates for the biosynthesis of RHLs, unlike literature reports.

Copies of author's previously published articles inserted. Bibliography :leaves 65-80 Ice nucleation active (INA) bacteria were detected in a pea field in South Australia. They were identified as strains of Pseudomonas syringae and Pseudomonas flourescens biotype 1. Some chemical agents were tested on the two ice nucleating species, as cryoprotectants.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2001. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 86-98).

Το γένος Pseudomonas ανήκει στην οικογένεια Pseudomonadaceae και περιλαμβάνει πολλά είδη. Το συχνότερο είδος ψευδομονάδας που προκαλεί νόσο στον άνθρωπο είναι η Pseudomonas aeruginosa. Η P.aeruginosa είναι ένα Gram αρνητικό, αυστηρά αερόβιο βακτηρίδιο, το οποίο αναπτύσσεται στους 37-42οC και καλλιεργείται σχετικά εύκολα σε κοινά θρεπτικά υλικά. Η P. aeruginosa έχει χαρακτηριστεί ως ένα από τα σημαντικότερα και σοβαρότερα ευκαιριακά παθογόνα βακτηρία, τα οποία είναι υπεύθυνα για νοσοκομειακές λοιμώξεις σε διάφορες ειδικές ομάδες ασθενών όπως ανοσοκατασταλμένα άτομα, άτομα με κυστική ίνωση (cystic fibrosis), ασθενείς με νεοπλασίες, κ.α. Οι λοιμώξεις που προκαλεί η P. aeruginosa χαρακτηρίζονται σοβαρές και επικίνδυνες αφενός μεν γιατί προκαλεί νόσο σε άτομα ήδη επιβεβαρυμένα από άλλες καταστάσεις, αφετέρου δε γιατί εμφανίζει ανθεκτικότητα στα περισσότερα αντιβιοτικά. Ο τρόπος με τον οποίο η P. aeruginosa ασκεί την παθογόνο δράση της είναι πολύπλοκος και δεν έχει διευκρινισθεί επακριβώς. Διάφοροι κυτταρικοί παράγοντες αλλά και εξωκυττάρια προϊόντα θεωρούνται υπεύθυνα για την έκφραση της παθογόνου δράσης του μικροοργανισμού. Οι πιο σημαντικοί κυτταρικοί παράγοντες είναι: ο λιποπολυσακχαρίτης, οι φίμπριες, οι πρωτεΐνες της εξωκυττάριας μεμβράνης, ο εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης (Slime), καθώς επίσης και ο βλεννώδης πολυσακχαρίτης (αλγινικό οξύ) που σχετίζεται με τα βλεννώδη στελέχη. Επίσης διάφορα εξωκυττάρια προϊόντα-παράγοντες τα οποία θεωρούνται υπεύθυνα για τη λοιμογόνο δράση του βακτηρίου, είναι διάφορα ένζυμα και κυρίως το Εξωένζυμο-S και η Εξωτοξίνη-A. Στους μηχανισμούς άμυνας του ξενιστή έναντι της P. aeruginosa τα μακροφάγα που προσελκύονται στην εστία της λοίμωξης παίζουν το σπουδαιότερο ρόλο. Οι κυτταροκίνες που παράγονται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα καθορίζουν την έκταση της βλάβης και την έκβαση της λοίμωξης. Σε πειραματικά μοντέλα σήψης από P. aeruginosa η παραγωγή του παράγοντα νεκρώσεως όγκου (TNF-α) σε μικρά ποσά έχει συσχετισθεί με προστασία σε σοβαρές λοιμώξεις, ενώ η υπερπαραγωγή του οδηγεί σε σηπτικό σοκ. Η ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α αντικατοπτρίζει τη ρύθμιση της ενεργοποίησης του μακροφάγου. Διαφορετικοί υποδοχείς επιφανείας όπως οι TLR’s, συμβάλουν στην αναγνώριση του μικροβίου και την επακόλουθη ενεργοποίηση του μακροφάγου. Τα ενδοκυττάρια γεγονότα που σχετίζονται με τη μετάδοση του σήματος ενεργοποίησης στα μακροφάγα δεν είναι απόλυτα αποσαφηνισμένα. Πρώιμα συμβάντα ενεργοποίησης των μακροφαγων που ρυθμίζουν την παραγωγή του TNF-α, είναι η ενεργοποίηση των MAP κινασών. Η οικογένεια των MAPK’s περιλαμβάνει 3 κινάσες: την p38, την Erk1,2 και την JNK, που έχουν ταυτοποιηθεί ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι σε πειραματικά μοντέλα σήψης. Η διαδοχική φωσφορυλίωση υποστρωμάτων ενεργοποιεί διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες, χαρακτηριστικότεροι των οποίων είναι ο NF-κΒ και ο AP-1, ο οποίοι συμμετέχουν στη μεταγραφή των γονιδίων των κυτταροκινών που εκφράζονται στη διάρκεια της σηπτικής καταπληξίας. Σημαντικότερη από αυτές είναι ο TNF-α. Η ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α είναι αντιπροσωπευτικός στόχος μελέτης των μηχανισμών που διέπουν την ενεργοποίηση των μακροφάγων. Αυτή η ρύθμιση γίνεται τόσο στο επίπεδο μεταγραφής του γονιδίου όσο και στο μετά-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο. Συνεργασία μεταξύ των πρωτεϊνών μεταγραφής και αυτών που δεσμεύονται στη 3-UTR περιοχή του mRNA του TNF-α συμβάλουν στην εκλεκτική ρύθμιση της παραγωγής του από τα μακροφάγα. Οι μηχανισμοί που ενέχονται στην ενεργοποίηση των μακροφάγων από την P. aeruginosa δεν έχουν πλήρως μελετηθεί. Ταυτοποίηση των συγκεκριμένων μορίων-στόχων στη μετάδοση του σήματος ενεργοποίησης στα μακροφάγα συμβάλει στην κατανόηση των μηχανισμών ελέγχου της σηπτικής καταπληξίας. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η αποσαφήνιση της δράσης της P. aeruginosa στα διάφορα στάδια ενεργοποίησης των μακροφάγων όπως: α) το επίπεδο της φωσφορυλίωσης-ενεργοποίησης διαφόρων πρωτεϊνικών κινασών (π.