A tuberculose (TB) é uma doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis. De acordo com estimativas da Organização Mundial da Saúde, a tuberculose é responsável pela morte de ~2 a 3 milhões de pessoas/ano no mundo e nos próximos 15 anos cerca de 1 bilhão de pessoas deverão ser infectadas, e destas, aproximadamente 35 milhões deverão morrer. Apesar de existirem vários medicamentos sendo utilizados no tratamento da doença, constatasse o crescimento no número de casos devido, principalmente, às variedades resistentes do M. tuberculosis. Considerando-se o aparecimento de cepas resistentes em TB, recomenda-se que novos medicamentos e/ou alvos biológicos alternativos devam ser intensivamente pesquisados. A ribonucleotídeo redutase (RNR), por exemplo, é uma proteína de interesse, pois catalisa uma etapa importante e única na síntese de novo dos dNTPs, reduzindo o ribonucleosídeo 5\' -difosfato ao seu correspondente desoxirribonucleosídeo 5\' -difosfato. A RNR é importante na síntese do DNA, e portanto, na divisão das células. Esta enzima importante, que possuí 16% de homologia com a RNR de mamíferos, é um alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos, com provável aplicação no tratamento do câncer, da malária e do tripanossoma. Sabe-se que diferentes classes de compostos, através de diferentes mecanismos de ação, inibem a RNR, incluindo as α-(N)-heterocíclicas carboxaldeído tiossemicarbazonas, um dos inibidores mais potentes da RNR. Sabe-se que alguns derivados da tiossemicarbazona, inibidoras da RNR de células tumorais, apresentam atividade frente o M. tuberculosis atuando provavelmente através do mesmo mecanismo, envolvendo a inibição da correspondente RNR. Neste contexto, nesta tese de doutorado, foram aplicadas diferentes abordagens de QSAR/QSAR-3D no estudo de 40 derivados da 2-piridino-carboxaldeído tiossemicarbazona, inibidores da RNR de células H.Ep.-2, retirados de literatura selecionada (French & Blanz-Jr. 1974). Estes compostos foram divididos em cinco séries, a saber: séries A, B, C, D, e E contendo, respectivamente, 40, 39, 30, 23 e 22 compostos, na tentativa de tornar estas séries estruturalmente mais homogêneas. Para cada série, foram criados três grupos de treinamento e os respectivos grupos de teste (I, II e III), visando-se avaliar o poder de predição dos modelos gerados através das análises de QSAR/QSAR-3D. Para as análises de QSAR clássico, foram utilizados como variáveis independentes, os descritores mais relevantes gerados através do programa DRAGON e, pré-selecionados por PLS. Considerando-se a ausência de informações sobre a estrutura cristalográfica da enzima RNR do M. tuberculosis, os estudos de QSAR-3D foram iniciados empregando-se metodologias propostas em CoMFA e, em CoMSIA, implementadas no programa SYBYL. Além destas, foi realizada a modelagem por homologia da RNR do M. tuberculosis, utilizando-se o programa WHATIF. Para as abordagens CoMFA e CoMSIA as geometrias otimizadas através do método semi-empírico AM1 foram alinhadas átomo-a-átomo e, através da similaridade dos respectivos campos estéricos e eletrostáticos, utilizando-se o programa SEAL. Nos dois procedimentos a geometria do composto não substituído, um dos mais ativos na série, foi utilizada como molde considerando-se a ausência de informações sobre a conformação bioativa. A modelagem da RNR por homologia foi realizada utilizando-se como molde as estruturas cristalográficas, respectivamente, do C. ammoniagenes (código PDB 1KGN) e da S. typhimurium (código PDB 1R2F), sambas apresentando valores de identidade superior a 65%. Mais recentemente foram publicados os dados cristalográficos para a cadeia beta (subunidade menor) da RNR do M. tuberculosis (código PDB 1UZR). Os modelos CoMFA e CoMSIA gerados apresentaram valores aceitáveis para os coeficientes de correlação de predição, com altos valores para os coeficientes de correlação ajustados e baixos valores para os erros padrões. Os melhores modelos CoMFA e CoMSIA foram obtidos considerando o grupo com substituintes apenas na posição 5 do anel piridínico. Razoáveis coeficientes de correlação de predição para os modelos CoMSIA com altos coeficientes de correlação de ajuste e baixos valores para os erros padrões forma obtidos. Os mapas de contorno gerados em CoMFA e CoMSIA sugerem que grupos aceptores de ligações de hidrogênio próximos ao nitrogênio do anel piridínico deverá aumentar o valor da atividade inibitória. Esta observação está em boa concordância com os dados da literatura, na qual a formação de um complexo entre a TSC e o íon Ferro foi sugerido para a inibição da RNR. Estes estudos deverão permitir um melhor entendimento sobre as características estruturais desta classe de TSC inibidoras da RNR, como agentes antitumorais, em termos dos campos estéricos, eletrostáticos, hidrofóbico, doador e aceptor de ligações de hidrogênio, bem como a contribuição para o desenvolvimento racional de novos inibidores