Bien que l’évolution de la résistance aux médicaments soit l'un des plus grands défis dans la lutte contre les maladies infectieuses, beaucoup de phénomènes restent inexpliqués. Dans le cas de la leishmaniose, la résistance est un problème majeur depuis plusieurs années. Cette maladie zoonotique négligée est causée par le parasite protozoaire Leishmania, transmis par des phlébotomes lors du repas sanguin. Chez l’humain, elle se décline en trois formes principales : viscérale, cutanée et muco-cutanée. La leishmaniose peut aussi se développer chez les chiens infectés, qui constituent un réservoir majeur de transmission. Sans vaccin efficace, le contrôle de la maladie repose principalement sur la chimiothérapie, mais peu de molécules homologuées sont disponibles. En outre, les mêmes produits sont utilisés chez les chiens et les humains, ce qui favorise l'émergence et la propagation de souches résistantes aux médicaments. Leishmania est en effet connu pour détenir d’incroyables particularités génomiques (telles que la formation d’amplicons circulaires contenant des gènes de résistance) qui lui permettent de survivre dans des conditions de stress, telles que la pression médicamenteuse. Par ailleurs, Leishmania est un eucaryote qui a conservé la capacité de produire des vésicules extracellulaires (EVs) au cours de l’évolution. Ces particules de taille nanométrique sont produites naturellement par la majorité des cellules biologiques et ont un contenu riche en protéines, lipides et acides nucléiques. Bien que des caractéristiques clés des EVs du protozoaire aient été découvertes, aucune étude n’a encore été réalisée sur les EVs de souches résistantes. Ainsi, cet aspect constitue le cœur de mon projet de recherche de doctorat : l’étude des EVs de Leishmania et leur rôle dans le phénomène de la résistance aux médicaments. Nos travaux sont les premiers à démontrer que les mécanismes de résistance aux médicaments peuvent induire des changements dans la morphologie, la taille et la distribution des EVs de Leishmania. Nous avons identifié le protéome de base des EVs du parasite et nous avons mis en évidence des protéines enrichies dans les EVs libérées par des parasites résistants à l'antimoine, à la miltéfosine et à l'amphotéricine B. Nous avons également étudié le contenu en ADN des EVs de parasites résistants et confirmé l'enrichissement des amplicons porteurs de gènes de résistance aux médicaments, associés aux EVs. En complément, nos tests de transferts d’EVs ont prouvé que ces vésicules permettent le transfert horizontal de gènes de résistance : un mécanisme alternatif de résistance aux médicaments. Finalement, nous avons montré que les EVs des parasites résistants améliorent la croissance des promastigotes et réduisent l'accumulation de ROS, ce qui favorise la survie et la propagation des populations résistantes aux médicaments. En conclusion, ces découvertes permettront le développement de nouveaux tests diagnostiques et de nouvelles approches thérapeutiques pour certaines maladies infectieuses zoonotiques, basés sur les profils des EVs. De plus, elles ont une importance majeure dans la compréhension de la résistance médicamenteuse et prouve que les EVs fonctionnent comme des médiateurs efficaces dans le transfert horizontal de gène. Ce nouveau mécanisme facilite ainsi la transmission des gènes de résistance aux médicaments entre les parasites et favorise leur survie lorsqu'ils sont confrontés à des environnements stressants. / Although the evolution of drug resistance is one of the greatest challenges in the fight against infectious diseases, many phenomena remain unexplained. In the case of leishmaniasis, resistance has been a major problem for several years. This neglected zoonotic disease is caused by the protozoan parasite Leishmania, transmitted by sandflies during the blood meal. In humans, it comes in three main forms: visceral, cutaneous, and mucocutaneous. Leishmaniasis can also develop in infected dogs, which constitute a major reservoir of transmission. Without an effective vaccine, the control of the disease relies mainly on chemotherapy, but few approved molecules are available. Furthermore, the same products are used in dogs and humans, which promotes the emergence and spread of drug-resistant strains. Leishmania is indeed known to possess incredible genomic peculiarities (such as the formation of circular amplicons containing resistance genes) which allow it to survive under stressful conditions, such as drug pressure. Furthermore, Leishmania is a eukaryote that has retained the ability to produce extracellular vesicles (EVs) during evolution. These nano-sized particles are produced naturally by most biological cells and have a rich content of proteins, lipids, and nucleic acids. Although key characteristics of the protozoan EVs have been discovered, no studies have yet been performed on the EVs of resistant strains. Thus, this aspect constitutes the heart of my doctoral research project: the study of Leishmania EVs and their role in the phenomenon of drug resistance. Our work is the first to demonstrate that drug resistance mechanisms can induce changes in the morphology, size, and distribution of Leishmania EVs. We have identified the basic proteome of parasite EVs, and we have demonstrated enriched proteins in EVs released by parasites resistant to antimony, miltefosine and amphotericin B. We also studied the DNA content of EVs from resistant parasites and confirmed the enrichment of amplicons carrying drug resistance genes associated with EVs. In addition, our EV transfer tests have proven that these vesicles allow the horizontal transfer of resistance genes: an alternative mechanism of drug resistance. Finally, we showed that EVs from resistant parasites enhance promastigote growth and reduce ROS accumulation, which promotes the survival and spread of drug-resistant populations. In conclusion, these discoveries will allow the development of new diagnostic tests and new therapeutic approaches for certain zoonotic infectious diseases, based on the profiles of EVs. Moreover, these findings are of major importance in the understanding of drug resistance and prove that EVs function as effective mediators in horizontal gene transfer. This new mechanism thus facilitates the transmission of drug resistance genes between parasites and promotes their survival when confronted with stressful environments.