χ. MAPK’s), β) την ενεργοποίηση-δράση μεταγραφικών παραγόντων με αντιπροσωπευτικότερους τον NF-κΒ και AP-1, και τέλος, γ) την διερεύνηση των υποδοχέων επιφανείας όπως οι Toll-like υποδοχείς στη μετάδοση του σήματος ενεργοποίησης, αλλά και σύνδεση αυτών με την ενεργοποίηση των MAPK’s. Σε επίπεδο παραγωγής TNF-α πρωτεΐνης και ενεργοποίησης μεταγραφικών παραγόντων, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι: α) Το Slime-GLP είναι ισχυρότερος διεγέρτης από τον LPS P. aeruginosa για την παραγωγή TNF-α σε υπερκείμενα μονοκυτταρικών καλλιεργειών. β) Αυτή η διαφορετική ρύθμιση της παραγωγής πρωτεϊνικού TNF-α, αντικατοπτρίζεται και σε επίπεδο ενεργοποίησης μεταγραφικών παραγόντων. Συγκεκριμένα, το Slime-GLP μπορεί και επάγει περισσότερο την ενεργοποίηση του NF-κΒ από ότι ο LPS της P. aeruginosa και αυτή η ενεργοποίηση είναι σχεδόν ίση με αυτή που προκαλεί ολόκληρο το ζωντανό κύτταρο της P. aeruginosa. γ) Ο NF-κΒ που ενεργοποιείται με Slime-GLP αποτελείται από το ετεροδιμερές p50/p65. δ) Ο μεταγραφικός παράγοντας AP-1 ενεργοποιείται σχετικά πιο καθυστερημένα από ότι ο NF-κΒ, αλλά και σε αυτή την περίπτωση το Slime-GLP φαίνεται να είναι ισχυρότερος διεγέρτης από τον LPS P. aeruginosa. Σε επίπεδο ενεργοποίησης των MAP κινασών τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η διαφορετική ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α, σε επίπεδο πρωτεΐνης, μετά από διέγερση με LPS ή Slime-GLP αντικατοπτρίζεται και σε επίπεδο ενεργοποίησης των διαφορετικών MAP κινασών. Συγκεκριμένα το Slime-GLP ενεργοποιεί τις p38 και Εrk1,2 σε μεγαλύτερο βαθμό από ότι ο LPS της P. aeruginosa. Η ενεργοποίηση των p38 και Erk1,2 που αποτυπώνεται με αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσής τους, αντιστοιχεί και με αύξηση της ενεργότητάς τους. Η χρήση ειδικών αναστολέων έναντι των p38 (SB203580) και Erk1,2 (PD98059) μπορεί και αναστέλλει σημαντικά την παραγωγή του πρωτεϊνικού TNF-α κατά 80-95% και 60-80% αντίστοιχα. Το Slime- GLP διαφέρει από τον ομόλογο LPS της P. aeruginosa μόνο στο βαθμό της ενεργοποίησης των MAP κινασών, δηλαδή μπορεί και επάγει ισχυρότερα τις MAP κινάσες από ότι ο ομόλογος LPS. Η συμμετοχή των Toll-like υποδοχέων στη μετάδοση του σήματος αυτής της διαφορετικής ενεργοποίησης των MAP κινασών από τους LPS και Slime-GLP της P. aeruginosa, μελετήθηκε με τη χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων (anti-TLR2) και (anti-TLR4). Συγκεκριμένα, η ενεργοποίηση της p38, μετά από διέγερση με Slime-GLP, μειώνεται σημαντικά παρουσία του anti-TLR2, ενώ παρουσία του anti-TLR4 η μείωση της ενεργοποίησης της p38 δεν είναι τόσο προφανής. Αντίθετα, μείωση της ενεργοποίησης της p38, όταν αυτή επάγεται από τον LPS της P. aeruginosa, παρατηρούμε μόνο στην περίπτωση που αδρανοποιούμε τον TLR4. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έναν μοριακό μηχανισμό με τον οποίο ο LPS και ο εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης Slime-GLP της P. aeruginosa, χρησιμοποιούν διαφορετικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των μακροφάγων για την διαφορετική ενεργοποίηση των MAP κινασών και τη ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α στα ανθρώπινα μακροφάγα κύτταρα / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic Gram-negative pathogen that is associated with severe infections of immunocompromized or critically ill patients. P. aeruginosa infections both chronic and acute, are associated with high incidence of morbidity and mortality. Many gene products of the bacterium, involving lipolysaccharide (LPS), extracellular slime glycolipoprotein (Slime-GLP), exotoxin- A, and exoenzyme-S, contribute to the pathophysiology of P. aeruginosa infection, by stimulating different cell types of the immune system. Macrophages play a key role in execution of the innate and adaptive arms of the immune response to Pseudomonas infection. Activated macrophages exert their effects by producing several types of cytokines and/or other mediators. TNF-α an early proinflammatory cytokine produced by activated macrophages is probably the most important mediator of systemic toxicity. TNF-α production primarily by cells of monocytic lineage is a crucial event in the course of these infections. During in vivo infections with P. aeruginosa, both LPS and Slime-GLP produced by mucoid and non-mucoid strains are being released. Extracellular Slime-GLP causes systemic toxicity when administered in vivo. Signal transduction pathways and early activation intracellular events that mediate induction of TNF-α by human monocytes have been the subject of great interest by many investigators. A key component of many intracellular signaling pathways are the mitogen-activated protein (MAP) kinases. This superfamily includes the extracellular signal response kinases (ERK’s), c-jun N-terminal kinases and the p38 family of kinases. A wide range of bacterial compounds including LPS of Gram-negative bacteria, LTA and peptidoglycan of Gram-positive bacteria and Treponema components differentially activate the MAP kinase family members. Recently it has been shown that cell surface Toll-like receptor (TLR) proteins participate in the ability of the host to discriminate different LPS structural features, and/or other components of the bacterial cell. Although it is now clear that the TLR family of membrane proteins is linked to the activation of MAP kinase family members by different microbial components the subsequent pathways that lead to inflammatory mediator production are still being elucidated. The aim of our study was to delineate the molecular mechanisms leading to differential TNF-α induction by P. aeruginosa LPS and Slime-GLP, specifically theIdentification of specific molecular targets of P. aeruginosa Slime-GLP in human monocytes-macrophages may have important therapeutic implications for P. aeruginosa mediated systemic toxicity.

