Problématiques : 1) Mes travaux de maitrise ont démontré qu’il était possible de fusionner des hormones peptidiques avec la protéine fluorescente verte (EGFP) pour obtenir des ligands de haute affinité avec un haut poids moléculaire supportant des expériences d’imagerie. Cela a permis de détecter les deux récepteurs de la bradykinine (BK; B1R et B2R) ainsi que le récepteur PTH1 de la parathormone (PTH, PTH1R), trois récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Malgré la haute affinité de ces sondes, les applications restent limitées à des systèmes surexprimant le récepteur cible recombinant. Cela s’explique par les deux raisons suivantes : a) la faible abondance des récepteurs endogènes et b) le faible rendement de la fluorescence. 2) La génération de ligands de haut poids moléculaire et la démonstration que ceux-ci avaient toujours une activité pharmacologique pourrait permettre de résoudre une problématique majeure reliée à l’administration thérapeutique de BK. Malgré l’accumulation de preuves du rôle protecteur de la BK sur le système vasculaire, les récepteurs de la BK sont des cibles pharmacologiques quasi inexploitées, car les effets délétères causés par les agonistes de la BK, notamment au niveau de l’inflammation et de la génération de douleur, semblent limiter leur développement. Objectifs : 1) Étudier la pharmacologie de la maximakinine (MK), un analogue de la BK, et le potentiel de ce peptide comme module conférant l’affinité au récepteur B2 dans la conception de ligands biotechnologiques. 2) Générer des protéines de fusion ligands des deux principales familles de GPCRs (A : B2R; B : PTH1R). 3) Utiliser ces protéines de fusion pour permettre la détection de faibles niveaux de récepteurs difficilement détectables par les stratégies conventionnelles. 4) Évaluer l’activité pharmacologique de ces protéines de fusion. Résultats : Deux des trois protéines de fusion PTH générées (PTH-myc et PTHHRP) sont capables de détecter de manière spécifique les niveaux endogènes de PTH1R exprimés par les cellules HOS (ostéosarcome humain) grâce à leur domaine peroxydase intrinsèque ou assemblé. La protéine de fusion PTH-HRP est la plus prometteuse, et peut aussi être utilisée comme ligand non-isotopique dans un essai de compétition de liaison pour identifier de nouveaux ligands du PTH1R humain. La MK est un agoniste direct du récepteur B2 de rat, mais n’a qu’une affinité marginale pour le récepteur B2 humain. L’essai de contractilité de la veine ombilicale humaine a démontré que la MK était une pro-drogue pour le B2R humain, activée par des peptidases présentes dans ce tissu. La MK ne stimule pas la dégranulation des mastocytes via le récepteur MRGPRX2, malgré sa forte charge positive. Chez le rat, la MK est un agoniste persistant, résistant à la dégradation et de haute affinité pour le B2R. La protéine de fusion fluorescente EGFP-MK est un agoniste spécifique du B2R de rat, mais pas du B2R humain. Des études in vitro ont démontré qu’elle était aussi un agoniste persistant de haute affinité pour le B2R de rat. La protéine de fusion avec domaine peroxydase APEX2-(NG)15-MK permet la détection du récepteur B2 de rat recombinant de manière spécifique et efficace. De plus cette protéine de fusion peut être utilisée comme ligand non-isotopique dans des essais de compétition de liaison pour identifier de nouveaux ligands du B2R de rat. Il est possible de générer des protéines de fusion contenant la MK agoniste du B2R de rat de très haut poids moléculaire (>66 kDa), mais ceux-ci peuvent avoir une activité pharmacologique limitée par l’encombrement stérique entre la protéine de fusion et le récepteur. Conclusions et perspectives : Il est possible de générer des protéines de fusion avec des domaines enzymatiques agonistes des récepteurs B2 et PTH1. Cela permet une amplification significative du signal émis par les iv protéines de fusion comparativement aux protéines de fusion fluorescentes. La détection des niveaux endogènes de GPCRs par des protéines de fusion pourrait permettre de les utiliser dans des tests diagnostiques. Ces travaux, qui ont démontré qu’il était possible de générer des ligands biotechnologiques de haut poids moléculaire agonistes des principales classes de GPCRs (A et B), pourraient être appliqués aux autres ligands membres de ces familles en accord avec les modèles de liaisons de chaque ligand.