Plants are continuously confronted with a multitude attack either abiotic but also biotic in nature. Interestingly, despite the abundance of bacteria that plant has to face, only few are able to induce death or disease in the host plant. It is therefore likely that, in addition to secondary metabolites with antimicrobial properties, plants also synthesize secondary metabolites which are able to inhibit the expression of virulence genes in bacteria without affecting either growth or viability, which allows plants to host willingly or not bacterial populations. This work focuses on the identification of such metabolites in Malagasy plants (genera Dalbergia and Combretum) and the demonstration of their inhibitory effect on the expression of virulence genes in two different pathosystems: Rhodococcus fascians (a phytopathogen) and Pseudomonas aeruginosa (an opportunistic pathogen). Thus, two metabolites were isolated using a combination of chromatographic techniques coupled with tests that evaluate the expression of certain genes involved in the virulence mechanisms of these bacteria. The first is a new prenylated isoflavanone, named perbergin, isolated from the bark extract of D. pervillei. It was shown that the perbergin target attR gene expression, encoding a LysR-type transcriptional regulator that plays a key role in regulating the expression of virulence genes of R. fascians and the transition from an epiphytic to a pathogenic lifestyle. Therefore, we have also shown that the expression of all virulence genes known to date in R. fascians is also affected while the expression of genes involved in epiphytic fitness of the bacteria is not altered. In addition, the application of perbergin at the time of infection of plants susceptible to R. fascians shows that this molecule reduces in vivo the virulence of R. fascians, highlighting the potential of perbergin as an anti-infective agent. The second is a flavonoid known as catechin, isolated from the bark extract of C. albiflorum. Catechin significantly inhibits the expression of genes that regulate the mechanism of quorum sensing in P. aeruginosa such as lasI, LasR, rhlI and rhlR but also lasB and rhlA which expression depends on quorum sensing. Therefore, the production of virulence factors such as pyocyanin and elastase is significantly affected. Because of the limited number of our arsenal of antibiotics and their increasing ineffectiveness, the identification of these compounds create a path to an alternative in the fight against pathogenic bacteria and multidrug resistance of pathogenic bacteria to antibiotics. Our results also demonstrate the richness of Malagasy plants as (re)sources of new therapeutic molecules and the importance of widening the range of bacterial targets to be investigated to develop new strategies to fight within the endless war that we are waging against bacteria pathogens.<p><p>Les plantes sont continuellement confrontées à une multitude d’attaques qu’elles soient de nature abiotique ou surtout biotique. Il est intéressant de noter que malgré la multitude de bactéries auxquelles les plantes doivent faire face, seules quelques unes sont capables d’induire la mort ou une maladie chez la plante hôte. Il est dès lors fort probable que, outre les métabolites secondaires ayant des propriétés antimicrobiennes, les plantes synthétisent également des métabolites secondaires capables d’inhiber l’expression des gènes de virulence chez les bactéries sans toutefois affecter ni leur croissance ni leur viabilité, ce qui permet aux plantes de contenir les populations bactériennes qu’elles hébergent de gré ou de force. Ce travail porte sur l’identification de ce type de métabolites dans des plantes malgaches (genres Dalbergia et Combretum) et la démonstration de leurs effets inhibiteurs sur l’expression de gènes de virulence chez deux pathosystèmes différents: Rhodococcus fascians (un phytopathogène) et Pseudomonas aeruginosa (un pathogène opportuniste). Ainsi, deux métabolites ont été isolés en utilisant une combinaison de techniques chromatographiques couplées avec des tests qui évaluent l’expression de certains gènes impliqués dans les mécanismes de virulence de ces bactéries. Le premier est un nouvel isoflavanone prénylé, nommé perbergine, isolé à partir de l’extrait d’écorces de D. pervillei. Il a été montré que la perbergine cible l’expression du gène attR, codant un régulateur transcriptionnel de type LysR qui joue un rôle clé dans la régulation de l’expression des gènes de virulence de R. fascians et qui assure la transition entre un mode de vie épiphyte et le mode pathogène. En conséquence, nous avons également montré que l’expression de l’ensemble des gènes de virulence connu à ce jour chez R. fascians est également affectée alors que l’expression de gènes impliqués dans l’aptitude épiphyte de la bactérie n’est pas altérée. Par ailleurs, l’application de perbergine au moment de l’infection de plantes sensibles à R. fascians montre que cette molécule atténue la virulence de R. fascians in vivo, mettant en exergue le potentiel de la perbergine comme agent anti-infectieux. Le deuxième est un flavonoïde, connu sous le nom de catéchine, isolé de l’extrait d’écorces de C. albiflorum. La catéchine inhibe significativement l’expression des gènes régulateurs du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa tels que lasI, lasR, rhlI et rhlR et également lasB et rhlA dont l’expression dépend du quorum sensing. En conséquence, la production des facteurs de virulence tels que la pyocyanine et l’élastase est significativement affectée. Compte tenu de l’appauvrissement de notre arsenal d’antibiotiques et de leur inefficacité croissante, l’identification de ces composés ouvre une voie alternative de lutte contre les bactéries pathogènes et la multirésistance des bactéries pathogènes aux antibiotiques. Nos résultats démontrent également la richesse des plantes malgaches comme (res)sources de nouvelles molécules thérapeutiques et l’importance d’élargir le champ des cibles bactériennes à investiguer pour développer de nouvelles stratégies de lutte dans la guerre sans fin que nous menons contre les bactéries pathogènes. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished