L'objectif de mes travaux de doctorat était d'approfondir les connaissances sur le mode d'action du répresseur transcriptionnel Fep1 et de découvrir les mécanismes posttraductionnels par lesquels son activité serait régulée. Mes travaux ont été entrepris dans un contexte génétique php4[delta], où la régulation Php4-dépendante a été abolie. Ceci a permis d'exprimer Fep1 constitutivement et par conséquent d'étudier les effets directs du fer sur la protéine en la découplant de sa régulation transcriptionnelle par Php4. Dans le but de mieux caractériser la fonction de liaison à l'ADN de Fep1 dans un contexte in vivo, j'ai procédé par une approche d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Grace à une protéine de fusion TAP-Fep1, j'ai démontré que Fep1 s'associe à la chromatine de manière fer-dépendante. En utilisant différentes versions mutantes de la protéine TAP-Fep1, j'ai démontré que la région N-terminale de Fep1 est requise pour la liaison à la chromatine, cette région couvrant les 241 premiers acides aminés. Le rôle de la région C-terminale serait d'assurer la répression transcriptionnelle des gènes cibles étant donné qu'elle s'associe avec les corépresseurs Tup. Au niveau de la région N-terminale de Fep1, plusieurs motifs sont nécessaires pour une liaison optimale de Fep1 à la chromatine, notamment, deux doigts de zinc (ZF1 et ZF2) et une région riche en résidus cystéines (CRD). Lorsque la région 1-241 est fusionnée au domaine VP16 de transactivation, cette nouvelle protéine agit comme un activateur fer-dépendant, ce qui suggère que le domaine de liaison à la chromatine de Fep1 agit de façon modulaire et ce, indépendamment de la région C-terminale de la protéine. Afin d'élucider le mécanisme post-traductionnel impliqué dans l'inactivation de Fep1 en situation de carence de fer, j'ai procédé par une approche génétique. Grâce à une délétion du gène qui code pour la monothiolglutarédoxine Grx4, j'ai pu démontrer son rôle dans l'inactivation de Fep1 en réponse à la carence en fer. En effet, dans une souche grx4A, Fep1 agit comme un répresseur transcriptionnel constitutif. J'ai pu démontrer que la présence de Grx4 est nécessaire pour assurer le relargage de Fep1 de la chromatine en réponse à la carence en fer. La monothiolglutarédoxine, Grx4, est caractérisée par la présence de deux domaines fonctionnels: un domaine en N-terminal appelé thiorédoxine (TRX) et un domaine C-terminal appelé glutarédoxine (GRX). L'étude d'interaction de Fep1 avec Grx4 a révélé que le domaine TRX interagit avec la région C-terminale de Fep1 et ce, de manière constitutive. Par contre, le domaine GRX de Grx4 s'associe avec la région N-terminale de Fep1 et ce, d'une manière fer-dépendante. De plus, dans une souche grx4[delta], le domaine GRX s'est révélé être nécessaire à la fonction d'inhibition de Fep1 en réponse à la carence en fer. Le régulateur Fep1 possède plusieurs homologues fonctionnels potentiels chez les levures filamenteuses pathogènes, notamment Sfu1 chez Candida albicans. Grâce à l'expression de la protéine Sfu1 dans une souche fep1[delta], nous avons révélé le haut degré de conservation entre ces deux facteurs de transcription. En effet, l'expression hétérologue de Sfu1 dans S. pombe restaure tous les phénotypes observés suite à l'inactivation du gène fep1[indice supérieur +]. En conclusion, durant mes travaux de doctorat, j'ai caractérisé des déterminants moléculaires qui dictent la fonction du répresseur transcriptionnel Fep1. Ainsi, j'ai déterminé des régions nécessaires de Fep1 qui assurent sa liaison à la chromatine. J'ai aussi identifié un nouveau mécanisme de régulation post-traductionnelle de Fep1 faisant intervenir la monothiolglutarédoxine Grx4. De plus, j'ai démontré le potentiel qu'offre la compréhension des mécanismes de régulation de l'homéostasie du fer chez la levure à fission, puisque ce modèle peut être transposé jusqu'à un certain degré aux autres levures pathogènes, notamment, C. albicans. Enfin, étant donné l'importance de l'assimilation du fer pour le pouvoir infectieux de plusieurs levures pathogènes, il devient évident que les modes de régulation de l'acquisition du fer doivent être élucidés afin de contrer les levures pathogènes"--Résumé abrégé par UMI

L'autophagie est un processus d'autodigestion qui se produit dans toutes les cellules eucaryotes et conduit à la dégradation d'éléments du cytoplasme (organites, macromolécules) par le lysosome. Ce mécanisme, qui se produit de manière basale, permet le renouvellement du contenu cytoplasmique mais également la survie cellulaire lorsqu'il est induit par différents stress (carence nutritionnelle, hypoxie…). L'autophagie est alors impliquée dans diverses pathologies comme les maladies neurodégénératives et le cancer car sa dérégulation peut grandement perturber l'homéostasie cellulaire. Le but de ma thèse est de déterminer le rôle de la protéine nucléaire et cytoplasmique BAT3 dans l'autophagie et d'étudier son mécanisme de régulation. Cette protéine de 150 kDa, également appelée BAG6 ou Scythe, est composée de nombreux domaines protéiques (UBL, Prolin-rich, NLS, BAG) qui lui permettent d'interagir avec de multiples partenaires. Sa fonction majeure réside dans le contrôle qualité du cytoplasme mais BAT3 est aussi impliquée dans l'immunité ou l'apoptose. Ce travail identifie la protéine BAT3 comme essentiel pour l'autophagie basale et induite. Nous montrons que son mécanisme d'action passe par la régulation de la localisation de l'acétyltransférase p300 et l'acétylation de ces substrats : p53 et une protéine de la machinerie de l'autophagie : ATG7. En effet, BAT3 (i) limite la présence de p300 dans le cytosol en (ii) maintenant un faible et régulable niveau d'acétylation d'ATG7 et (iii) permet l'acétylation de p53 dans le noyau au cours de la carence nutritionnelle, événement indispensable à l'induction de l'autophagie. / Autophagy, literally meaning self-eating, is a highly evolutionary conserved process in eukaryotes in which parts of the cytoplasm (organelles, macromolecules) are degraded by lysosomes. Basal autophagy is a quality control mechanism allowing the renewal of the cytoplasm but autophagy is also induced by cellular stress (starvation, hypoxia…) to improve cell survival. Autophagy has been implicated in several physiopathologies such as cancer or neurodegenerative diseases. Deregulations of autophagy may profoundly affect homeostasis.The purpose of my thesis is to explore the role of the nucleo-cytoplasmic shuttling protein BAT3 in autophagy and the mechanism of BAT3-dependent autophagy.Also known as BAG6 or Scythe, this 150 kDa protein is composed of various domain (UBL, Prolin-Rich, NLS, BAG) by which BAT3 interacts with multiple partners. The major of role BAT3 seems to be the protein quality control but BAT3 is also implicated in immunity and apoptosis. Our work demonstrates that the protein BAT3 is essential for basal and starvation-induced autophagy. We show that BAT3 regulation of autophagy is mediated by the modulation of p300 acetyltransferase intracellular localization and acetylation of two subtrates: p53 and the autophagy-related protein ATG7. Indeed, Bat3 allows: (i) the limitation of p300 into cytosol resulting in (ii) the maintenance of a low level of ATG7 acetylation and (iii) the increase of the starvation-induced p53 autophagy leading to the induction of autophagy.

La recrudescence de la tuberculose et l'apparition des souches de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) résistantes aux antibiotiques souligne la nécessité de rechercher de nouveaux antituberculeux avec de nouveaux mécanismes d'action. Les mycobactéries possèdent une membrane externe (appelée aussi mycomembrane), très riche en lipides qui leur confère une imperméabilité remarquable. Les constituants majeurs de la mycomembrane sont des acides gras originaux et à très longue chaine, appelés acides mycoliques (AMs). La biosynthèse de ces AMs est essentielle à la croissance mycobactérienne et comporte des enzymes-clefs, dont nombreuses ont été validées comme des cibles prometteuses pour la recherche de nouveaux antituberculeux. Parmi elles, FadD32, une Fatty-acyl AMP Ligase impliquée dans l'étape ultime de cette voie de biosynthèse. Si les propriétés physico-chimiques de l'enzyme ont été caractérisées, la régulation de l'activité de cette enzyme essentielle reste encore à découvrir. La première partie de cette thèse porte sur la mise en évidence de la régulation post-traductionnelle par phosphorylation de FadD32 par des Sérine/Thréonine Protéine Kinases (STPKs) de type eucaryote. Nous avons montré que FadD32 pouvait être phosphorylée in vitro par plusieurs STPKs de Mtb. Cette phosphorylation réversible module négativement l'activité de la protéine, comme démontré pour d'autres protéines de la voie de biosynthèse des AMs. Afin de mieux comprendre l'impact de la phosphorylation par STPK sur la production des AMs et sur la synthèse de la mycomembrane, nous avons surexprimé une STPK de Mtb chez M. smegmatis, espèce modèle des mycobactéries. Nous avons pu observer un changement significatif de la quantité des AMs. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons optimisé et réalisé le criblage biochimique d'une chimiothèque sur l'activité de FadD32 et avons identifié des touches qui devraient servir dans la recherche de nouveaux agents antituberculeux. / The resurgence of tuberculosis (TB), together with the emergence of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), highlights the need for new anti-TB drugs with novel mechanisms of action. Mycobacteria possess an outer membrane (also called mycomembrane), which confers to them a remarkably impermeable cell envelope. The major constituents of the mycomembrane are very long-chain fatty acids with original structures, the so-called mycolic acids (MAs). The biosynthesis of MAs is essential for mycobacterial growth and involves several key enzymes, many of which have been validated as promising anti-TB drug targets. Among them, FadD32, a Fatty-acyl AMP Ligase implicated in the last step of the biosynthesis pathway, has been characterized biochemically and its protein structure has been solved recently. However, the regulation aspect of the enzyme is still to be deciphered. The first part of the thesis focuses on the post-translational regulation by protein phosphorylation of FadD32 by eukaryotic-like Serine/Threonine Protein Kinases (STPKs). We showed that FadD32 is the substrate of several Mtb STPKs. The reversible phosphorylation negatively modulates the adenylation activity of the protein. In order to determine the impact of the post-translational regulation on MA production, we over-expressed a STPK of Mtb in M. smegmatis, a validated surrogate of Mtb. We observed a significant change in the amounts of MAs. In the second part of the thesis, we screened a chemical library against FadD32 and identified several hits that should help in the development of new anti-TB agents.

Du fondamental à la clinique, cette thèse a été construite autour d’un seul mot clefs : KCC2, grâce à plusieurs projets collaboratifs. Ce co-transporteur d’ion est une molécule à plusieurs facettes dont la multiplicité des rôles et ses implications dans diverses pathologies font d’elle un élément clef de l’organisme vivant. En plus des études phylogénétiques et thérapeutiques effectuées au cours de cette période, mon principal travail a été de déterminer le rôle physio-pathologiques in vitro et in vivo d’un mécanisme de régulation post-traductionnelle de KCC2. Nous avons dans un premier temps montré que la déphosphorylation des Thréonines (Thr) 906 et 1007 in vitro était un puissant activateur de la protéine. En effet, nous avons montré que l’état de phosphorylation des sites dicté par la voie Wnk-Spak/OSR1 était impliqué dans le niveau d’expression en surface de la protéine. Par la suite, nous avons pu révéler que les souris porteuses d’une mutation phospho-mimétique Glu906 et Glu1007 “(KCC2E/+)” sur un allèle de la protéine, présentaient un décalage de l’émergence de la force inhibitrice GABAergique, une altération de la balance excitation/inhibition, ainsi qu’une augmentation de la susceptibilité à générer des crises. De plus, ces même souris développent des troubles de la communication chez le jeune ainsi qu’un défaut de sociabilité chez l’adulte, deux symptômes clefs des TSA. Ces résultats suggèrent que la régulation post-traductionnelle est un mécanisme physio-pathologique clef de la protéine. / From basic to clinical aspects, this thesis comprises different collaborative projects focusing on KCC2. KCC2 is a complex protein with multiple roles and implications in various pathologies that makes this molecule a key element of living organisms. In addition to the phylogenetic and therapeutic studies performed during this period, my main work has been to determine the in vitro and in vivo physio-pathological role of a KCC2 post-translational regulatory mechanism. We first showed in vitro that dephosphorylation of Threonines (Thr) 906 and 1007 was a potent activator of the protein. We have shown that phosphorylation state by the Wnk-Spak/OSR1 pathway of these two residues is implicated in the level surface expression of KCC2. Subsequently we have revealed that mice carrying in one allele a phospho-mimetic mutations Glu906 and Glu1007 “(KCC2E/+)”, preventing the developmental dephosphorylation at these sites, exhibited a delayed onset of fast synaptic GABA inhibition, a decreased ratio of spontaneous GABA- to glutamate-driven post-synaptic responses, and a significantly reduced flurothyl-induced seizure threshold. Furthermore, KCC2E/+ pups and adult mice, respectively, exhibited impaired communication and sociability, classic ASD phenotypes. These results suggest that post-translational regulation is a key physio-pathological mechanism of KCC2.

Les neurodégénérescences avec accumulation de fer dans le cerveau (Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation, NBIA) sont des maladies neurodégénératives progressives, génétiquement hétérogènes. On connait actuellement 11 gènes de ces maladies mais pour la plupart d’entre eux leur lien avec l’accumulation en fer est encore incompris. Ce travail de thèse présente deux nouveaux gènes de NBIA identifiés par séquençage d’exome dans deux familles indépendantes. Le premier gène, REPS1, est impliqué dans le recyclage de l’endosome. Les fibroblastes de patients sont caractérisés par une accumulation de fer qui est corrigée par l’expression de l’ADNc de REPS1 dans ces cellules. Le deuxième gène, CRAT, code une carnitine acétyltransferase et le déficit de β-oxydation détecté dans les fibroblastes du patient a été corrigé par l’expression de l’ADNc CRAT normal. Le rôle de REPS1 dans le recyclage de l’endosome a mis sur la voie du mécanisme physiopathologique des NBIA. En effet, les fibroblastes des patients REPS1 et CRAT mais aussi d’autres patients avec des mutations d’autres gènes connus de NBIA (PANK2, PLA2G6, FA2H, C19ORF12) ont une accumulation massive en fer et une anomalie de recyclage du récepteur à la transferrine (TfR1). TfR1 permet l’entrée du fer par endocytose et son expression est régulée par le contenu en fer des cellules. La seule régulation connue de l’homéostasie du fer se fait au niveau post-transcriptionnel par le système IRP/IRE qui est fonctionnel dans les fibroblastes NBIA alors que la protéine TfR1 s’accumule. Cette accumulation de fer montre ainsi qu’il existe une régulation post-traductionnelle, jusqu’ici inconnue, et qui n’est pas fonctionnelle dans les NBIA. Nous avons pu montrer que cette régulation se faisait par une palmitoylation du TfR1, déficitaire dans les NBIA, mais restaurée par l’artesunate. Ainsi quel que soit le gène muté, tous les NBIA résultent d’une anomalie de recyclage du TfR1 permettant de les définir comme des maladies du trafic intracellulaire. La deuxième partie de la thèse s’intéresse au mécanisme physiopathologique de l’ataxie de Friedreich (FRDA) caractérisée elle aussi par une accumulation de fer dans le cerveau. FRDA est due à des expansions de triplets dans le premier intron du gène FXN conduisant à l’extinction de FXN et de PIP5K1B situé en amont. L’étude de modèles cellulaires dans lesquels le gène FXN et/ou PIP5K1B ont été éteints par siRNA et de fibroblastes de patients a permis de mettre en évidence une anomalie de l’homéostasie du fer qui rappelle celle observée dans les NBIA. L’ensemble de ces résultats a permis de comprendre le mécanisme physiopathologique des NBIA, de mettre à jour une régulation encore inconnue de l’homéostasie du fer mais aussi d’envisager une voie de traitement des NBIA. / Neurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA) encompasses a group of rare neurogenerative disorders with different clinical and molecular features, underlined by progressive extrapyramidal dysfunction and iron accumulation in the brain. To date, mutations in 11 genes are currently known. Nevertheless for most of them their link with iron accumulation is still misunderstood. This work presents two novel NBIA genes identified by exome sequencing in two independent families. The first gene, REPS1, is involved in endosome recycling. Patient’s fibroblasts are characterized by iron overload corrected by wild-type REPS1 cDNA overexpression. The second gene, CRAT, encodes a carnitine acetyltransferase and a β-oxidation deficit in patient’s fibroblasts has been fixed by overexpression of wild-type CRAT cDNA. The function of REPS1 in endosome recycling put on the path of the NBIA pathophysiological