Sémaphorine 7A est une molécule de guidage axonal pour les neurones dopaminergiques en développement. Elle permet de ségréguer les neurones de la voie nigrostriée et mésolimbique. Nous montrons dans cette étude qu’elle participe également à l’organisation de la voie mésocorticale. L’effet chémorépulsif de la molécule Sémaphorine 7A se fait via sa liaison avec le récepteur membranaire PlexinC1, présent tout au long du développement embryonnaire dans les neurones de l’aire tegmentale ventral. Il se manifeste in vitro par une modulation morphologique du cône de croissance, ainsi qu’une réduction de l’arborisation dendritique. Les kinases de la famille des Src sont les médiatrices de ces effets. En forçant leur inactivation, on peut empêcher l’apparition des effets chémorépulsifs de Sémaphorine 7A. Il est intéressant de noter que les kinases de la famille des Src sont également activées in vivo dans les cônes de croissance de neurones dopaminergiques en développement. La liaison de Sémaphorine 7A à PlexinC1 mène aussi à une inactivation de la protéine de liaison à l’actine cofiline. L’identification de cet acteur moléculaire permet de faire un lien entre l’activation du récepteur et la modulation subséquente du cytosquelette, une étape essentielle afin de médier le mouvement du cône de croissance. En somme, cette étude permet de mettre en évidence certains mécanismes moléculaires agissant au niveau du cône de croissance, et dont l’effet est nécessaire au guidage des neurones dopaminergiques par Sémaphorine7A. / Semaphorin7A is an important axon guidance molecule for developing dopaminergic neurons. It allows to segregate the neurons of the nigrostriate and mesolimbic pathway. In this study, we bring to light its role in the organization of the mesocortical pathway. The chemorepulsive effect of Semaphorin 7A occur via its binding with the PlexinC1 membrane receptor, present throughout embryonic development in the neurons form the Ventral Tegmental Area. These effects include, in vitro a morphological modulation of the growth cone, as well as a reduction of the dendritic arborization. Src family kinases mediate these effects and when inactivated, they prevent both chemorepulsion and growth cone morphology changes induced by Séma7A. Interestingly, Src family kinases are also activated in vivo in growth cones of developing dopaminergic neurons. The binding of Séma7A to PlexinC1 also leads to inactivation of the actin binding protein cofilin. The identificatio; n of this molecular actor links the activation of the receptor and the subsequent modulation of the cytoskeleton, an essential step in order to mediate the movement of the growth cone. In sum, this study reveals the molecular mechanisms acting at the level of the growth cone in midbrain dopaminergic neurons during axonal guidance by Semaphorin7A.

L'ET-1, un peptide de 21 acides aminés, est un des plus puissants vasoconstricteurs isolés à date. Il est présent dans plusieurs tissus et est responsable de nombreuses actions biologiques. Chez l'humain, ces effets sont relayés par deux récepteurs couplés aux protéines G:ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B]. Précédemment, notre groupe a démontré que ces récepteurs sont présents au niveau de la membrane plasmique, du cytosol et du noyau incluant les membranes de l'enveloppe nucléaire des cellules endothéliales endocardiques isolées des ventricules gauche (CEEGs) et droit (CEEDs) du coeur foetal humain âgé de 20 semaines. De plus, notre groupe a montré que suite à l'activation des récepteurs à l'ET-1 situés au niveau de la membrane plasmique, l'ET-1 augmente le niveau de Ca[indices supérieurs 2+] intracellulaire libre des CEEs; les CEEGs étant plus sensibles à l'ET-1 que les CEEDs. Basé sur ces résultats, nous allons tester l'hypothèse que les récepteurs de l'ET-1, et en particulier le récepteur ET[indice inférieur B], présents au niveau des membranes de l'enveloppe nucléaire des CEEs augmentent le Ca[indices supérieurs 2+] nucléoplasmique et que la sensibilité de ces récepteurs nucléaires est différente de celle connue pour les récepteurs à l'ET-1 de la membrane plasmique. De plus, il est possible que l'activation des récepteurs ET[indice inférieur A] et/ou ET[indice inférieur B] de la membrane de surface induit leur internalisation, translocation ainsi que leur synthèse de novo. Nous proposons aussi que ces phénomènes peuvent être différents dans les CEEGs et les CEEDs. Dans la première partie de ce mémoire, nous avons étudié l'effet de concentrations croissantes d'ET-1 cytosolique sur le niveau de calcium nucléoplasmique des CEEGs et des CEEDs. Au niveau des noyaux des CEEDs, nous avons observé que la valeur de EC[indice inférieur 50] obtenue est plus élevée (1000 fois) que celle des noyaux des CEEGs suggérant que les récepteurs à l'ET-1 présents au niveau des membranes de l'enveloppe nucléaire sont plus sensibles à l'ET-1 au niveau des CEEGs par rapport aux CEEDs. Nos résultats montrent également que les récepteurs à l'ET-1 des membranes de l'enveloppe nucléaire des CEEDs et des CEEGs sont plus sensibles à l'ET-1 que ces mêmes récepteurs présents au niveau de la membrane plasmique et ce de 1000 fois pour les CEEGs et de 10 fois pour les CEEDs. De plus, nos résultats montrent qu'au niveau des CEEDs et des CEEGs, l'ET-1 cytosolique induit une augmentation du [Ca[indices supérieurs 2+]][indice inférieur n] qui est relayée par le récepteur ET[indice inférieur B]. Dans la deuxième partie de ce mémoire, nous avons démontré que le traitement des cellules avec l'ET-1 à différents temps pouvait induire la mobilisation des récepteurs ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B]. Nous avons observé une similarité dans le profil de mobilisation des récepteurs ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B] au niveau des CEEDs suggérant que la cinétique de l'internalisation, de la dégradation et de la synthèse de novo peut être la même indépendamment du type de récepteur activé. De plus, nos résultats montrent que la cinétique et le décours de la mobilisation des récepteurs ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B] est différent dans les CEEGs par rapport aux CEEDs suggérant qu'il est important de considérer l'origine anatomique des CEEs. Nos résultats montrent également que la plupart des augmentations dans les niveaux du récepteur ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B] au niveau des CEEs sont dues à des synthèses de novo sensibles à la cycloheximide.

