Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4877_1.pdf: 111207 bytes, checksum: 712e40230bf12fe0fb480366b5f38078 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Transformações neoplásicas apresentam modificações na composição e distribuição de oligossacarídeos da superfície celular de glicoproteínas e glicolipídeos, a partir desta característica, lectinas vêm sendo utilizadas como sondas no auxílio de diagnósticos histopatológicos de tecidos de mama, útero e cérebro, entre outros. Quimiluminescência é uma a técnica que possui baixos limites de detecção e amplas faixas dinâmicas. O éster de acridina vem sendo utilizado em sistemas quimiluminescentes para imunodiagnóstico conjugado a anticorpos. Neste trabalho, o éster de acridina foi conjugado à Concanavalina A (Con A) e empregado como marcador histoquímico quimiluminescente. Foram utilizados tecidos mamários humanos normais e diagnosticados como carcinoma ductal infiltrante (CDI). Na metodologia utilizada a emissão de fótons, durante a hidrólise do éster de acridina conjugado à Con A, que foi quantificada, expressada em unidade relativas de luz (URL) e correlacionada com a marcação do tecido, normal ou transformado. Os resultados encontrados demonstraram uma proporcionalidade de URL com a intensidade de marcação dos tecidos estudados. Os valores de URL para o tecido mamário normal (2,565x103 ± 0,247x103) foram inferiores aos obtidos para o CDI (1.283,920x103 ± 220,621x103). A eficiência da conjugação da lectina ao éster de acridina, a marcação diferenciada do tecido normal e CDI, e a quantificação dos resultados obtidos contribuem para diminuir a subjetividade no diagnóstico histopatológico de rotina e possibilitam o emprego do éster de acridina como marcador de lectinas para uso em histoquímica

Os neutrófilos são células fagocíticas do sistema imune inato com mecanismos especializados de digestão de patógenos, complexos imune e detritos celulares, que são mediados principalmente por espécies reativas de oxigênio (EROs) e enzimas proteolíticas. Entretanto, a ativação maciça de neutrófilos leva a uma liberação exacerbada de enzimas e EROs para o meio extracelular, o que pode ultrapassar a capacidade de defesa tecidual, composta por antioxidantes e antiproteinases, e lesar o tecido, bem como amplificar o processo inflamatório observado em algumas doenças inflamatórias, autoimunes e infecciosas. O envolvimento de neutrófilos na fisiopatologia de tais doenças tem atraído o interesse na pesquisa de novas substâncias com propriedades antioxidantes e imunomodulatórias. Neste trabalho, foi avaliado o efeito modulatório de onze derivados de cumarinas hidroxiladas e acetoxiladas sobre duas funções efetoras de neutrófilos humanos (produção de EROs e desgranulação), bem como a citotoxicidade dessas substâncias. Além disso, a relação estrutura-atividade foi analisada. Para tais investigações, o sangue venoso foi coletado de voluntários saudáveis e os neutrófilos foram isolados pelo método da gelatina. O metabolismo oxidativo dos neutrófilos foi desencadeado por zimosan opsonizado com soro humano normal (ZIops) ou forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), e a resposta celular foi avaliada pelos ensaios de quimioluminescência dependente de lucigenina (QLluc) ou de luminol (QLlum). Para a realização desses ensaios, foram padronizadas as seguintes condições experimentais: concentração das sondas luminol e lucigenina; concentração do solvente dimetilsulfóxido; tempo de leitura da QLuc e QLlum. Posteriormente, a atividade antioxidante das cumarinas frente ao radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) foi avaliada espectrofotometricamente em 510 nm. Além disso, foi avaliado o efeito das cumarinas na desgranulação dos neutrófilos induzida por n-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP), utilizando-se a enzima elastase como marcador, bem como o efeito dessas substâncias na atividade da elastase liberada pelos neutrófilos. Ambos os ensaios foram realizados através da quantificação de p-nitroanilina liberada após a quebra de um substrato específico para essa enzima, em 405 nm. A toxicidade das cumarinas sobre os neutrófilos foi avaliada pela exclusão do azul de tripan e pela medida da liberação de lactato desidrogenase. Observou-se que, tanto para as células estimuladas por ZIops quanto por PMA: (i) a maioria das cumarinas inibiu a QLluc e a QLlum de maneira dependente da concentração, sendo que as mais ativas (C, D) possuíam grupos orto-diidroxi; (ii) quatro cumarinas (A, B, F, G) inibiram a QLluc, mas aumentaram a QLlum; (iii) a cumarina não-substituída (K) não teve efeito modulatório significativo sobre a QLlum ou QLluc; (iv) ordem de efeito inibitório das demais substâncias (E, H, I, J) foi dependente do número e posição dos grupos substituintes, bem como do tipo de sonda quimioluminescente (luminol ou lucigenina) e do estímulo utilizado. Verificou-se também que três cumarinas (C, D, H) tiveram atividade antioxidante significante frente ao radical