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de HMGB1 et son récepteur RAGE dans l'étiopathogenèse des maladies parodontales. Nos résultats montrent que les macrophages de la lignée U937 sécrètent HMGB1 suite à une stimulation avec les lipopolysaccharides des bactéries parodontopathogènes, alors que son niveau intracellulaire demeure inchangé. Le récepteur RAGE est faiblement exprimé par cette lignée et sa forme membranaire reste inchangée suite à ces stimulations alors que sa forme soluble est indétectable. De plus, la protéine HMGB1 n'induit pas la production des cytokines pro-inflammatoires TNF-a et IL-1ß par les macrophages U937 et la neutralisation de HMGB1 et de RAGE n'affecte pas la sécrétion de ces cytokines. D'autre part, le dosage du HMGB1 plasmatique révèle un taux plus élevé chez les patients atteints de parodontites que chez les sujets sains. Cette étude a permis d'analyser l'induction de la sécrétion de HMGB1 et de RAGE par les lipopolysaccharides des parodontopathogènes.

Les nucleotides et nucleosides extracellulaires sont impliqués, via l'activation de récepteurs spécifiques, dans la régulation de diverses fonctions biologiques. Les récepteurs ionotrophes P2X et métabotrophes P2Y répondent aux nucleotides di- et tri-phosphates alors que les récepteurs métabotrophes PI sont activés par l'adénosine. L'activation de ces récepteurs est modulée par la concentration de leurs agonistes dans le milieu. Des enzymes membranaires que l'on nomme ecto-nucléotidases modulent les concentrations en nucleotides extracellulaires en les hydrolysant. À pH physiologique, les nucleosides triphosphates diphosphohydrolases (NTPDases) et l'ecto-5'-nucléotidase sont les plus importantes. La signalisation purinergique est impliquée dans tous les aspects de la digestion, comme par exemple, dans la sécrétion salivaire, gastrique et intestinale, dans le péristaltisme ainsi que dans la relâche des hormones pancréatiques. La localisation des ecto-nucléotidases est une étape essentielle dans la compréhension de leurs fonctions digestives. L'expression digestive des NTPDasel et 2 et de l'ecto-5'-nucleotidase est rapportée, par contre, rien n'est connu en ce qui à trait à la localisation de la NTPDase3. Des buvardages de type northern publiés préalablement montrent que l'ARN messager de la NTPDase3 est présent dans le pancréas et dans l'intestin. L'hypothèse de mes études doctorales est que la NTPDase3 est exprimée dans le système digestif et qu'elle participe à la régulation de l'activation des récepteurs P2 dans différentes fonctions digestives. La localisation de la NTPDase3 dans le système digestif de la souris a été déterminée par histochimie enzymatique et par immunohistochimie. Les résultats obtenus montrent que la NTPDase3 est présente sur les neurones du système nerveux entérique ainsi que sur plusieurs types de cellules épithéliales comme sur les acini séreux des glandes salivaires submandibulaires et des parotides, sur les acini muqueux et l'épithélium des canaux collecteurs des glandes sublinguales ainsi que sur l'épithélium stratifié de l'oesophage et de l'estomac supérieur. De plus, certaine cellules endocrines comme les cellules des îlots de Langerhans et un sous-type de cellules entéroendocrines gastriques expriment aussi la NTPDase3. L'analyse de l'expression des NTPDasel, 2 et de l'ecto-5'-nucleotidase sur les cellules et tissues expriment la NTPDase3 montre que la NTPDase3 est exprimée avec la NTPDase2 et/ou l'ecto-5'-nucleotidase sur plusieurs de ces types cellulaires. Le deuxième volet de mes travaux montre que la NTPDase3 est exprimée par tous les types de cellules des îlots de Langerhans, autant chez le rat, l'humain que la souris, alors que l'ecto-5'-nucleotidase n'est retrouvée que chez le rat. J'ai montré que l'activité nucléotidasique de la NTPDase3 est impliquée dans la modulation de la sécrétion d'insuline par des cellules 0-pancréatique de rat, les cellules INS-1 (832/13). Cette enzyme régule la sécrétion basale d'insuline par l'hydrolyse des nucleotides relâchés de façon basale. En présence d'ATP exogène et de forte concentration de glucose, la NTPDase3 régule la sécrétion d'insulin par la modulation de la production d'adénosine. En conclusion, le profil de localisation de la NTPDase3 dans le système digestif suggère l'implication de la NTPDase3, en association avec la NTPDase2 et l'ecto-5'-nucleotidase, dans la transmission nerveuse entérique et dans la sécrétion épithéliale comme la sécrétion salivaire. De plus, la démonstration de l'implication de la NTPDase3 dans la sécrétion d'insuline représente la première fonction physiologique connue de cette enzyme.

La transplantation de myoblastes est une thérapie envisagée pour le traitement de la Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). La mort précoce des cellules injectées et leurs faibles migrations limitent son succès. Le MGF-Ct24E, un peptide synthétique qui représente le peptide E de l’isoforme Ec de l’IGF-1, a été utilisé. Il a augmenté la prolifération cellulaire en médiant son effet par un récepteur différent de celui à l’IGF-1. Des injections systémique et intramusculaire ont amélioré le taux de greffe, ce qu’un pré-traitement et une co-injection du peptide n’a pas permis. La surexpression du récepteur à l’IGF-1 avec un lentivirus a augmenté la prolifération des cellules et n’a eu aucun effet sur leur différentiation. La sélection de cellules surexprimant fortement le récepteur à l’IGF-1 et phosphorylant fortement Akt a amélioré le succès de transplantation. Ces résultats offrent une perspective encourageante pour l’amélioration de la transplantation cellulaire pour des patients atteints de DMD. / Myogenic cells transplantation is one of the promising therapies to treat dystrophic patients. Early cells death and poor migration are important problems who limit this therapy’s success. MGF-Ct24E, a synthetic copy of the peptide E from the IGF-1 Ec isoform, was used. The peptide increases the proliferation of cells and did no effect on the differentiation. Injected systematically and intramuscularly, MGF-Ct24E increased the graft success. When the cells were pretreated with the peptide and co-injected with it, no increase in the graft success was seen. The overexpression of IGF-1 receptor on human cells with a lentivirus increased the proliferation rate and did no effect on their differentiation. When the cells were selected for a high expression of the IGF-1 receptor and for a high phosphorylation of Akt, the graft success was increased. Together, those results are offering an interesting avenue for the amelioration of cells transplantation in DMD.