Les hormones thyroïdiennes (T[indice inférieur 3], T[indice inférieur 4]) sont cruciales pour le développement, la croissance et plusieurs fonctions homéostatiques. Leurs actions s'exercent via leurs récepteurs (TRs), facteurs de transcription membres de la famille des récepteurs nucléaires. La régulation de la transcription par les TRs est complexe et dynamique et demande l'intervention d'une multitude de co-régulateurs. Récemment, nous avons identifié un nouveau co-activateur des TRs, RanBPM, dont le mécanisme d'action est inconnu. Plusieurs évidences suggèrent que RanBPM pourrait être relié à la voie de l'ubiquitine et du protéasome (Ub-Pr): RanBPM modifie l'ubiquitination et la stabilité de p73 et RanBPM interagit avec USP11, une ubiquitine protéase. Par ailleurs, bien qu'il ait été démontré que la T[indice inférieur 3] induit une diminution rapide des TRs par la voie Ub-Pr, les mécanismes précis impliqués dans leur dégradation sont inconnus, même s'ils font sans doute partie du processus normal de régulation de la transcription. Notre hypothèse stipule que RanBPM pourrait moduler l'activité transcriptionnelle des TRs en influençant leur stabilité. Nos objectifs étaient de caractériser la dégradation de TR[bêta]1, puis d'étudier l'effet de RanBPM sur ce processus. Nos analyses pulse chase confirment que TR[bêta]1 est dégradé par la voie Ub-Pr et mettent en évidence une dégradation atypique de TR[bêta]1. En effet, en absence de T[indice inférieur 3], la dégradation de TR[bêta]1 débute plus de 30 minutes après le début de la période de chase, 44% des récepteurs restent non dégradés après 180 minutes de chase et la demi-vie estimée est de 134 min, alors qu'en présence de T[indice inférieur 3], la dégradation débute immédiatement, 28% des récepteurs restent non dégradés après 180 minutes de chase et la demi-vie estimée est de 104 min. Nos analyses de fractionnement cellulaire, en trois fractions (cytoplasmique, nucléaire soluble et nucléaire insoluble), démontrent la présence prédominante de TR[bêta]1 dans la fraction nucléaire insoluble correspondant aux protéines associées à la chromatine et/ou la matrice nucléaire. De plus, nos expériences d'immunobuvardages de type Western en présence de cycloheximide révèlent des différences dans la cinétique de disparition de TR[bêta]1 selon la fraction dans laquelle il a été isolé: (i) dans le cytoplasme, TR[bêta]1 est relativement stable en absence d'HTs et diminue rapidement en présence d'HTs, (ii) dans la fraction soluble du noyau TR[bêta]1 disparaît plus rapidement en présence qu'en absence d'HTs et (iii) dans la partie insoluble du noyau TR[bêta]1 apparaît stable en présence et en absence d'HTs et un traitement de 20 minutes avec la T[indice inférieur 3] augmente transitoirement la quantité de TR[bêta]1 dans cette fraction suggérant un déplacement des populations cytoplasmique et nucléaire soluble vers la population associée à la chromatine et/ou à la matrice nucléaire. Ces résultats témoignent donc de la co-existence dans la cellule de formes stables et instables de TR[bêta]1 qui pourraient avoir des fonctions distinctes. Par ailleurs, nos résultats d'immunobuvardages de type Western indiquent que RanBPM pourrait a priori avoir un effet protecteur sur la dégradation de TR[bêta]1 puisque sa sur-expression augmente la quantité de TR[bêta]1, alors que la diminution de son expression, par l'utilisation de shRNAs spécifiques, réduit la quantité de TR[bêta]1 détectés dans les extraits cellulaires. Toutefois, nos analyses pulse chase révèlent que RanBPM n'influence pas la cinétique de dégradation de TR[bêta]1, suggérant que l'effet de RanBPM sur la quantité de TR[bêta]1 ne résulte pas d'un effet sur la stabilité protéique. En conclusion, nos résultats mettent en évidence une dégradation atypique de TR[bêta]1 due à la co-existence de différentes populations de TR[bêta]1 possédant des cinétiques de dégradation différentes. De plus, notre étude révèle que RanBPM augmente la quantité protéique de TR[bêta]1, mais n'influence pas la stabilité de TR[bêta]1.