para esta importante enzima. Adicionalmente, dois compostos preparados em nosso laboratório, demonstraram atividade frente o M. tuberculosis, em testes realizados in vivo. / Tuberculosis is an illness caused by Mycobacterium tuberculosis. Data from World Health Organization (WHO) estimates, that about 2-3 millions of human population died by Mycobacterium tuberculosis infection and that during the next 15 years about 1 billion will be infected and 35 million will certainly die. Although, in the clinic it was found several antiTBdrugs, these numbers will increase due several reasons including M. tuberculosis resistant strains. It has been stressed the importance of novel medicines and/or alternative biological targets research projects. It is known that Ribonucleotide reductase (RNR), is an enzyme that catalyses the rate limiting step in the de novo synthesis of dNTPs, reducing the ribonucleoside 5\'-diphosphates to the corresponding deoxyribonuc1eoside 5\' -diphosphates. RNR has a critical role in the DNA synthesis and, hence, cell division. This key enzyme, that shows 16% homology when compared with mammals RNR, is a potential target for drug design of cell growth inhibitors, with potential application in cancer therapy, antimalaria and trypanosome chemotherapy. It is known that different types of compounds or species by means of different mechanism pathways can show RNR inhibition, including α-(N)-heterocyclic carboxaldehydes thiosemicarbazones that are one of the most potent classes of RNR inhibitors. More than that, some of them, that shows activity against M. tuberculosis seems to follow the same mechanism pathways proposed to the thiosemicarbazones tumor cells activity that means, that they probably are RNR inhibitors. In this study, a series of 40 α-(N)-2-formyl-pyridine thiosemicarbazone derivatives tested against RNR of H.ep.-2-cells (human epidermoid carcinoma), taken from selected literature (French & Blanz-Jr. 1974), has quantitatively analyzed by means of several QSAR/3D-QSAR approaches. These compounds were divided into 5 individual subsets, namely A, B, C, D, and E, having 40, 39, 30, 23 e 22 compounds, respectively. This procedure has been done in order to achieve more structurally homogeneous subsets. For each set, three individual training and test sets (I,II and III) have been created in order to evaluate the predictivity power of the generated QSAR/3D-QSAR models. QSAR analysis have been done using descriptors generated by DRAGON program that have been further pre-selected by PLS procedures. Considering that crystallographic data of RNR M. tuberculosis are not available in the literature, 3D-QSAR studies have been done these applying, initially, CoMFA and CoMSIA approaches, implemented in SYBYL. Homology model studies have been performed with WHATIF program CoMFA e CoMSIA approaches used optimized geometry obtained by semi-empirical AM1 methods that have been aligned by two different methods. Rigid alignment, in which the compounds were fitted atom-by-atom onto a template, based on the root mean square fit. The N(l) and C(2) atoms of the pyridine moiety and the heavy atoms of thiosemicarbazone backbone of TSC were used as template structure. (2) Field based, in which the steric and electrostatic fields, generated by the SEAL program were considered in the alignment. In both procedures the unsubstituted 2-formylpyridine thiosemicarbazone in its syn conformation, has been taken as template. Homology RNR models were done using as template crystallographic data of ammoniagenes (1KGN) and S. typhimurium (1R2F) as template, respectively, with identity larger than 65%. More recent1y new crystallographic data have been published for the beta chain (smaller subunity) of RNR do M. tuberculosis (1UZR). CoMFA and CoMSIA generated models showed acceptable predictive correlation coefficients with high fitted correlation coefficients and low standard errors. Betler CoMFA and CoMSIA models have been derived considering a homogeneous subset of TSC substituted only at 5-position in pyridine ring. Reasonable predictive correlation coefficients for CoMSIA models with high fitted correlation coefficients and very low standard errors were obtained. The derived CoMFA and CoMSIA countour maps suggested that a hydrogen bond acceptor near the nitrogen pyridine ring could enhance inhibitory activity value. This observation is in good agreement with literature, in which a complex formation between TSC and iron ion has been suggested, to RNR inhibition. These studies are expected to enhance the understanding of the structural features of this class of TSC-RNR inhibitors as antitumor agents in terms of steric, electrostatic, hydrophobic and hydrogen donor and acceptor fields as well as to contribute to rational design of inhibitors of this key enzyme. Additionally, two compounds that have been prepared by us showed activity against M. tuberculosis using in vivo test system.