livre DPPH. Além disso, quatro das substâncias avaliadas (A, B, E, G) inibiram a desgranulação dos neutrófilos, mas nenhuma delas (A - K) interferiu na atividade da elastase. A análise do conjunto de resultados obtidos sugere que o número e posição dos grupos hidroxil e acetil no esqueleto cumarínico foram importantes para a modulação do metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos, sendo que, dependendo do tipo de EROs medida, tais características estruturais podem levar a um efeito anti- ou pró-oxidante. Além disso, o efeito modulatório das cumarinas sobre as funções efetoras dos neutrófilos foi dependente o tipo de estímulo utilizado, e não foi mediado pela toxicidade dessas substâncias, nas condições ensaiadas. Sendo assim, os resultados obtidos podem auxiliar no entendimento dos requisitos estruturais das cumarinas necessários para uma modulação eficiente das funções efetoras dos neutrófilos envolvidas em doenças inflamatórias. / Neutrophils are phagocytic cells from the innate immune system with highly developed mechanisms for intracellular digestion of pathogens, immune complexes and cell debris, which are mainly mediated by reactive oxygen species (EROs) and proteolytic enzymes. However, massive neutrophil activation lead to release of large amounts of enzymes and EROs to the extracellular milieu, that may overpower the tissue defense systems, composed of antioxidants and antiproteinases, and damage the tissue, as well as contribute to the amplification of the inflammatory process found in some inflammatory, autoimmune and infectious diseases. The involvement of neutrophils in the physiopathology of such diseases has attracted the interest in the search of new compounds with antioxidant and immunomodulatory properties. In this work, we evaluated the modulatory effect of eleven hydroxylated and acetoxylated coumarin derivatives in two effector functions of human neutrophils (EROs production and degranulation) as well as the cytotoxic effects of these compounds. In addition, the structure-activity relationship was analyzed. Venous blood was collected from healthy volunteers and neutrophils were isolated by the gelatin method to perform our experiments. The neutrophil oxidative metabolism was triggered by normal human serum-opsonized zymosan (ZIops) or phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), and the cellular response was evaluated by the lucigenin (QLluc)- or luminol (QLlum)-amplified chemiluminescence assays. In order to conduct this study, the following experimental conditions had to be established: concentration of the chemiluminescence probes luminol and lucigenin; concentration of the solvent dimethylsulfoxide; the QLluc and QLlum reaction time. Afterwards, the antioxidant activity against 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH) was evaluated spectrophotometrically at 510 nm. Moreover, the effect of coumarins in the n-formyl-metionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP)-induced neutrophil degranulation was evaluated by using elastase as marker, and the effect of these compounds in the elastase activity were also evaluated. Both assays were performed by measuring the elastase-mediated p-nitroaniline release from a specific substrate (405 nm). Toxicity of coumarins to the neutrophils was evaluated by trypan blue exclusion and measurement of lactate dehydrogenase release. Considering both, ZIops and PMA-stimulated neutrophils, we observed that: (i) most of coumarins inhibited the QLluc and the QLlum in a concentration-dependent manner, being the orto-dihydroxylated (C, D) the most active ones; (ii) four coumarins (A, B, F, G) inhibited the QLluc but increased the QLlum; (iii) the unsubstituted coumarin (K) had no significant modulatory effect on QLlum or QLluc; (iv) the rank order of inhibitory effect among the other compounds (E, H, I, J) was dependent on the number and position of substituents, as well as the type of chemiluminescent probe (luminol or lucigenin) and stimulus used. In addition, we observed that three coumarins (C, D, H) had a significant antioxidant activity against DPPH, and four compounds (A, B, E, G) inhibited the neutrophil degranulation, but none of the tested coumarins (A - K) interfered in the elastase activity. Taken together, our results suggest that the number and position of the hydroxyl and acetyl groups in the coumarin moiety were important to modulate the human neutrophil oxidative metabolism. Depending on the type of EROs measured, such structural features can lead to an anti- or pro-oxidant effect. Furthermore, the modulatory effect of coumarins on the neutrophil effector functions was dependent on the type of stimulus used, but it was not mediated by toxicity of these compounds to the neutrophils, under the assessed conditions. Therefore, the results described herein may be helpful to understand the structural requirements of coumarins to reach an efficient modulation of the neutrophil effector functions involved in inflammatory diseases.