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L’hypertension pulmonaire (HTP) est caractérisée par une augmentation progressive des résistances vasculaires pulmonaires, une élévation de la pression artérielle pulmonaire moyenne (≥25 mm Hg) et un déséquilibre entre la production des médiateurs endothéliaux vasoconstricteurs et vasodilatateurs conduisant ainsi à une insuffisance cardiaque droite. Les mimétiques de la prostaglandines (PG)I2 (prostacycline), tels que l'iloprost et le tréprostinil, constituent un des traitements majeurs de l’HTP. L’efficacité des traitements utilisés dans l’http étant évaluée principalement sur l’amélioration de la tolérance à l’effort et la diminution de la dyspnée, il est important d’analyser leurs effets vasodilatateurs artériels mais aussi veineux pulmonaires ainsi que les effets bronchodilatateurs. Ces travaux décrivent les effets, in vitro, de la PGI2, de la PGE2 et de leurs mimétiques sur la réactivité des préparations vasculaires (artères et veines) pulmonaires et bronchiques humaines provenant de patients contrôles ou ayant une HTP. Nous avons caractérisé les différents récepteurs aux prostanoïdes impliqués dans ces réponses. Nos travaux suggèrent que les mimétiques de la PGI2, le treprostinil et l’iloprost, utilisés en clinique, sont d’une part de puissants vasodilatateurs à la fois des artères et des veines pulmonaires et d’autre part, de puissants bronchodilatateurs. Certains mimétiques de la PGI2 (iloprost et tréprostinil) ont des effets vasodilatateurs proportionnels sur les artères et veines pulmonaires. D’autres mimétiques de la PGI2 (béraprost) entraînent une vasodilatation artérielle pulmonaire plus importante que la vasodilatation veineuse. Ceci pourrait entraîner un œdème pulmonaire ou un moindre effet bénéfique sur la correction de la dyspnée. Nous avons mis en évidence une diminution de l’expression des récepteurs IP et DP dans les préparations vasculaires des patients ayant une HTP versus les patients contrôles. Cette diminution est associée avec la réduction de la relaxation des veines pulmonaires induite par le tréprostinil. De même, nous avons montré une diminution de l’expression du récepteur EP4 dans les voies respiratoires des patients ayant une HTP de type 3 ; elle est associée à la réduction de la bronchodilatation induite par les agonistes du récepteur EP4. La correction de cette diminution pourrait être une nouvelle perspective thérapeutique chez ces patients. Nos résultats permettent une meilleure compréhension des effets bénéfiques ou délétères, pharmacologiques et thérapeutiques des mimétiques de la PGI2 déjà utilisées en clinique dans le traitement de l’HTP. A travers la voie PGE2/EP4, nos travaux ouvrent de nouvelles perspectives physiopathologiques et potentiellement thérapeutiques. / Pulmonary hypertension (PH) is characterized by a progressive increase of pulmonary vascular resistance, an increase of mean pulmonary arterial pressure (≥25 mm Hg) and an imbalance between the production of endothelial vasoconstrictor and vasodilator mediators leading to right heart failure. Prostaglandin (PG)I2 (prostacyclin) mimetics, such as iloprost and treprostinil, are major therapeutic tools for this pathology. The efficacy of the treatments used in PH is evaluated primarily on the improvement of exercise tolerance and reduction of dyspnea. For this reason it is important to analyze not only the arterial but also the venous vasodilator effects as well as bronchodilator effects. This thesis describes the in vitro effects of PGI2, PGE2 and their mimetics on the reactivity of human pulmonary vascular (ateries and veins) and bronchial preparations derived from patients with or without PH. We also characterized different prostanoid receptors involved in these responses. Our results suggest that PGI2 mimetics, treprostinil and iloprost, used clinically, are potent vasodilators for both pulmonary arteries and veins and also potent bronchodilators. Some PGI2 mimetics (treprostinil and iloprost) have proportional vasodilatory effects on the pulmonary arteries and veins. Other PGI2 mimetics, such as beraprost, cause greater pulmonary arterial vasodilation than venous vasodilation. This may cause pulmonary edema or less beneficial effects on dyspnea correction. We showed decreased expression of IP and DP1 receptors in vascular preparations of patients with PH versus control patients. This decrease is associated with reduced relaxation response of pulmonary veins induced by treprostinil. Similarly, we demonstrated a reduction in EP4 receptor expression in bronchial preparations of patients with group 3 PH. This down regulation was associated with reduced bronchodilation induced by EP4 agonists. The correction of this down-regulation may be a new therapeutic perspective in these patients. Our results enhance our understanding of the beneficial or deleterious, pharmacological and therapeutic effects of PGI2 mimetics already used clinically in the treatment of PH. Through PGE2/EP4 pathway our work opens new physiopathological and potential therapeutic perspectives.

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