INTRODUÇÃO: Quimiorradioterapia (QRT) concomitante adjuvante aumenta a sobrevida livre de doença (SLD) em pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECCP) de alto risco operados com intenção curativa, porém está associada a toxicidade não desprezível e seu impacto na sobrevida global (SG) é incerto. ERCC1 (Excision Repair Cross Complementing Group 1) é uma proteína com função crítica no reparo de DNA por excisão de nucleotídeos (NER) e está envolvido na resistência à quimio- e radioterapia. Neste trabalho tivemos como objetivos determinar a expressão da proteína ERCC1, a expressão do RNA mensageiro (mRNA) de ERCC1 e a ocorrência do polimorfismo de nucleotídeo único T19007C de ERCC1 em pacientes portadores de CECCP de alto risco, operados e tratados com QRT adjuvante, bem como o valor prognóstico destes marcadores. MÉTODOS: Trata-se de um estudo retrospectivo em pacientes portadores de CEC de cavidade oral, orofaringe, hipofaringe ou laringe, operados com intenção curativa e portadores de doença de risco alto ou intermediário. Pacientes elegíveis haviam sido tratados com QRT adjuvante: 60-70 Gy e cisplatina concomitante (100 mg/m2, dias 1, 22 e 43), não apresentavam metástases a distância e nem sinais de recidiva após cirurgia. A expressão da proteína ERCC1 foi avaliada por imunohistoquímica, através de um escore H semiquantitativo, obtido pelo produto da intensidade da coloração nuclear (0-3) pelo escore proporcional atribuído à porcentagem estimada de núcleos corados (0;0,1;0,5;1). O método da transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real quantitativo foi utilizado para determinação da expressão do mRNA de ERCC1 em tecido de tumor primário, normalizada em relação à expressão da fração 18S do RNA ribossomal. Genotipagem de ERCC1 (códon 118) foi realizada por PCR - polimorfismo do tamanho do fragmento de restrição a partir de DNA genômico extraído de linfonodos normais destes pacientes, após digestão com BsrDI. RESULTADOS: 69 pacientes com idade mediana de 56a, sendo 81% homens, foram estudados. Em relação à neoplasia, os sítios primários observados foram: cavidade oral (41%), laringe (32%), hipofaringe (16%) e orofaringe (12%), com estadio III 14% e estadio IV 86%, sendo pT3-pT4 78% e pN2-pN3 58%. Quarenta e três pacientes apresentaram-se com pelo menos dois linfonodos positivos, 27 com extravazamento extracapsular da metástase linfonodal e 18 com margens positivas. Achados de alto risco foram detectados em 40 pacientes (58%). No seguimento mediano de 47 meses, observou-se 11 recidivas loco-regionais, sete recidivas a distância, 10 casos com segundo tumor primário (sendo quatro com primário em pulmão e quatro em esôfago) e 30 óbitos (22 pela doença). A taxa de SG em 5 anos foi 40% e a taxa de SLD em 5 anos foi 31%. Escore H superior a 1,5 foi encontrado em 32 pacientes (54%), os quais apresentaram melhor taxa de sobrevida global em 5 anos (50% versus 18%, HR 0,43, 95%CI 0,20-0,90, p=0,026). Quinze pacientes (33%), dos 45 analisados, apresentaram elevada expressão do mRNA de ERCC1 (> 3,1) e estes pacientes tiveram melhor taxa de sobrevida global em 5 anos em comparação com aqueles com baixa expressão (86% versus 31%, HR 0,26, 95%CI 0,14-1,01, p=0,052). A distribuição dos genótipos de ERCC1 no códon 118 em 49 pacientes foi 39% C/T, 37% C/C, e 24% T/T. Não foi encontrada associação significativa entre idade, sexo, estadiamento e achados anatomopatológicos de risco, e os polimorfismos genéticos no códon 118 de ERCC1 ou a expressão do mRNA de ERCC1. Não houve diferença entre os genótipos C/C, C/T e T/T seja em termos taxa de sobrevida global em 5 anos (45%, 46%, 46%; p=0,808), seja em termos de taxa de sobrevida livre de doença em 5 anos (31%, 34%, 20%, p=0,770, respectivamente). O escore H (> 1,5 versus 1,5; HR ajustado 0,20, 95%CI 0,07-0,57, p=0,003) e a expressão normalizada do mRNA de ERCC1 (> 3,1 versus 3,1; HR ajustado 0,12, 95%CI 0,03-0,59, p=0,009), permaneceram significantes do ponto de vista estatístico, como fatores prognósticos na análise multivariada. CONCLUSÕES: Alta expressão imunohistoquímica da proteína ERCC1 e alta expressão do mRNA de ERCC1 conferem melhor prognóstico em pacientes portadores de CECCP operados de alto risco tratados com QRT adjuvante baseada em cisplatina. O polimorfismo genético T19007C de ERCC1 não apresentou valor prognóstico nestes pacientes. / BACKGROUND: Adjuvant concurrent chemoradiation (CRT) improves diseasefree survival (DFS) in patients diagnosed with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) presenting with high-risk features treated with surgery with curative intent, but treatment-related toxicity is not negligible and its impact on overall survival (OS) is uncertain. ERCC1 (Excision Repair Cross Complementing Group 1) is a protein with a critical role in the nucleotide excision repair (NER) pathway, associated with resistance to chemo- and radiation therapy. We aimed here to study ERCC1 protein expression, ERCC1 messenger RNA (mRNA) expression and the single nucleotide polymorphism T19007C of ERCC1 as prognostic markers in HNSCC patients presenting with high-risk features treated with surgery and adjuvant CRT. METHODS: It is a retrospective study in patients with oral cavity, oropharynx, hypopharynx or larynx SCC submitted to radical surgery with curative intent and presenting with pathologic features of high- or intermediate-risk. Eligible patients were treated with adjuvant CRT: 60-70 Gy and concurrent cisplatin (100 