Os neutrófilos são células fagocíticas do sistema imune inato com mecanismos especializados de digestão de patógenos, complexos imune e detritos celulares, que são mediados principalmente por espécies reativas de oxigênio (EROs) e enzimas proteolíticas. Entretanto, a ativação maciça de neutrófilos leva a uma liberação exacerbada de enzimas e EROs para o meio extracelular, o que pode ultrapassar a capacidade de defesa tecidual, composta por antioxidantes e antiproteinases, e lesar o tecido, bem como amplificar o processo inflamatório observado em algumas doenças inflamatórias, autoimunes e infecciosas. O envolvimento de neutrófilos na fisiopatologia de tais doenças tem atraído o interesse na pesquisa de novas substâncias com propriedades antioxidantes e imunomodulatórias. Neste trabalho, foi avaliado o efeito modulatório de onze derivados de cumarinas hidroxiladas e acetoxiladas sobre duas funções efetoras de neutrófilos humanos (produção de EROs e desgranulação), bem como a citotoxicidade dessas substâncias. Além disso, a relação estrutura-atividade foi analisada. Para tais investigações, o sangue venoso foi coletado de voluntários saudáveis e os neutrófilos foram isolados pelo método da gelatina. O metabolismo oxidativo dos neutrófilos foi desencadeado por zimosan opsonizado com soro humano normal (ZIops) ou forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), e a resposta celular foi avaliada pelos ensaios de quimioluminescência dependente de lucigenina (QLluc) ou de luminol (QLlum). Para a realização desses ensaios, foram padronizadas as seguintes condições experimentais: concentração das sondas luminol e lucigenina; concentração do solvente dimetilsulfóxido; tempo de leitura da QLuc e QLlum. Posteriormente, a atividade antioxidante das cumarinas frente ao radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) foi avaliada espectrofotometricamente em 510 nm. Além disso, foi avaliado o efeito das cumarinas na desgranulação dos neutrófilos induzida por n-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP), utilizando-se a enzima elastase como marcador, bem como o efeito dessas substâncias na atividade da elastase liberada pelos neutrófilos. Ambos os ensaios foram realizados através da quantificação de p-nitroanilina liberada após a quebra de um substrato específico para essa enzima, em 405 nm. A toxicidade das cumarinas sobre os neutrófilos foi avaliada pela exclusão do azul de tripan e pela medida da liberação de lactato desidrogenase. Observou-se que, tanto para as células estimuladas por ZIops quanto por PMA: (i) a maioria das cumarinas inibiu a QLluc e a QLlum de maneira dependente da concentração, sendo que as mais ativas (C, D) possuíam grupos orto-diidroxi; (ii) quatro cumarinas (A, B, F, G) inibiram a QLluc, mas aumentaram a QLlum; (iii) a cumarina não-substituída (K) não teve efeito modulatório significativo sobre a QLlum ou QLluc; (iv) ordem de efeito inibitório das demais substâncias (E, H, I, J) foi dependente do número e posição dos grupos substituintes, bem como do tipo de sonda quimioluminescente (luminol ou lucigenina) e do estímulo utilizado. Verificou-se também que três cumarinas (C, D, H) tiveram atividade antioxidante significante frente ao radical livre DPPH. Além disso, quatro das substâncias avaliadas (A, B, E, G) inibiram a desgranulação dos neutrófilos, mas nenhuma delas (A - K) interferiu na atividade da elastase. A análise do conjunto de resultados obtidos sugere que o número e posição dos grupos hidroxil e acetil no esqueleto cumarínico foram importantes para a modulação do metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos, sendo que, dependendo do tipo de EROs medida, tais características estruturais podem levar a um efeito anti- ou pró-oxidante. Além disso, o efeito modulatório das cumarinas sobre as funções efetoras dos neutrófilos foi dependente o tipo de estímulo utilizado, e não foi mediado pela toxicidade dessas substâncias, nas condições ensaiadas. Sendo assim, os resultados obtidos podem auxiliar no entendimento dos requisitos estruturais das cumarinas necessários para uma modulação eficiente das funções efetoras dos neutrófilos envolvidas em doenças inflamatórias. / Neutrophils are phagocytic cells from the innate immune system with highly developed mechanisms for intracellular digestion of pathogens, immune complexes and cell debris, which are mainly mediated by reactive oxygen species (EROs) and proteolytic enzymes. However, massive neutrophil activation lead to release of large amounts of enzymes and EROs to the extracellular milieu, that may overpower the tissue defense systems, composed of antioxidants and antiproteinases, and damage the tissue, as well as contribute to the amplification of the inflammatory process found in some inflammatory, autoimmune and infectious diseases. The involvement of neutrophils in the physiopathology of such diseases has attracted the interest in the search of new compounds with antioxidant and immunomodulatory properties. In this work, we evaluated the modulatory effect of eleven hydroxylated and acetoxylated coumarin derivatives in two effector functions of human neutrophils (EROs production and degranulation) as well as the cytotoxic effects of these compounds. In addition, the structure-activity relationship was analyzed. Venous blood was collected from healthy volunteers and neutrophils were isolated by the gelatin method to perform our experiments. The neutrophil oxidative metabolism was triggered by normal human serum-opsonized zymosan (ZIops) or phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), and the cellular response was evaluated by the lucigenin (QLluc)- or luminol (QLlum)-amplified chemiluminescence assays. In order to conduct this study, the following experimental conditions had to be established: concentration of the chemiluminescence probes luminol and lucigenin; concentration of the solvent dimethylsulfoxide; the QLluc and QLlum reaction time. Afterwards, the antioxidant activity against 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH) was evaluated spectrophotometrically at 510 nm. Moreover, the effect of coumarins in the n-formyl-metionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP)-induced neutrophil degranulation was evaluated by using elastase as marker, and the effect of these compounds in the elastase activity were also evaluated. Both assays were performed by measuring the elastase-mediated p-nitroaniline release from a specific substrate (405 nm). Toxicity of coumarins to the neutrophils was evaluated by trypan blue exclusion and measurement of lactate dehydrogenase release. Considering both, ZIops and PMA-stimulated neutrophils, we observed that: (i) most of coumarins inhibited the QLluc and the QLlum in a concentration-dependent manner, being the orto-dihydroxylated (C, D) the most active ones; (ii) four coumarins (A, B, F, G) inhibited the QLluc but increased the QLlum; (iii) the unsubstituted coumarin (K) had no significant modulatory effect on QLlum or QLluc; (iv) the rank order of inhibitory effect among the other compounds (E, H, I, J) was dependent on the number and position of substituents, as well as the type of chemiluminescent probe (luminol or lucigenin) and stimulus used. In addition, we observed that three coumarins (C, D, H) had a significant antioxidant activity against DPPH, and four compounds (A, B, E, G) inhibited the neutrophil degranulation, but none of the tested coumarins (A - K) interfered in the elastase activity. Taken together, our results suggest that the number and position of the hydroxyl and acetyl groups in the coumarin moiety were important to modulate the human neutrophil oxidative metabolism. Depending on the type of EROs measured, such structural features can lead to an anti- or pro-oxidant effect. Furthermore, the modulatory effect of coumarins on the neutrophil effector functions was dependent on the type of stimulus used, but it was not mediated by toxicity of these compounds to the neutrophils, under the assessed conditions. Therefore, the results described herein may be helpful to understand the structural requirements of coumarins to reach an efficient modulation of the neutrophil effector functions involved in inflammatory diseases.