La cellule utilise des nœuds d’interactions protéiques relativement stables, conservés et souvent constitués d’adaptateurs moléculaires pour gérer des signaux reçus (synthèse, sécrétion, traffic, métabolisme, division), des problèmes de sécurité et de niveaux d’énergie. Nos résultats montrent que la cellule utilise aussi des nœuds relativement petits et dynamiques où des informations propres concernant des voies métaboliques apparemment indépendantes sont évaluées. Ces informations y sont intégrées localement et une décision y est prise pour action immédiate. Cette idée est supportée par notre étude sur le récepteur de l’insuline (RI). Ce récepteur transmembranaire à activité tyrosine kinase reconnaît un signal externe (insuline circulante) et engage la signalisation de l’insuline, les réponses métaboliques et le contrôle du glucose circulant. Le RI est aussi impliqué dans l’internalisation de l’insuline et sa dégradation dans les endosomes (clairance). Il régule donc indirectement la sécrétion de l’insuline par les cellules du pancréas endocrine. La signification pathophysiologique de l’endocytose du RI ainsi que les bases moléculaires d’une telle coordination sont peu connues. Nous avons construit un réseau d’interactions du RI (IRGEN) à partir d’un protéome de fractions Golgi-endosomales (G/E) hépatiques. Nous démontrons une forte hétérogénéité fonctionnelle autour du RI avec la présence des protéines ATIC, PTPLAD1, AMPKα et ANXA2. ANXA2 est une protéine impliquée dans la biogénèse et le transport endosomal. Nos résultats identifient un site de SUMOylation régulé par l’insuline dans sa région N-terminale. ATIC est une enzyme de la voie de synthèse des purines de novo dont le substrat AICAR est un activateur de l’AMPKα. Des analyses biochimiques in vitro et in vivo nous montrent que ATIC favorise la tyrosine phosphorylation du RI par opposition fonctionnelle à PTPLAD1. Une délétion partielle d’ATIC stimule l’activation de l’AMPK dont la sous-unité AMPKα2 apparaît déterminante pour le trafic du RI. Nous démontrons que ATIC, PTPLAD1, AMPKα, AICAR et ANXA2 contrôlent l’endocytose du RI à travers le cytosquelette d’actine et le réseau de microtubules. Nous ressortons un nœud de signalisation (ATIC, PTPLAD1, AMPKα) capable de détecter les niveaux d’activation du RI, d’énergie cellulaires (rapports AMP/ATP) et aussi d’agir sur la signalisation et l’endocytose du RI. Cette proximité moléculaire expliquerait le débat sur le mécanisme primaire du diabète de type 2 (DT2), notamment entre la sensibilité à l’insuline et sa clairance. Nous avons calculé un enrichissement de 61% de variants communs du DT2 parmi les protéines fonctionnellement proches du RI incluant RI, ATIC, AMPKα, KIF5A et GLUT2. Cet enrichissement suggère que l’hétérogénéité génétique révélée par les consortiums sur études génomiques (GWAS) converge vers des mécanismes peu étudiés de biologie cellulaire. / The normal cell deals efficiently with multiple signals, processes (synthesis, secretion, trafficking, metabolism, and division), and energy and security problems. To achieve these goals, the cell uses large and relatively stable proteins nodes (or hubs) often sustained by adapters. It appears that the cell also uses small, dynamics nodes where informations about apparently unconnected major pathways are evaluated. Not only these informations are locally integrated but also a decision is made for immediate action. This is exemplified here by the insulin receptor (IR). This receptor-tyrosine kinase recognizes signals from the outside (circulating insulin) and engages insulin signalling activity and the insulin response. Quite simultaneously, the insulin receptor is involved in insulin internalization and its subsequent degradation in endosomes (clearance of circulating insulin) and thus, it indirectly regulates insulin secretion by the -cells of the endocrine pancreas. The physiological significance of trafficking and the molecular bases of such coordination have received little attention. We constructed hepatic Golgi/endosomes (G/E) network of the internalized IR (IRGEN) and we found substantial heterogeneity within the close environment of IR, with the presence of ATIC, a metabolic enzyme of the de novo purine synthesis pathway, the putative tyrosine phosphatase PTPLAD1, the energy sensor AMPK and ANXA2, a protein involved in endosomes biogenesis and endosomal transport. Our results show that ANXA2 is SUMOylated on an insulin-dependent way at a non-concensus motif of its N-terminal domain. It appears that following insulin stimulation, the proteins ATIC, PTPLAD1, AMPKα associate within seconds with the activated IR and control its tyrosine kinase activity and traffic. We found that PTPLAD1 and AMPKα are rapidly compartmentalised within the plasma membrane (PM) and G/E fractions after insulin stimulation and that ATIC accumulates in the G/E fraction