mg/m2, days 1, 22 and 43), with no distant metastasis and no relapsed disease after surgery. ERCC1 protein expression was evaluated by immunohistochemistry, using a semi-quantitative H-score, calculated by multiplying the nuclear staining intensity (0-3) by the proportion score attributed to the percentage of positive tumor nuclei (0;0,1;0,5;1). Quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) assay was performed to determine ERCC1 mRNA expression in primary tumors tissue specimens. The ERCC1 mRNA expression was normalized using 18S fraction of ribosomal RNA expression as internal reference. ERCC1 (codon 118) genotypes were detected using PCR restriction fragment length polymorphism method carried out in genomic DNA extracted from normal lymph nodes. The PCR products were digested with BsrDI. RESULTS: 69 patients (median age 56 y, 81% male) were studied. Regarding tumor characteristics, primary sites were: oral cavity 41%, larynx 32%, hypopharynx 16%, oropharynx 12%, stage III 14%, stage IV 86%, pT3- pT4 78% and pN2-pN3 58%. Forty-three patients presented with two or more positive lymph nodes, 27 with extracapsular spread of nodal disease and 18 with positive margins. High-risk pathologic features were detected in 40 patients (58%). During the median follow-up of 47 months, we observed 11 locoregional relapses, seven distant relapses, 10 patients were diagnosed with secondary primary tumors (four in lungs and four in esophagus) and 30 deaths (22 disease-related). The 5-year overall survival rate was 40% and the 5-year disease-free survival rate was 31%. High H-score (> 1.5) was seen in 32 patients (54%), who presented better 5-year overall survival rate in comparison to those with lower H-scores (50% versus 18%, HR 0.43, 95%CI 0.20-0.90, p=0.026). Fifteen patients (out of 45, 33%) whose tumors presented normalized ERCC1 expression > 3.1 were classified as having high ERCC1 mRNA expression, and these patients presented better 5-year overall survival rate in comparison to those with lower ERCC1 mRNA expression (86% versus 30%, HR 0.26, 95%CI 0.14-1.01, p=0.052). Genotype distribution at ERCC1 codon 118 in 49 patients was 39% C/T, 37% C/C, and 24% T/T. No significant association was found between age, gender, stage, grading and pathological risk features and ERCC1 codon 118 genotypes or ERCC1 mRNA expression. No difference was detected among C/C, C/T and T/T genotypes, either in terms of 5-year overall survival rates (45%, 46%, 46%; p=0.808), or 5-year diseasefree survival rate (31%, 34%, 20%, p=0.770, respectively). H-score (> 1.5 versus 1.5; adjusted HR 0.20, 95%CI 0.07-0.57, p=0.003) and ERCC1 mRNA normalized expression (> 3.1 versus 3.1; adjusted HR 0.12, 95%CI 0.03-0.59, p=0.009), remained significant as favorable prognostic factors after adjusting for prognostic factors in a multivariate analysis. CONCLUSIONS: High immunohistochemical expression of ERCC1 protein and high ERCC1 mRNA expression, but not the T19007 single nucleotide polymorphism, were associated with better prognosis in HNSCC patients submitted to surgery and adjuvant cisplatin-based chemoradiation.

El sistema TK/GCV es, problamente, la estrategia suicida mejor caracterizada hasta el momento. No obstante, se desconocen muchos aspectos relacionados con su mecanismo de acción. Con el objetivo de indentificar condicionantes de la respuesta TK/GCV, realizamos un estudio comparativo de la expresión de genes y de las vías de señalización que se activan en células sensibles y en células resistentes al tratamiento. Así, pudimos asociar la actividad de la quinasa Chk1, y la expresión de genes involucrados en el control del ciclo celular, con una mayor respuesta al sistema suicida. Así mismo, determinamos que la combinación de TK/GCV con el inhibidor de Chk1 UCN-01 produce un efecto antagónico en las células sensibles a TK/GCV. Por otro lado, la terapia combinada capaz de lisar las células e inducir muerte celular por fosforilación de GCV, en un único agente (ICOVIR11), resultó en una potenciación de sus efectos citotóxicos, permitiendo la compensación de la pérdida de potencia secundaria al uso de un promotor selectivo de tumor. Más aún, la expresión de TK como gen tardío de ICOVIR11,permitió la monitorización in vivo y de manera no invasiva, de la actividad TK y la replicación viral. / Although extensively characterized, the paradigmatic suicide system TK/GCV conceals the details of its ultimate mechanism of action. In order to shed some light on this issue, we conducted a series of experiments with resistant and sensitive cell lines, allowing us to identify cell cyclerelated genes that are deregulated in cells with induced resistance to TK/GCV. In addition, the association of Chk1 activation with a greater sensitivity to TK/GCV, pointed out the relevance of the cell cycle status at the moment of receiving the treatment, and its control in response to genotoxic insults. Treatment with a Chk1 inhibitor induced, in sensitive cells, an antagonistic effect on TK/GCV cytotoxicity. On the other hand, single-agent combination therapy of TK/GCV with adenoviral lysis resulted in enhanced cytotoxicity. In this setting the expression of TK as a late gene in an oncolytic adenovirus minimized the loss of potency associated to the conditioning of viral replication. On top of that, TK expression allowed for in vivo, real time, non-invasive monitoring of viral replication in mice, and was used to analyze the effects of treatment schedule on treatment outcome.