A exposição excessiva às radiações UV é capaz de limitar a capacidade dos sistemas de defesa antioxidante em nosso organismo, provocando o estresse oxidativo. Assim, extratos vegetais ricos em compostos antioxidantes são fortes candidatos a serem veiculados em formulações tópicas para a prevenção ou tratamento dos danos causados pela RUV na pele. Dentre a gama de extratos vegetais com atividade biológica, o extrato de açaí, fruto da espécie Euterpe olerecea Mart., tem se destacado por apresentar grande quantidade de antioxidantes na sua composição. Geralmente, a quantidade de ativos que consegue penetrar na pele é pequena, exigindo métodos analíticos muito sensíveis. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o emprego do método de quimioluminescência para a quantificação da penetração dos componentes do extrato de açaí na pele por medida da atividade antioxidante. Os resultados mostraram que o IC50 do extrato de açaí para o ensaio de inibição da quimioluminescência gerada no sistema xantina/luminol/xantina oxidase foi de 0,63 ?g/mL. Além disso, a quantificação do extrato de açaí utilizando esse método foi possível para porcentagens de inibição obtidas até o valor de 60%. Ainda, esse método mostrou-se preciso e exato na determinação da porcentagem de inibição da quimioluminescência do extrato de açaí na concentração próxima a IC50, sendo essa inibição não influenciada pelos componentes das diferentes formulações estudadas. No entanto, o uso da quimioluminescência como um método de quantificação da penetração de componentes antioxidantes de extratos hidrossolúveis torna o processo de extração desses componentes da pele um fator importante, no qual a escolha do solvente extrator é um ponto crítico. Assim, o solvente extrator escolhido para a realização dos estudos de penetração/retenção cutânea foi metanol:água (80:20), visto que esse solvente foi capaz de extrair os componentes antioxidantes do extrato de açaí sem retirar grande quantidade dos compostos inerentes da pele com atividade antioxidante. Por fim, a determinação da inibição da quimioluminescência gerada no sistema xantina/luminol/xantina oxidase mostrou-se um método importante na medida da atividade antioxidante de extratos na pele. Ainda, esse método foi eficaz na quantificação do extrato de açaí nos estudos de penetração/retenção com célula de difusão vertical, apesar de todos os erros inerentes desse método. / The excessive exposure to UV radiation is able to decrease the antioxidant defense systems in the skin leading to the oxidative stress. Thus, plant extracts, rich in antioxidant compounds, are strong candidates to be added in topical formulations for the prevention or treatment of UV radiation induced damages. Among the range of plant extracts with biological activity, the extract of açai, fruit of the Euterpe olerecea Mart. species has become known due to the considerable amount of antioxidants in its composition. Generally, the amount of active compounds that can penetrate in the skin is low requiring sensitive analytical methods. Thus, the present study aimed to evaluate the use of chemiluminescence assay for the quantification of the penetration of açai extract components in the skin by measuring the antioxidant activity. The results showed an IC50 value of 0.63 ?g/mL for the antioxidant activity determined by chemiluminescence assay using the xanthine/luminol/xanthine oxidase system. Moreover, the quantification of acai extract using this method was possible for percentages of inhibition obtained until the 60% of inhibition value. Additionally, this method proved to be precise and accurate in determining the percentage of chemiluminescence inhibition of acai extract at concentrations values close to the IC50 value. Additionally, it was observed that the inhibition was not influenced by the different components of the formulations studied. However, the use of chemiluminescence assay to quantify the penetration of water-soluble extract antioxidant components makes the extraction process of these components from the skin an important step in which the selection of the extractor solvent is a critical point. In the present study it was selected methanol:water (80%) as an organic extractor solvent which was able to extract the antioxidant components of the acai extract without removing large amounts of inherent compounds of the skin with antioxidant activity. Finally, the determination of the chemiluminescence generated in the xanthine/luminol/xanthine oxidase system inhibition showed to be an important method for the measurement of the antioxidant activity of plant extracts in the skin. Still, this method was effective in quantifying the acai extract in cutaneous penetration/retention studies using vertical diffusion cells despite all the intrinsic errors of this used method.