later. By using an in vitro reconstitution system and siRNA–mediated partial knockdown of ATIC and PTPLAD1 in HEK293 cells, we confirmed that ATIC, PTPLAD1 and AMPKα affect IR tyrosine phosphorylation and endocytosis and treatment with AICAR, increased IR endocytosis in cultured cells and in the liver. These results suggest the presence of a new signalling mechanism that senses in the same time adenylate synthesis, cell energy (ATP) and IR activation states and that acts consequently in regulating IR autophosphorylation and endocytosis. The IRGEN may explain the perceived promiscuity that exists between insulin resistance and clearance, as this new signalling node apparently controls both the IR activity and trafficking. The elevated number of common heritable variants associated with type 2 diabetes (T2D) in the actual IRGEN (more than 61 %) favours the idea that the confusing genetic heterogeneity converges however towards few biological mechanisms.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / Les acides biliaires sont des détergents naturels jouant un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie du cholestérol. Cependant, leur cytotoxicité rend nécessaire un contrôle strict de leurs concentrations intracellulaires, afin d'éviter diverses pathologies comme la cholestase. La glucuronidation hépatique, catalysée par les enzymes UDPglucuronosyltransférases (UGT), permet l'excrétion urinaire des acides biliaires. Dans la présente étude, nous avons identifiée 11JGT1A3 comme l'enzyme majeure pour l'inactivation de l'acide chenodeoxycholique sous forme de dérivés glucuronides (CDCA-G). D'autre part nous avons pu démontrer que l'activation de différents récepteurs nucléaires comme le « pregnane-X-receptor » (PXR) ou le « Liver X-receptor » (LXR)a induisait l'expression et l'activité de TUGT1A3, en stimulant l'activité transcriptionnelle du gène codant pour cette enzyme. Ces observations indiquent que les activateurs synthétiques des récepteurs PXR et LXRa peuvent être considérés comme des molécules ayant un potentiel pharmacologique pour stimuler l'expression hépatique de 1TJGT1A3 et ainsi favoriser l'élimination des acides biliaires chez le patient choie statique.

Le facteur de transcription Nurrl est un récepteur nucléaire orphelin hautement impliqué dans le développement du système dopaminergique. Son expression persistante à l'âge adulte soulève toutefois de nombreuses questions quant à son rôle exact dans le cerveau mature. L'objectif de cette étude était d'évaluer les effets d'une diminution partielle du facteur de transcription Nurrl sur la transmission dopaminergique chez des souris adultes. Nous avons d'abord observé qu'une réduction partielle de Nurrl n'influence pas le comportement locomoteur des souris en conditions basales. Par contre, l'administration aiguë d'amphétamine chez les souris Nurrl (+/-) induit une brève augmentation de l'activité locomotrice précédant l'apparition marquée de mouvements verticaux et stéréotypés. La modulation de différents marqueurs tels que Nurrl, Nur77, Nor-1 et l'ENK fut également étudiée. De façon générale, nos résultats démontrent des modifications plus ou moins importantes de l'expression de ce neuropeptide et de ces récepteurs nucléaires en présence ou non du psychostimulant. Enfin, l'ensemble de ces résultats suggèrent qu'une réduction partielle de Nurrl induit des changements importants dans la transmission dopaminergique

Plusieurs études ont clairement démontré l'effet athéroprotecteur de la bilirubine. Par contre, un niveau trop élevé de bilirubine peut causer des effets neurotoxiques. Au niveau de la paroi artérielle, le stress oxydatif entraîne la production des oxystérols qui sont les activateurs endogènes du « Liver X Récepteur » (LXR). Nous avons étudié les effets de l'activation du LXRa sur l'expression de l'enzyme responsable de la glucuronidation de la bilirubine, l'UDP-glucuronosyltransférase (UGT) 1A1 dans le foie. Nous avons identifié de nouveaux éléments de réponse (LXRE) dans le promoteur de l'UGTlAl. Dans des cellules hépatiques, l'activation du LXRa entraîne une augmentation de l'expression et de l'activité de l'UGTlAl. Cet élément de réponse fonctionnel n'est pas conservé chez des rongeurs, ce qui entraîne que cette régulation est limitée aux mammifères supérieurs. En conclusion, nous avons identifié une nouvelle fonction du récepteur nucléaire LXRa qui consistent dans le contrôle de l'expression l'UGTlAl. L'activation du récepteur nucléaire LXRa par les oxystérols permet d'intégrer l'augmentation de la production de la bilirubine au niveau de la paroi d'artère avec une augmentation de l'excrétion hépatique. De plus, l'activation du LXRa par des composantes pharmacologiques, peut être intéressante dans le contexte de l'athérosclérose et de Fhyperbilirubinémie, maladies dans lesquelles la bilirubine joue des rôles importants.