mechanism. Indeed, fibroblasts of REPS1 patients but also from other patients mutated in various NBIA genes (CRAT, PANK2, PLA2G6, FA2H, C19ORF12) present massive iron accumulation and abnormal transferrin receptor (TfR1) recycling. TfR1 allows iron uptake by endocytosis and its expression is regulated by the iron cellular status. The only known regulation of iron homeostasis occurs at the posttranscriptional level by the IRE/IRP system which is functional in NBIA fibroblasts whereas TfR1 protein accumulates. This iron accumulation highlights a yet unknown posttranslational regulation which is not functional in NBIA. We have been able to demonstrate that this regulation occurs via TfR1 palmitoylation, which is defective in NBIA, but restored by artesunate. Hence, whatever the disease gene, all NBIA gave rise to abnormal TfR1 recycling which allows defining NBIA as intracellular trafficking disease. The second part of the thesis focused on the pathophysiological mechanism of the Friedreich ataxia (FRDA) also characterized by brain iron overload . FRDA is related to triplets expansions in the first intron of FXN gene leading to the extinction of FXN and PIP5K1B upstream gene. Studying cellular models knocked down for FXN and/or PIP5K1B by siRNA and patients’ fibroblasts of patients allowed to detect abnormal iron homeostasis reminiscent of NBIA. All these results allowed to decipher the NBIA pathophysiological mechanism, to highlight a yet unknown iron homeostasis regulation and to open possible ways towards therapeutic drugs for NBIA.

La bactérie à Gram-négatif Pseudomonas aeruginosa est un pathogène humain opportuniste qui peut causer des infections chroniques pouvant conduire à la mort des patients, et plus particulièrement ceux atteints de la mucoviscidose. Il a été montré qu'un de ses trois systèmes de sécrétion de type VI (SST6) est actif durant les infections chroniques, le SST6-H1. P. aeruginosa est capable d'injecter des toxines de type bactériolytique directement dans le périplasme des autres bactéries à Gram-négatif grâce au SST6-H1, ce qui laisse penser que cette nanomachine pourrait être capitale dans la compétitivité de P. aeruginosa dans les niches polymicrobiennes, comme par exemple un poumon infecté. Cette nanomachine insérée dans l'enveloppe bactérienne est régulée au niveau post-traductionnel par une voie de phosphorylation ressemblant à celles des eucaryotes. Cette voie est constituée par une kinase, PpkA, et une phosphatase, PppA, qui modulent ensemble le niveau de phosphorylation de la protéine Fha1. Nous avons démontré que quatre protéines spécifiques de Pseudomonas appelées TagT, TagS, TagR et TagQ, agissent en amont du couple PpkA/PppA, et sont indispensables pour l'activation du SST6-H1. De plus, elles sont aussi nécessaires lors de compétitions entre P. aeruginosa et d'autres bactéries. Nous avons montré que TagR, connue comme étant une protéine périplasmique, est en fait associée à la membrane externe et cette localisation dépend de TagQ, une lipoprotéine ancrée dans le feuillet interne de la membrane externe. TagT et TagS forment un transporteur de type ABC qui a une activité d'ATPase. L'association de TagR à la membrane externe a été mise en évidence par des études de protéomique à haut débit qui avaient pour but la caractérisation des membranes externe et interne de P. aeruginosa. Grâce à l'analyse des résultats, unmodèle de l'assemblage du SST6-H1 au sein de l'enveloppe a pu être proposé. Ce travail a permis l'identification de plus de 1700 protéines, parmi elles un complexe multi-protéique incluant MagD, une protéine homologue à la macroglobuline humaine. Les résultats obtenus lors de la caractérisation de ce complexe sont aussi présentés dans ce manuscrit.

La bactérie à Gram-négatif Pseudomonas aeruginosa est un pathogène humain opportuniste qui peut causer des infections chroniques pouvant conduire à la mort des patients, et plus particulièrement ceux atteints de la mucoviscidose. Il a été montré qu‘un de ses trois systèmes de sécrétion de type VI (SST6) est actif durant les infections chroniques, le SST6-H1. P. aeruginosa est capable d'injecter des toxines de type bactériolytique directement dans le périplasme des autres bactéries à Gram-négatif grâce au SST6-H1, ce qui laisse penser que cette nanomachine pourrait être capitale dans la compétitivité de P. aeruginosa dans les niches polymicrobiennes, comme par exemple un poumon infecté. Cette nanomachine insérée dans l'enveloppe bactérienne est régulée au niveau post-traductionnel par une voie de phosphorylation ressemblant à celles des eucaryotes. Cette voie est constituée par une kinase, PpkA, et une phosphatase, PppA, qui modulent ensemble le niveau de phosphorylation de la protéine Fha1. Nous avons démontré que quatre protéines spécifiques de Pseudomonas appelées TagT, TagS, TagR et TagQ, agissent en amont du couple PpkA/PppA, et sont indispensables pour l'activation du SST6-H1. De plus, elles sont aussi nécessaires lors de compétitions entre P. aeruginosa et d'autres bactéries. Nous avons montré que TagR, connue comme étant une protéine périplasmique, est en fait associée à la membrane externe et cette localisation dépend de TagQ, une lipoprotéine ancrée dans le feuillet interne de la membrane externe. TagT et TagS forment un transporteur de type ABC qui a une activité d'ATPase. L'association de TagR à la membrane externe a été mise en évidence par des études de protéomique à haut débit qui avaient pour but la caractérisation des membranes externe et interne de P. aeruginosa. Grâce à l'analyse des résultats, unmodèle de l'assemblage du SST6-H1 au sein de l'enveloppe a pu être proposé. Ce travail a permis l'identification de plus de 1700 protéines, parmi elles un complexe multi-protéique incluant MagD, une protéine homologue à la macroglobuline humaine. Les résultats obtenus lors de la caractérisation de ce complexe sont aussi présentés dans ce manuscrit. / Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen that can cause severe infections and death in chronically infected cystic fibrosis (CF) patients. It has been shown that one of its three Type VI Secretion Systems (T6SS), the H1-T6SS, is active during chronic infections in CF patients. P. aeruginosa injects bacteriolytic toxins directly into other Gram-negative bacteria by means of its H1-T6SS, which could be of high importance in its outcome in complex niches such as an infected lung. This trans-envelope nanomachine is posttranslationally regulated by a eukaryotic-like phosphorylation pathway, which includes a kinase-phosphatase pair, PpkA and PppA, respectively. In this work, TagT, TagS, TagR and TagQ, Pseudomonas specific T6SS proteins that are encoded in the same operon as Ppka, PppA and Fha1, were analysed functionally and biochemically. We found that these four proteins are indispensable for the activation of H1-T6SS, by acting upstream of the phosphorylation checkpoint. Moreover, they were also needed for intra- and inter-species fitness mediated by H1-T6SS. We discovered that TagR, a periplasmic protein, associates with the outer membrane (OM) of P. aeruginosa in a TagQ-dependent manner. TagQ is an OM lipoprotein that faces the periplasm. TagT and TagS form a membrane-bound complex, an ABC transporter, with ATPase activity. TagR association with the OM was discovered by shotgun mass spectrometry analyses of the OM and the inner membrane (IM) of P. aeruginosa. In this work, the IM and OM sub-proteomes of P. aeruginosa are also presented, with highlights on T6SS global assembly. Moreover, these two sub-proteomes allowed the identification of a novel envelope-associated complex with macroglobulin-like protein, MagD. The studies concerning this protein and its partners in P. aeruginosa are also presented in this manuscript.

Le facteur de transcription p73 est impliqué dans des pathologies du système neuronal (maladie d’Alzheimer, neuroblastome…) en régulant le cycle cellulaire, l’apoptose et la différenciation neuronale.Identifier les modifications post-traductionnelles de p73 permettrait de mieux comprendre les fonctions biologiques des isoformes p73 et leurs régulations. Notre analyse bio-informatique prédit entre autres, trois sites sur p73 potentiellement phosphorylés par la calcium-calmoduline dépendante kinase 2 (CamKII), qui est aussi impliquée dans le cycle cellulaire, l’apoptose et la différenciation neuronale. Après avoir confirmé la phosphorylation de p73 par cette kinase in vitro, nous avons démontré que la CamKII favorise l’activité transcriptionelle de p73 et modifie le niveau de protéique des isoformes de p73. L’étude de la caractérisation des sites impliqués dans cette régulation suggère que les effets de la CamKII sur p73 résultent davantage de la coopération de l’ensemble des sites que d’un seul site précis. Par ailleurs, cette étude moléculaire s’inscrit dans un contexte physiologique précis où l’apoptose neuronale induit par le déséquilibre de l’homéostasie calcique s’expliquerait en partie par la signalisation p73-CamKII. / The transcription factor p73 is implicated in neurodegenerativ diseases (Alzheimer disease, neuroblastoma…) by regulating cell cycle, neuronal apoptosis and differenciation.Identifying the post-translationnal modifications on p73 would allow to better understand the p73 biological functions and regulations. Bioinformatic analyses predict amongst others, three potential phosphorylation sites on p73 for the calcium-calmodulin dependant kinase 2 (CamKII), which is also implicated in cell cycle, neuronal apoptosis and differenciation. After showing the p73 phosphorylation by CamKII in vitro, we demonstrated that CamKII favors the p73 transcriptional activity and modulates the proteic expression of the p73 isoforms. The study to identify the sites implicated in these CamKII effects highlights cooperation between the sites instead of the prevalence of a specific site.. Besides this molecular approach, we also investigate the implication of this regulation in a physiologic context. Our results reveal that the neuronal death triggered by a calcic homeostasis alteration could be mediated by the p73-CamKII signalization.

L'abondance d'éléments génétiques mobiles dans le génome humain a un impact critique sur son évolution et son fonctionnement. Même si la plupart des éléments transposables sont inactifs en raison de l'accumulation de mutations, le rétrotransposon LINE-1 (Long Interspersed Element-1 ; ou L1) continue de se mobiliser et d'influer sur notre génome. Il a ainsi contribué à l'évolution de l'homme moderne, mais aussi à l'apparition de maladies génétiques. Les séquences du rétrotransposon L1 correspondent à 17% de la masse totale de l’ADN humain. Une copie active de L1 est capable de se mobiliser de manière autonome par un mécanisme de type «copier-coller» qui met en jeu un intermédiaire ARN et une étape de transcription inverse. Cependant, peu de choses sont connues sur les voies cellulaires impliquées dans la mobilité de L1. Notre laboratoire a découvert, par des cribles double-hybride, une interaction entre la protéine ORF2p de L1 et le récepteur α associé aux œstrogènes (ERRα), un membre de la famille des récepteurs nucléaires. Ici, nous avons confirmé et étendu cette observation à plusieurs autres membres de la superfamille des récepteurs de stéroïdes en utilisant un test de double-hybride fluorescent (F2H) en culture cellulaire. Pour mieux comprendre le rôle potentiel d’ERRα dans le cycle de rétrotransposition de L1, nous avons effectué des expériences de suppression et de surexpression qui suggèrent qu’ERRα est un régulateur positif de la rétrotransposition. Collectivement, ces données relient les voies de signalisation des stéroïdes avec la régulation post-traductionnelle de la rétrotransposition de L1, ce qui suggère un modèle par lequel ERRα et probablement autres récepteurs nucléaires peuvent recruter le RNP L1 vers des emplacements chromosomiques spécifiques. / The abundance of genetic mobile elements in our DNA has a critical impact on the evolution and function of the human genome. Even if most transposable elements are inactive due to the accumulation of mutational events, the Long INterspersed Element-1 (LINE-1 or L1) retrotransposon continues to diversify and impact our genome, being involved in the evolution of modern humans and in the appearance of genetic diseases or in tumorigenesis. L1 forms 17% of human DNA. It is autonomously active being replicated through an RNA-mediated ‘copy-and-paste’ mechanism. The L1 element encodes two proteins, ORF1p and ORF2p, which associate with the L1 mRNA to form L1 ribonucleoprotein particles, the core of the retrotransposition machinery. However, little is known about the cellular pathways involved in L1 replication. Our laboratory has discovered by yeast 2-hybrid screens an interaction between L1 ORF2p and the estrogen-related receptor α (ERRα), a member of the nuclear receptor family. Here, we confirmed and extended this observation to several other members of the steroid receptor superfamily using a fluorescent two-hybrid assay (F2H) in human cultured cells. To get further insight into the potential role of ERR in L1 replication cycle, we performed ERR siRNA-mediated knock-down and overexpression experiments, which suggest that ERR is a positive regulator of retrotransposition. Moreover, the artificial tethering and concentration of ERR to a large and repetitive genomic array inhibits retrotransposition. Collectively, these data link steroid signaling pathways with the post-translational regulation of L1 retrotransposition, suggesting a model by which ERRα, and probably several other nuclear receptors, can recruit the L1 RNP to specific chromosomal locations, acting as tethering factors.