A exposição excessiva às radiações UV é capaz de limitar a capacidade dos sistemas de defesa antioxidante em nosso organismo, provocando o estresse oxidativo. Assim, extratos vegetais ricos em compostos antioxidantes são fortes candidatos a serem veiculados em formulações tópicas para a prevenção ou tratamento dos danos causados pela RUV na pele. Dentre a gama de extratos vegetais com atividade biológica, o extrato de açaí, fruto da espécie Euterpe olerecea Mart., tem se destacado por apresentar grande quantidade de antioxidantes na sua composição. Geralmente, a quantidade de ativos que consegue penetrar na pele é pequena, exigindo métodos analíticos muito sensíveis. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o emprego do método de quimioluminescência para a quantificação da penetração dos componentes do extrato de açaí na pele por medida da atividade antioxidante. Os resultados mostraram que o IC50 do extrato de açaí para o ensaio de inibição da quimioluminescência gerada no sistema xantina/luminol/xantina oxidase foi de 0,63 ?g/mL. Além disso, a quantificação do extrato de açaí utilizando esse método foi possível para porcentagens de inibição obtidas até o valor de 60%. Ainda, esse método mostrou-se preciso e exato na determinação da porcentagem de inibição da quimioluminescência do extrato de açaí na concentração próxima a IC50, sendo essa inibição não influenciada pelos componentes das diferentes formulações estudadas. No entanto, o uso da quimioluminescência como um método de quantificação da penetração de componentes antioxidantes de extratos hidrossolúveis torna o processo de extração desses componentes da pele um fator importante, no qual a escolha do solvente extrator é um ponto crítico. Assim, o solvente extrator escolhido para a realização dos estudos de penetração/retenção cutânea foi metanol:água (80:20), visto que esse solvente foi capaz de extrair os componentes antioxidantes do extrato de açaí sem retirar grande quantidade dos compostos inerentes da pele com atividade antioxidante. Por fim, a determinação da inibição da quimioluminescência gerada no sistema xantina/luminol/xantina oxidase mostrou-se um método importante na medida da atividade antioxidante de extratos na pele. Ainda, esse método foi eficaz na quantificação do extrato de açaí nos estudos de penetração/retenção com célula de difusão vertical, apesar de todos os erros inerentes desse método. / The excessive exposure to UV radiation is able to decrease the antioxidant defense systems in the skin leading to the oxidative stress. Thus, plant extracts, rich in antioxidant compounds, are strong candidates to be added in topical formulations for the prevention or treatment of UV radiation induced damages. Among the range of plant extracts with biological activity, the extract of açai, fruit of the Euterpe olerecea Mart. species has become known due to the considerable amount of antioxidants in its composition. Generally, the amount of active compounds that can penetrate in the skin is low requiring sensitive analytical methods. Thus, the present study aimed to evaluate the use of chemiluminescence assay for the quantification of the penetration of açai extract components in the skin by measuring the antioxidant activity. The results showed an IC50 value of 0.63 ?g/mL for the antioxidant activity determined by chemiluminescence assay using the xanthine/luminol/xanthine oxidase system. Moreover, the quantification of acai extract using this method was possible for percentages of inhibition obtained until the 60% of inhibition value. Additionally, this method proved to be precise and accurate in determining the percentage of chemiluminescence inhibition of acai extract at concentrations values close to the IC50 value. Additionally, it was observed that the inhibition was not influenced by the different components of the formulations studied. However, the use of chemiluminescence assay to quantify the penetration of water-soluble extract antioxidant components makes the extraction process of these components from the skin an important step in which the selection of the extractor solvent is a critical point. In the present study it was selected methanol:water (80%) as an organic extractor solvent which was able to extract the antioxidant components of the acai extract without removing large amounts of inherent compounds of the skin with antioxidant activity. Finally, the determination of the chemiluminescence generated in the xanthine/luminol/xanthine oxidase system inhibition showed to be an important method for the measurement of the antioxidant activity of plant extracts in the skin. Still, this method was effective in quantifying the acai extract in cutaneous penetration/retention studies using vertical diffusion cells despite all the intrinsic errors of this used method.