Introdução: O linfoma difuso de grandes células B é o mais freqüente grupo de linfoma não- Hodgkin, perfazendo quase 50% dos casos no serviço de hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e Instituto do Câncer do Estado de São Paulo. Possui heterogeneidade clínica e biológica traduzida em mais de vinte subtipos na Organização Mundial da Saúde. Sua terapêutica se baseia na associação do anticorpo monoclonal anti-CD20 e quimioterapia com antracíclico, esquema que resulta em 43,5% de sobrevida global em 10 anos. Determinantes de prognóstico clínico como o Índice Internacional de Prognóstico e o Índice Internacional de Prognóstico Revisado carecem de acurácia, pois até 20% dos pacientes de baixo risco falecerão da doença e 60% dos pacientes de alto risco estarão vivos em quatro anos. Essas discrepâncias podem, em parte, ser atribuídas a fatores genéticos. A assinatura gênica do linfoma difuso de grandes células B tipo centro germinativo apresenta sobrevida global superior ao tipo células B ativadas (76% versus 16%, p=0,01), contudo o perfil de expressão gênica por microarray ainda não está disponível na prática clínica. Entretanto, o escore preditivo de mortalidade para linfoma difuso de grandes células B baseado no valor prognóstico da expressão dos genes BCL2, BCL6, CCND2, FN1, LMO2 e SCYA3 por PCR em tempo real quantitativa mostrou-se independente do Índice Internacional de Prognóstico na era pré-rituximabe. Mas não foi significante em pacientes de alto risco clínico tratados com R-CHOP. Os genes BCL2, CCND2 e SCYA3 integram a assinatura de células B ativadas, BCL6 e LMO2 a do centro germinativo e FN1 a linfonodal. Objetivo: Avaliar o impacto da expressão absoluta dos genes BCL2, BCL6, CCND2, FN1, LMO2 e SCYA3 em população brasileira com linfoma difuso de grandes células B tratada com R-CHOP em relação à resposta global, sobrevida livre de doença, sobrevida livre de progressão e sobrevida global. Métodos: A expressão gênica foi analisada por PCR em tempo real quantitativa de RNA extraído de amostras parafinadas de 63 pacientes, porém foi avaliável em 42. Seus valores foram normatizados pelo gene endógeno ABL e transformados em escala logarítmica na base 2 para posterior correlação com variáveis clínicas e de desfecho. Resultados: Com mediana de seguimento de 29 meses, as sobrevidas global, livre de doença e livre de progressão foram, respectivamente, 82,8%, 97,14% e 87,53%, enquanto a resposta completa foi 82,5%. A expressão de LMO2>3logs e BCL6>3,5logs definiu um grupo de maior sobrevida global (91% versus 64,3%, p=0,040) e sobrevida livre de doença (95,5% versus 70,7%, p=0,03), independentemente do Índice Internacional de Prognóstico (p=0,010 e p=0,042) e com significativa hiperexpressão do SCYA3 (p=0,046). Não se observou associação entre escore preditivo de mortalidade baseado nos seis genes e prognóstico. Assim, foi criado novo escore genético prognóstico baseado no poder da expressão concomitante de LMO2 e CCND2, definindo-se grupos de baixo risco (<2,5) e alto risco (>=2,5) com distintas sobrevidas global (92,4% versus 57,1%, p=0,011) e livre de progressão (96,2% versus 66,7%, p=0,013), independentes do IPI. Conclusão: Em pacientes com linfoma difuso de grandes células B tratados com R-CHOP, a hiperexpressão de BCL6, LMO2 e SCYA3 correlacionou-se com melhor prognóstico. O novo escore genético prognóstico definido por LMO2 e CCND2 estratificou grupos de risco de prognósticos distintos independentes do Índice Internacional de Prognóstico / Introduction: Diffuse large B-cell lymphoma is the most common type of non-Hodgkin lymphoma; which accounts for almost 50% of the cases at the Hematology Department of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo and Instituto do Câncer do Estado de São Paulo. Its clinical and biological heterogeneity results in more than twenty subtypes according to the World Health Organization classification. Its treatment is based on a combination of anti-CD20 monoclonal antibody and antracycline-based chemotherapy, with a 10-year overall survival of 43.5%. Clinical prognostic determinants such as the International Prognostic Index and the Revised International Prognostic Index lack accuracy, since up to 20% of low-risk patients will die from the disease and up to 60% of high-risk patients will be alive within four years. Such discrepancies can partially be attributed to genetic factors. Diffuse large B-cell lymphoma germinal center gene signature shows superior overall survival compared to activated B-cell signature (76% versus 16%, p=0.01), however microarray gene expression profile is not yet available in clinical practice. Nonetheless, the Mortality Predictor Score for diffuse large B-cell lymphoma based on the prognostic value of BCL2, BCL6, CCND2, FN1, LMO2 and SCYA3 gene expression by quantitative real-time PCR has proved to be independent from the International Prognostic Index in the pre-rituximab era. But it was not significant in high clinical risk patients treated with R-CHOP. The genes BCL2, CCND2 and SCYA3 compose