Les lymphocytes Th17 représentent une sous-population lymphocytaire hautement inflammatoire, due à leur particularité à produire des cytokines pro-inflammatoires dont notamment l'IL-17 qui représente leur cytokine signature. Les Th17 jouent un rôle central dans le développement de plusieurs maladies inflammatoires auto-immunes, cependant les mécanismes intervenant dans la régulation de leur fonction effectrice, notamment dans le contexte de ces maladies, demeurent peu connus. Des études récentes ont montré que la signalisation purinergique joue un rôle dans la régulation de la réponse immune et inflammatoire notamment dans l'activation des lymphocytes T CD4⁺ naïfs. Dans cette maitrise, j'ai porté mon intérêt sur le rôle des nucléotides extracellulaires et leurs récepteurs dans l'activation et la différenciation des lymphocytes Th17 humains. Nous avons démontré par RT-PCRq que les Th17 expriment les récepteurs à nucléotides P2X4,5,7 et P2Y₁₁. En utilisant des antagonistes spécifiques pour chacun des récepteurs P2, sauf pour le P2X5 qui n'est pas fonctionnel chez l'humain, nous avons démontré que l'inhibition du P2X4, contrairement à celle des autres récepteurs à nucléotides, bloque la polarisation des lymphocytes T CD4⁺ vers la voie Th17 et diminue la production d'IL-17 suite de l'activation des Th17 polarisés par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28. Par contre, la voie de polarisation des Th1 n'est pas affectée par l'antagonisme du P2X4. De plus, l'inhibition de P2X4 a diminué également la prolifération des lymphocytes T, alors qu'un antagoniste des récepteurs P2X7 et P2Y₁₁ n'a eu aucun effet. Ces résultats montrent que le récepteur P2X4 joue un rôle majeur dans la différenciation et l'activation des Th17 et pourrait réguler le développement des maladies inflammatoires.

Cette étude résume l’historique de la découverte des glies, détaille leur morphologie et leur physiologie. Elle vise principalement à la compréhension des interactions complexes entre les neurones, les glies et l’apport en sang au cortex pendant la transition du sommeil à ondes lentes vers l’éveil in vivo chez des animaux anesthésiés et naturellement endormis. Nous effectuons des enregistrements intracellulaires simultanés de neurones et de glies corticaux, conjointement avec les mesures du débit sanguin cérébral, de la concentration extracellulaire de K+ et les potentiels de champs locaux sous anesthésie pendant l’activation corticale évoquée avec une stimulation électrique des noyaux cholinergiques ou lors de l’éveil naturel de l’animal. Nous suggérons que le résultat du comportement de la glie dépende de l’influence glutamatergique/GABAergique des neurones voisins, sur la modulation des voies de communications intergliales, et/ou sur le trafic ionique au travers des vaisseaux sanguins. / This study summarizes the history of the glial discovery, details their morphology and their physiology and aims at understanding complex interactions between cortical neurons, glia and blood supply during the transition from slow wave sleep to wakefulness in vivo in both anesthetized and naturally sleeping animals. We performed simultaneous intracellular recordings of cortical neurons and glia, together with measurements of cerebral blood flow, extracellular K+ concentrations and local field potentials under anesthesia, during elicited cortical activation with electric stimulation of cholinergic nuclei or under naturally wakefulness of the animal. We suggest that the outcome of the glial behavior depends on the glutamatergic/GABAergic influence of neighboring neurons, on the modulation of the interglial communication pathways, and/or on the ionic traffic across blood vessels.