O peroxinitrito é um oxidante versátil, sendo responsável por oxidações uni e bieletrônicas, adições nucleofílicas, nitrações, nitrosações, hidroxilações e geração de oxigênio singlete, possuindo papéis fisiológicos e deletérios. Estudos de EPR captação de spin mostraram que compostos carbonílicos podem sofrer abstração de um elétron por peroxinitrito, seguida de consumo de oxigênio e quimiluminescência; p.ex., isobutiraldeído (IBAL), acetoacetona (AA), 3-metilacetoacetpna (MAA), etil acetoacetato (EAA), etil 2-metilacetoacetato (EMAA) e succinilacetona (SA). A emissão de luz é provavelmente devida à espécies excitadas tripletes, formadas a partir da termólise de intermediários dioxetânicos. Os perfis de pH obtidos por consumo total de oxigênio e quimiluminescência em tampão fosfato, apontam o ânion peroxinitrito como oxidante e a forma enólica dos compostos carbonílicos como substratos. A análise de produtos sugere a ocorrência de uma reação em cadeia na presença de oxigênio. Estas reações podem ter importante papel biológico, considerando-se que (i) compostos carbonílicos são ubíquos em sistemas biológicos em condições fisiológicas e patológicas, (ii) peroxinitrito está relacionado a respostas fisiológicas e patológicas, (iii) carbonilas tripletes podem ser vistas como radicais alcoxil e, dessa forma, possuir papel deletério a biomoléculas. / Peroxynitrite displays an ample repertoire of chemical reactions -one- and two-electron oxidations, nucleophilic addition, nitration, nitrosation, hydroxylation, and singlet oxygen generation conferring it cell toxicity and signalling properties. Carbonyl compounds were shown by EPR spin-trapping to suffer one-electron abstraction by peroxynitrite, which is followed by oxygen consumption and chemiluminescence; e.g., isobutyraldehyde (IBAL), acetoacetone (AA), 3-methylacetoacetone (MAA), ethyl acetoacetate (EAA), ethyl 2-methylacetoacetate (EMAA) and succinylacetone (SA). Light emission probably arises from triplet species formed by the thermolysis of dioxetane intermediates. The pH profiles traced for oxygen uptake ·and chemiluminescence in phosphate buffer point to peroxynitrite anion as the oxidant and enolized carbonyls as the actual substrates. Product analysis suggests that a chain reaction occurs in the presence of oxygen. These reactions may play important biological roles considering that (i) carbonyl compounds are ubiquitous in biological systems under physiological and pathological conditions; (ii) peroxynitrite has been implicated in cell toxicity and signalling; (iii) triplet carbonyls may be viewed as alkoxyl radicals and, therefore, play a deleterious role in biomolecules.

O peroxinitrito é um oxidante versátil, sendo responsável por oxidações uni e bieletrônicas, adições nucleofílicas, nitrações, nitrosações, hidroxilações e geração de oxigênio singlete, possuindo papéis fisiológicos e deletérios. Estudos de EPR captação de spin mostraram que compostos carbonílicos podem sofrer abstração de um elétron por peroxinitrito, seguida de consumo de oxigênio e quimiluminescência; p.ex., isobutiraldeído (IBAL), acetoacetona (AA), 3-metilacetoacetpna (MAA), etil acetoacetato (EAA), etil 2-metilacetoacetato (EMAA) e succinilacetona (SA). A emissão de luz é provavelmente devida à espécies excitadas tripletes, formadas a partir da termólise de intermediários dioxetânicos. Os perfis de pH obtidos por consumo total de oxigênio e quimiluminescência em tampão fosfato, apontam o ânion peroxinitrito como oxidante e a forma enólica dos compostos carbonílicos como substratos. A análise de produtos sugere a ocorrência de uma reação em cadeia na presença de oxigênio. Estas reações podem ter importante papel biológico, considerando-se que (i) compostos carbonílicos são ubíquos em sistemas biológicos em condições fisiológicas e patológicas, (ii) peroxinitrito está relacionado a respostas fisiológicas e patológicas, (iii) carbonilas tripletes podem ser vistas como radicais alcoxil e, dessa forma, possuir papel deletério a biomoléculas. / Peroxynitrite displays an ample repertoire of chemical reactions -one- and two-electron oxidations, nucleophilic addition, nitration, nitrosation, hydroxylation, and singlet oxygen generation conferring it cell toxicity and signalling properties. Carbonyl compounds were shown by EPR spin-trapping to suffer one-electron abstraction by peroxynitrite, which is followed by oxygen consumption and chemiluminescence; e.g., isobutyraldehyde (IBAL), acetoacetone (AA), 3-methylacetoacetone (MAA), ethyl acetoacetate (EAA), ethyl 2-methylacetoacetate (EMAA) and succinylacetone (SA). Light emission probably arises from triplet species formed by the thermolysis of dioxetane intermediates. The pH profiles traced for oxygen uptake ·and chemiluminescence in phosphate buffer point to peroxynitrite anion as the oxidant and enolized carbonyls as the actual substrates. Product analysis suggests that a chain reaction occurs in the presence of oxygen. These reactions may play important biological roles considering that (i) carbonyl compounds are ubiquitous in biological systems under physiological and pathological conditions; (ii) peroxynitrite has been implicated in cell toxicity and signalling; (iii) triplet carbonyls may be viewed as alkoxyl radicals and, therefore, play a deleterious role in biomolecules.

Os neutrófilos desempenham um papel fundamental na defesa do organismo contra microrganismos invasores, através da fagocitose, da degranulação e da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo que esta última é decorrente da ativação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos. As EROs produzidas, tais como O2∙-, H2O2, HO∙, HOCl, 1O2 e NO, que são essenciais para matar os microrganismos fagocitados, podem também ser liberadas para o meio extracelular e causar lesões oxidativas aos tecidos do hospedeiro. Essas lesões têm sido implicadas na patogênese de doenças como aterosclerose, câncer, artrite reumatóide, pneumonia e enfisema pulmonar. Com o intuito de prevenir essas lesões oxidativas, tem-se investigado a atividade antioxidante de diversos compostos, especialmente os derivados de plantas. Neste trabalho foram avaliadas as atividades de oito cumarinas simples (compostos 1 a 8) sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos de coelho estimulados com Zimosan opsonizado, empregando-se os ensaios de quimioluminescência (QL) dependente de lucigenina (QLluc) e de QL dependente de luminol (QLlum). A QLluc reflete a produção apenas de O2∙- , enquanto que a QLlum é resultante da oxidação do luminol pelas diversas EROs produzidas pelos neutrófilos estimulados. Assim, a inibição da QLluc e da QLlum será decorrente da redução da concentração das EROs responsáveis pela oxidação da lucigenina e do luminol no meio de reação, respectivamente. Foram avaliadas também a atividade dos antioxidantes a-tocoferol, butil-hidroxitolueno (BHT) e quercetina sobre a QLlum e a QLluc, e a toxicidade das cumarinas 1 a 8 e dos três antioxidantes citados sobre os neutrófilos de coelho. Determinou-se o coeficiente de partição e o volume molecular das cumarinas 1 a 8. Dentre os três antioxidantes, observou-se que a quercetina inibiu tanto a QLlum quanto a QLluc, e não foi tóxica para os neutrófilos, na concentração de 50 mmol/L. O a-tocoferol não inibiu a QLlum nem a QLluc, enquanto o BHT foi tóxico para os neutrófilos de coelho. Para as cumarinas simples, observou-se que: (1) a cumarina 1 não apresentou atividade inibitória sobre a QLluc e sobre a QLlum; (2) as cumarinas 3, 4, 5 e 6 tiveram atividades inibitórias sobre a QLluc semelhantes à da quecetina, que foram maiores que as das cumarinas 2, 7 e 8; (3) as atividades inibitórias das cumarinas 2 a 8 sobre a QLluc não estão relacionadas à lipofilicidade e ao volume molecular desses compostos, nem à toxicidade dos mesmos sobre os neutrófilos de coelho; (4) as cumarinas 3 e 4 provocaram aumento da QLlum medida, enquanto as demais não tiveram atividade neste sistema. / Neutrophils play a crucial role in the defense of the organism against invading microorganisms, thorough phagocytosis, degranulation and generation of reactive oxygen species (EROS). The last one is a consequence of activation of neutrophils\' oxidative metabolism. The produced EROs, such as O2∙-, H2O2, HOCl, HO∙, 1O2 and NO, which are essential for killing phagocyted microorganisms, may also be released to the extracellular milieu and inflict oxidative damage to host tissues. This damage has been implicated in the pathogenesis of diseases, such as arteriosclerosis, cancer, rheumatoid arthritis, pneumonia and lung emphysema. The antioxidant activity of many compounds, especially those obtained from plants, has been investigated with the aim of avoid such oxidative damage. In this work, we studied the activity of eight simple coumarins (compounds 1 to 8) on the oxidative metabolism of rabbit neutrophils upon stimulation by opsonized zymosan, using luminol- (QLlum) and lucigenin (QLluc)-enhanced chemiluminescence (QL) assays. QLluc reflects generation of O2∙- only, whereas QLlum is a result of luminol oxidation by the various EROs produced by the stimulated neutrophils. Inhibition of QLluc and of QLlum will be a consequence of the decrease of the concentration of that EROs which are involved in the oxidation of lucigenin and luminol, respectively, in the reaction medium. We also evaluated the activity of the antioxidants a-tocopherol, butyl-hydroxytoluene (BHT) and quercetin on QLlum and QLluc, and the toxicity of coumarins 1 to 8 and the three antioxidants on rabbit neutrophils. Partition coefficient and molecular volume values of coumarins 1 to 8 were determined. We observed that, among the three antioxidants, quercetin inhibited QLlum and QLluc, and was not toxic to the neutrophils at concentration of 50 mmol/L. BHT was toxic to the rabbit neutrophils whereas a-tocopherol did not inhibit QLlum nor QLluc. For the simple coumarins we observed that: (1) coumarin 1 did not inhibit QLlum nor QLluc; (2) coumarins 3, 4, 5 and 6 had inhibitory effects, which were similar to the quercetin and higher than coumarins 2, 7 and 8; (3) the inhibitory activities of coumarins 2 to 8 on QLluc were not related to the lipophilicity and to the molecular volume of these compounds, nor to their toxicity upon the rabbit neutrophils; (4) coumarins 3 and 4 increased the QLlum, whereas the others had no effect on this system.