activated B-cell signature, whereas BCL6 and LMO2 compose the germinal center signature and FN1 the lymph-node signature. Objective: Evaluate the impact of BCL2, BCL6, CCND2, FN1, LMO2 and SCYA3 absolute gene expression in Brazilian population diagnosed with diffuse large B-cell lymphoma and treated with R-CHOP, with respect to overall response, disease free survival, progression free survival and overall survival. Methods: Gene expression was analyzed by quantitative real-time PCR of RNA extracted from paraffin-embedded samples of 63 patients, although evaluable in 42. Their values were normalized by endogenous gene ABL and log- transformed on a base 2 scale for subsequent correlation with clinical and outcome variables. Results: With a median follow-up of 29 months, overall survival, disease free survival and progression free survival accounted for 82.8%, 97.14% and 87.53% respectively, while complete response was 82.5%. The expression of LMO2>3logs and BCL6>3.5logs defined a group with higher overall survival (91% versus 64.3%, p=0.040) and progression free survival (95.5% versus 70.7%, p=0.03), independent of International Prognostic Index (p=0.010 and p=0.042) and with significant overexpression of SCYA3 (p=0.046). It was not identified any association between six gene Mortality Predictor Score and prognosis. As a result, we developed the New Genetic Prognostic Score based on the power of concomitant expression of LMO2 and CCND2, defining low-risk (<2.5) and high-risk (>=2.5) groups with distinct overall survival (92.4% versus 57.1%, p=0.011) and progression free survival (96.2% versus 66.7%, p=0.013), independent of International Prognostic Index. Conclusion: In patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with R-CHOP, hyperexpression of BCL6, LMO2 and SCYA3 was correlated with a better prognosis. The New Genetic Prognostic Score, defined by LMO2 and CCND2, stratified risk groups with different prognosis, independent of International Prognostic Index

Os doentes transplantados renais têm alto risco para desenvolver queratoses actínicas e câncer de pele. Para verificar o efeito quimioprofilático da acitretina estudamos a evolução de 13 doentes transplantados renais com queratoses actínicas múltiplas e história de carcinomas cutâneos submetidos a tratamento por 12 meses (20mg/dia). Fez-se a avaliação clínica e laboratorial regularmente em todo o período do estudo. Realizou-se exame histopatológico, demonstração imuno-histoquímica de sub-populações de linfócitos T (CD4, CD8), células natural killer e células de Langerhans, sua quantificação e comparação em biopsias de pele, sem lesão, de área exposta e protegida do sol antes, após seis e 12 meses de tratamento. Observou-se melhora das lesões cutâneas e ausência de aparecimento de novos tumores em 12 dos 13 pacientes. Não ocorreram alterações laboratoriais relacionadas a função renal, hepatotoxicicidade e hiperlipidemia. Não houve diferenças significativas histopatológicas e da população de linfócitos T e células natural killer da pele exposta e protegida do sol com o tratamento. Verificou-se aumento numérico de células de Langerhans epidérmicas aos 12 meses quando comparado aos da pele antes e após seis meses de tratamento (p = 0,002 e p = 0,003). Em nossa casuística o uso de acitretina em doses baixas foi útil para melhorar o aspecto cutâneo e prevenir lesões cutâneas pré-cancerosas e carcinomas. O aumento das células de Langerhans epidérmicas estaria relacionado ao efeito imunomodular da acitretina. / Renal transplant recipients have an increased incidence of actinic keratosis and skin cancer. In order to examine the chemoprophylatic effects of low-dose acitretin on skin cancer development we submitted 13 renal transplanted patients to acitretin therapy (20 mg/day) for 12 month. The patients were assessed at monthly intervals during the first 6 months and every two months until the 12th month for new skin lesions and for acitretin toxicity. Normal skin biopsies of sun exposed and sun protected area were taken for histopathological exam and submitted to immunohistochemistry technique to demonstrate CD4+ and CD8+ T lymphocytes, natural killer cells and Langerhans cells wich were counted and compared in the beginning, after 6th month and 12th month of the treatment. There was an improvement of actinic keratosis and all patients but one did not develop new skin cancer. Side-effects were well-tolerated and no significant biochemical effects were observed. Although there were no differences in the microscopic aspects of the skin and in the number of CD4+ and CD8+ T lymphocytes and natural killer cells, there was a significant increase in the number of epidermal Langerhans cells after 12 months of acitretin therapy. The data obtained permit us to conclude that low dose acitretin therapy is safe, well-tolerated and partially effective in chemoprophylaxis of skin cancer in renal transplant recipients. The increase in epidermal Langerhans cells observed may be an expression of the immunomodulatory effect of acitretin.