Determining the factors responsible for the origin and maintenance of diversity remains a difficult problem in evolutionary biology. There is extensive theoretical work which suggests that environmental heterogeneity plays a major role. This theory argues that diversification is ultimately due to divergent natural selection for alternative resources. In this thesis I investigate adaptation and the evolution of diversity in experimental populations of the asexual bacterium Pseudomonas fluorescens. In all experiments I introduce clonal isolates of Pseudomonas to a novel environment and allow evolution to occur through the substitution of random mutations. Adaptation can then be quantified by comparing evolved genotypes to the ancestor. These experiments show that when Pseudomonas is selected in a complex environment containing several resources, sympatric genotypes adapt to use different resources, leading to the evolution of genetically diverse populations. In environments containing just a single resource, most genotypes adapt to use the same resource and no such diversity is observed. Adaptation in the experimental populations is caused by the fixation of beneficial mutations of intermediate fitness effect. My results highlight the value of microbial model systems for answering evolutionary questions and provide strong evidence for the role of ecological factors in the origin of diversity.

Physiological and compositional changes in Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) were monitored during, growth on various petroleum compounds in a chemically-defined medium. Growth of P. aeruginosa was observed when furnace oil, kerosene, aviation fuel, light crude oil and hexadecane were used as carbon and energy sources. A variable and extended lag period before active growth was achieved was characteristic of petroleum-grown cells as compared to glucose-grown cells. Growth on the petroleum hydrocarbons, compared with that on glucose, resulted in changes in cell lipid composition, outer membrane proteins, cell-surface hydrophobicity, surface-tension, and pH changes in the growth medium during transition from early to late-log phase. Cell composition and physiology of cells grown in the petroleum mixtures varied due to differences in the chemical composition of the material. Production of an exopolymer (characterized as a peptidoglycolipid) was associated with petroleum-grown cells but not with glucose-grown cells. The above differences illustrate some of the dynamic and physiological and biochemical changes the microorganism undergoes to access its hydrophobic carbon and energy source.

Copies of author's previously published articles inserted. / Bibliography :leaves 65-80 / x, 80, [64] leaves, [24] leaves of plates : ill. (some col.) ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Ice nucleation active (INA) bacteria were detected in a pea field in South Australia. They were identified as strains of Pseudomonas syringae and Pseudomonas flourescens biotype 1. Some chemical agents were tested on the two ice nucleating species, as cryoprotectants. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Crop Protection, 1991

Thesis (Ph. D.)--University of Adelaide, Dept. of Crop Protection, 1991. / Copies of author's previously published articles inserted. Includes bibliographical references (leaves 65-80).

Univ., Diss.--Stuttgart, 1998.