Os neutrófilos desempenham um papel fundamental na defesa do organismo contra microrganismos invasores, através da fagocitose, da degranulação e da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo que esta última é decorrente da ativação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos. As EROs produzidas, tais como O2∙-, H2O2, HO∙, HOCl, 1O2 e NO, que são essenciais para matar os microrganismos fagocitados, podem também ser liberadas para o meio extracelular e causar lesões oxidativas aos tecidos do hospedeiro. Essas lesões têm sido implicadas na patogênese de doenças como aterosclerose, câncer, artrite reumatóide, pneumonia e enfisema pulmonar. Com o intuito de prevenir essas lesões oxidativas, tem-se investigado a atividade antioxidante de diversos compostos, especialmente os derivados de plantas. Neste trabalho foram avaliadas as atividades de oito cumarinas simples (compostos 1 a 8) sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos de coelho estimulados com Zimosan opsonizado, empregando-se os ensaios de quimioluminescência (QL) dependente de lucigenina (QLluc) e de QL dependente de luminol (QLlum). A QLluc reflete a produção apenas de O2∙- , enquanto que a QLlum é resultante da oxidação do luminol pelas diversas EROs produzidas pelos neutrófilos estimulados. Assim, a inibição da QLluc e da QLlum será decorrente da redução da concentração das EROs responsáveis pela oxidação da lucigenina e do luminol no meio de reação, respectivamente. Foram avaliadas também a atividade dos antioxidantes a-tocoferol, butil-hidroxitolueno (BHT) e quercetina sobre a QLlum e a QLluc, e a toxicidade das cumarinas 1 a 8 e dos três antioxidantes citados sobre os neutrófilos de coelho. Determinou-se o coeficiente de partição e o volume molecular das cumarinas 1 a 8. Dentre os três antioxidantes, observou-se que a quercetina inibiu tanto a QLlum quanto a QLluc, e não foi tóxica para os neutrófilos, na concentração de 50 mmol/L. O a-tocoferol não inibiu a QLlum nem a QLluc, enquanto o BHT foi tóxico para os neutrófilos de coelho. Para as cumarinas simples, observou-se que: (1) a cumarina 1 não apresentou atividade inibitória sobre a QLluc e sobre a QLlum; (2) as cumarinas 3, 4, 5 e 6 tiveram atividades inibitórias sobre a QLluc semelhantes à da quecetina, que foram maiores que as das cumarinas 2, 7 e 8; (3) as atividades inibitórias das cumarinas 2 a 8 sobre a QLluc não estão relacionadas à lipofilicidade e ao volume molecular desses compostos, nem à toxicidade dos mesmos sobre os neutrófilos de coelho; (4) as cumarinas 3 e 4 provocaram aumento da QLlum medida, enquanto as demais não tiveram atividade neste sistema. / Neutrophils play a crucial role in the defense of the organism against invading microorganisms, thorough phagocytosis, degranulation and generation of reactive oxygen species (EROS). The last one is a consequence of activation of neutrophils\' oxidative metabolism. The produced EROs, such as O2∙-, H2O2, HOCl, HO∙, 1O2 and NO, which are essential for killing phagocyted microorganisms, may also be released to the extracellular milieu and inflict oxidative damage to host tissues. This damage has been implicated in the pathogenesis of diseases, such as arteriosclerosis, cancer, rheumatoid arthritis, pneumonia and lung emphysema. The antioxidant activity of many compounds, especially those obtained from plants, has been investigated with the aim of avoid such oxidative damage. In this work, we studied the activity of eight simple coumarins (compounds 1 to 8) on the oxidative metabolism of rabbit neutrophils upon stimulation by opsonized zymosan, using luminol- (QLlum) and lucigenin (QLluc)-enhanced chemiluminescence (QL) assays. QLluc reflects generation of O2∙- only, whereas QLlum is a result of luminol oxidation by the various EROs produced by the stimulated neutrophils. Inhibition of QLluc and of QLlum will be a consequence of the decrease of the concentration of that EROs which are involved in the oxidation of lucigenin and luminol, respectively, in the reaction medium. We also evaluated the activity of the antioxidants a-tocopherol, butyl-hydroxytoluene (BHT) and quercetin on QLlum and QLluc, and the toxicity of coumarins 1 to 8 and the three antioxidants on rabbit neutrophils. Partition coefficient and molecular volume values of coumarins 1 to 8 were determined. We observed that, among the three antioxidants, quercetin inhibited QLlum and QLluc, and was not toxic to the neutrophils at concentration of 50 mmol/L. BHT was toxic to the rabbit neutrophils whereas a-tocopherol did not inhibit QLlum nor QLluc. For the simple coumarins we observed that: (1) coumarin 1 did not inhibit QLlum nor QLluc; (2) coumarins 3, 4, 5 and 6 had inhibitory effects, which were similar to the quercetin and higher than coumarins 2, 7 and 8; (3) the inhibitory activities of coumarins 2 to 8 on QLluc were not related to the lipophilicity and to the molecular volume of these compounds, nor to their toxicity upon the rabbit neutrophils; (4) coumarins 3 and 4 increased the QLlum, whereas the others had no effect on this system.