INTRODUÇÃO: Quimiorradioterapia (QRT) concomitante adjuvante aumenta a sobrevida livre de doença (SLD) em pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECCP) de alto risco operados com intenção curativa, porém está associada a toxicidade não desprezível e seu impacto na sobrevida global (SG) é incerto. ERCC1 (Excision Repair Cross Complementing Group 1) é uma proteína com função crítica no reparo de DNA por excisão de nucleotídeos (NER) e está envolvido na resistência à quimio- e radioterapia. Neste trabalho tivemos como objetivos determinar a expressão da proteína ERCC1, a expressão do RNA mensageiro (mRNA) de ERCC1 e a ocorrência do polimorfismo de nucleotídeo único T19007C de ERCC1 em pacientes portadores de CECCP de alto risco, operados e tratados com QRT adjuvante, bem como o valor prognóstico destes marcadores. MÉTODOS: Trata-se de um estudo retrospectivo em pacientes portadores de CEC de cavidade oral, orofaringe, hipofaringe ou laringe, operados com intenção curativa e portadores de doença de risco alto ou intermediário. Pacientes elegíveis haviam sido tratados com QRT adjuvante: 60-70 Gy e cisplatina concomitante (100 mg/m2, dias 1, 22 e 43), não apresentavam metástases a distância e nem sinais de recidiva após cirurgia. A expressão da proteína ERCC1 foi avaliada por imunohistoquímica, através de um escore H semiquantitativo, obtido pelo produto da intensidade da coloração nuclear (0-3) pelo escore proporcional atribuído à porcentagem estimada de núcleos corados (0;0,1;0,5;1). O método da transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real quantitativo foi utilizado para determinação da expressão do mRNA de ERCC1 em tecido de tumor primário, normalizada em relação à expressão da fração 18S do RNA ribossomal. Genotipagem de ERCC1 (códon 118) foi realizada por PCR - polimorfismo do tamanho do fragmento de restrição a partir de DNA genômico extraído de linfonodos normais destes pacientes, após digestão com BsrDI. RESULTADOS: 69 pacientes com idade mediana de 56a, sendo 81% homens, foram estudados. Em relação à neoplasia, os sítios primários observados foram: cavidade oral (41%), laringe (32%), hipofaringe (16%) e orofaringe (12%), com estadio III 14% e estadio IV 86%, sendo pT3-pT4 78% e pN2-pN3 58%. Quarenta e três pacientes apresentaram-se com pelo menos dois linfonodos positivos, 27 com extravazamento extracapsular da metástase linfonodal e 18 com margens positivas. Achados de alto risco foram detectados em 40 pacientes (58%). No seguimento mediano de 47 meses, observou-se 11 recidivas loco-regionais, sete recidivas a distância, 10 casos com segundo tumor primário (sendo quatro com primário em pulmão e quatro em esôfago) e 30 óbitos (22 pela doença). A taxa de SG em 5 anos foi 40% e a taxa de SLD em 5 anos foi 31%. Escore H superior a 1,5 foi encontrado em 32 pacientes (54%), os quais apresentaram melhor taxa de sobrevida global em 5 anos (50% versus 18%, HR 0,43, 95%CI 0,20-0,90, p=0,026). Quinze pacientes (33%), dos 45 analisados, apresentaram elevada expressão do mRNA de ERCC1 (> 3,1) e estes pacientes tiveram melhor taxa de sobrevida global em 5 anos em comparação com aqueles com baixa expressão (86% versus 31%, HR 0,26, 95%CI 0,14-1,01, p=0,052). A distribuição dos genótipos de ERCC1 no códon 118 em 49 pacientes foi 39% C/T, 37% C/C, e 24% T/T. Não foi encontrada associação significativa entre idade, sexo, estadiamento e achados anatomopatológicos de risco, e os polimorfismos genéticos no códon 118 de ERCC1 ou a expressão do mRNA de ERCC1. Não houve diferença entre os genótipos C/C, C/T e T/T seja em termos taxa de sobrevida global em 5 anos (45%, 46%, 46%; p=0,808), seja em termos de taxa de sobrevida livre de doença em 5 anos (31%, 34%, 20%, p=0,770, respectivamente). O escore H (> 1,5 versus 1,5; HR ajustado 0,20, 95%CI 0,07-0,57, p=0,003) e a expressão normalizada do mRNA de ERCC1 (> 3,1 versus 3,1; HR ajustado 0,12, 95%CI 0,03-0,59, p=0,009), permaneceram significantes do ponto de vista estatístico, como fatores prognósticos na análise multivariada. CONCLUSÕES: Alta expressão imunohistoquímica da proteína ERCC1 e alta expressão do mRNA de ERCC1 conferem melhor prognóstico em pacientes portadores de CECCP operados de alto risco tratados com QRT adjuvante baseada em cisplatina. O polimorfismo genético T19007C de ERCC1 não apresentou valor prognóstico nestes pacientes. / BACKGROUND: Adjuvant concurrent chemoradiation (CRT) improves diseasefree survival (DFS) in patients diagnosed with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) presenting with high-risk features treated with surgery with curative intent, but treatment-related toxicity is not negligible and its impact on overall survival (OS) is uncertain. ERCC1 (Excision Repair Cross Complementing Group 1) is a protein with a critical role in the nucleotide excision repair (NER) pathway, associated with resistance to chemo- and radiation therapy. We aimed here to study ERCC1 protein expression, ERCC1 messenger RNA (mRNA) expression and the single nucleotide polymorphism T19007C of ERCC1 as prognostic markers in HNSCC patients presenting with high-risk features treated with surgery and adjuvant CRT. METHODS: It is a retrospective study in patients with oral cavity, oropharynx, hypopharynx or larynx SCC submitted to radical surgery with curative intent and presenting with pathologic features of high- or intermediate-risk. Eligible patients were treated with adjuvant CRT: 60-70 Gy and concurrent cisplatin (100 mg/m2, days 1, 22 and 43), with no distant metastasis and no relapsed disease after surgery. ERCC1 protein expression was evaluated by immunohistochemistry, using a semi-quantitative H-score, calculated by multiplying the nuclear staining intensity (0-3) by the proportion score attributed to the percentage of positive tumor nuclei (0;0,1;0,5;1). Quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) assay was performed to determine ERCC1 mRNA expression in primary tumors tissue specimens. The ERCC1 mRNA expression was normalized using 18S fraction of ribosomal RNA expression as internal reference. ERCC1 (codon 118) genotypes were detected using PCR restriction fragment length polymorphism method carried out in genomic DNA extracted from normal lymph nodes. The PCR products were digested with BsrDI. RESULTS: 69 patients (median age 56 y, 81% male) were studied. Regarding tumor characteristics, primary sites were: oral cavity 41%, larynx 32%, hypopharynx 16%, oropharynx 12%, stage III 14%, stage IV 86%, pT3- pT4 78% and pN2-pN3 58%. Forty-three patients presented with two or more positive lymph nodes, 27 with extracapsular spread of nodal disease and 18 with positive margins. High-risk pathologic features were detected in 40 patients (58%). During the median follow-up of 47 months, we observed 11 locoregional relapses, seven distant relapses, 10 patients were diagnosed with secondary primary tumors (four in lungs and four in esophagus) and 30 deaths (22 disease-related). The 5-year overall survival rate was 40% and the 5-year disease-free survival rate was 31%. High H-score (> 1.5) was seen in 32 patients (54%), who presented better 5-year overall survival rate in comparison to those with lower H-scores (50% versus 18%, HR 0.43, 95%CI 0.20-0.90, p=0.026). Fifteen patients (out of 45, 33%) whose tumors presented normalized ERCC1 expression > 3.1 were classified as having high ERCC1 mRNA expression, and these patients presented better 5-year overall survival rate in comparison to those with lower ERCC1 mRNA expression (86% versus 30%, HR 0.26, 95%CI 0.14-1.01, p=0.052). Genotype distribution at ERCC1 codon 118 in 49 patients was 39% C/T, 37% C/C, and 24% T/T. No significant association was found between age, gender, stage, grading and pathological risk features and ERCC1 codon 118 genotypes or ERCC1 mRNA expression. No difference was detected among C/C, C/T and T/T genotypes, either in terms of 5-year overall survival rates (45%, 46%, 46%; p=0.808), or 5-year diseasefree survival rate (31%, 34%, 20%, p=0.770, respectively). H-score (> 1.5 versus 1.5; adjusted HR 0.20, 95%CI 0.07-0.57, p=0.003) and ERCC1 mRNA normalized expression (> 3.1 versus 3.1; adjusted HR 0.12, 95%CI 0.03-0.59, p=0.009), remained significant as favorable prognostic factors after adjusting for prognostic factors in a multivariate analysis. CONCLUSIONS: High immunohistochemical expression of ERCC1 protein and high ERCC1 mRNA expression, but not the T19007 single nucleotide polymorphism, were associated with better prognosis in HNSCC patients submitted to surgery and adjuvant cisplatin-based chemoradiation.

Os doentes transplantados renais têm alto risco para desenvolver queratoses actínicas e câncer de pele. Para verificar o efeito quimioprofilático da acitretina estudamos a evolução de 13 doentes transplantados renais com queratoses actínicas múltiplas e história de carcinomas cutâneos submetidos a tratamento por 12 meses (20mg/dia). Fez-se a avaliação clínica e laboratorial regularmente em todo o período do estudo. Realizou-se exame histopatológico, demonstração imuno-histoquímica de sub-populações de linfócitos T (CD4, CD8), células natural killer e células de Langerhans, sua quantificação e comparação em biopsias de pele, sem lesão, de área exposta e protegida do sol antes, após seis e 12 meses de tratamento. Observou-se melhora das lesões cutâneas e ausência de aparecimento de novos tumores em 12 dos 13 pacientes. Não ocorreram alterações laboratoriais relacionadas a função renal, hepatotoxicicidade e hiperlipidemia. Não houve diferenças significativas histopatológicas e da população de linfócitos T e células natural killer da pele exposta e protegida do sol com o tratamento. Verificou-se aumento numérico de células de Langerhans epidérmicas aos 12 meses quando comparado aos da pele antes e após seis meses de tratamento (p = 0,002 e p = 0,003). Em nossa casuística o uso de acitretina em doses baixas foi útil para melhorar o aspecto cutâneo e prevenir lesões cutâneas pré-cancerosas e carcinomas. O aumento das células de Langerhans epidérmicas estaria relacionado ao efeito imunomodular da acitretina. / Renal transplant recipients have an increased incidence of actinic keratosis and skin cancer. In order to examine the chemoprophylatic effects of low-dose acitretin on skin cancer development we submitted 13 renal transplanted patients to acitretin therapy (20 mg/day) for 12 month. The patients were assessed at monthly intervals during the first 6 months and every two months until the 12th month for new skin lesions and for acitretin toxicity. Normal skin biopsies of sun exposed and sun protected area were taken for histopathological exam and submitted to immunohistochemistry technique to demonstrate CD4+ and CD8+ T lymphocytes, natural killer cells and Langerhans cells wich were counted and compared in the beginning, after 6th month and 12th month of the treatment. There was an improvement of actinic keratosis and all patients but one did not develop new skin cancer. Side-effects were well-tolerated and no significant biochemical effects were observed. Although there were no differences in the microscopic aspects of the skin and in the number of CD4+ and CD8+ T lymphocytes and natural killer cells, there was a significant increase in the number of epidermal Langerhans cells after 12 months of acitretin therapy. The data obtained permit us to conclude that low dose acitretin therapy is safe, well-tolerated and partially effective in chemoprophylaxis of skin cancer in renal transplant recipients. The increase in epidermal Langerhans cells observed may be an expression of the immunomodulatory effect of acitretin.