Le programme d’élimination du paludisme de l’OMS est menacé par l’émergence etla propagation potentielle de parasites de l’espèce Plasmodium falciparum résistants à l’artémisinine. Récemment il a été montré que (a) des SNPs dans une région du chromosome 13 subissaient une forte sélection positive récente au Cambodge,(b) plusieurs sous-populations de parasites de P. falciparum résistants et sensibles à l’artémisinine étaient présentes au Cambodge, (c) des mutations dans le domaine Kelch du gène k13 sont des déterminants majeurs de la résistance à l’artémisinine dans la population parasitaire cambodgien et (d) des parasites de sous-populations du nord du Cambodge près de la Thaïlande et du Laos sont résistants à la méfloquine et portent l’allèle R539T du gène de k13.Il est donc nécessaire d’identifier la base génétique de la résistance dans le but de surveiller et de contrôler la transmission de parasites résistants au reste du monde, pour comprendre le métabolisme des parasites et pour le développement de nouveaux médicaments. Ce travail a porté sur la caractérisation de la structure de la population de P. falciparum au Cambodge et la description des propriétés métaboliques des sous-populations présentes ainsi que des flux de gènes entre ces sous-populations. Le but est d’identifier les bases génétiques associées à la transmission et l’acquisition de résistance à l’artémisinine dans le pays.La première approche par code-barre a été développée pour identifier des sous-populations à l’aide d’un petit nombre de loci. Une approche moléculaire de PCR-LDR-FMA multiplexée et basée sur la technologie LUMINEX a été mise au point pour identifier les SNP dans 537 échantillons de sang (2010 - 2011) provenant de 16centres de santé au Cambodge. La présence de sous-populations le long des frontières du pays a été établie grâce à l’analyse de 282 échantillons. Les flux de gènes ont été décrits à partir des 11 loci du code-barre. Le code-barre permet d’identifier les sous-populations de parasites associées à la résistance à l’artémisinine et à la méfloquine qui ont émergé récemment.La seconde approche de caractérisation de la structure de la population de P.falciparum au Cambodge a été définie sur la base de l’analyse de 167 génomes de parasites (données NGS de 2008 à 2011) provenant de quatre localités au Cambodge et récupérés à partir de la base de données ENA. Huit sous-populations de parasites ont pu être décrites à partir d’un jeu de 21257 SNPs caractérisés dans cette étude. La présence de sous-populations mixtes de parasite apparait comme un risque majeur pour la transmission de la résistance à l’artémisinine. L’analyse fonctionnelle montre qu’il existe un fond génétique commun aux isolats dans les populations résistantes et a confirmé l’importance de la voie PI3K dans l’acquisition de la résistance en aidant le parasite à rester sous forme de stade anneau.Nos résultats remettent en question l’origine et la persistance des sous-populations de P. falciparum au Cambodge, fournissent des preuves de flux génétique entre les sous-populations et décrivent un modèle d’acquisition de résistance à l’artémisinine.Le processus d’identification des SNPs fiables a été ensuite appliqué au génome de Babesia microti. Ce parasite est responsable de la babésiose humain (un syndrome de type malaria) et est endémique dans le nord-est des Etats-Unis. L’objectif était de valider la position taxonomique de B. microti en tant que groupe externe aux piroplasmes et d’améliorer l’annotation fonctionnelle du génome en incluant la variabilité génétique, l’expression des gènes et la capacité antigénique des protéines. Nous avons ainsi identifié de nouvelles protéines impliquées dans les interactions hôte-parasite. / The undergoing WHO Malaria elimination program is threatened by the emergenceand potential spread of the Plasmodium falciparum artemisinin resistant parasite.Recent reports have shown (a) SNPs in region of chromosome 13 to be understrong recent positive selection in Cambodia, (b) presence of P. falciparum parasiteresistant and sensitive subpopulations in Cambodia, (c) the evidence that mutationsin the Kelch propeller domain of the k13 gene are major determinants ofartemisinin resistance in Cambodian parasite population and (d) parasite subpopulations in Northern Cambodia near Thailand and Laos with mefloquine drugresistance and carrying R539T allele of the k13 gene.Identifying the genetic basis of resistance is important to monitor and control thetransmission of resistant parasites and to understand parasite metabolism for the development of new drugs. This thesis focuses on analysis of P. falciparum population structure in Cambodia and description of metabolic properties of these subpopulations and gene flow among them. This could help in identifying the genetic evidence associated to transmission and acquisition of artemisinin resistance over the country.First, a barcode approach was used to identify parasite subpopulations using smallnumber of loci. A mid-throughput PCR-LDR-FMA approach based on LUMINEXtechnology was used to screen for SNPs in 537 blood samples (2010 - 2011) from 16health centres in Cambodia. Based on successful typing of 282 samples, subpopulations were characterized along the borders of the country. Gene flow was described based on the gradient of alleles at the 11 loci in the barcode. The barcode successfully identifies recently emerging parasite subpopulations associated to artemisinin and mefloquine resistance.In the second approach, the parasite population structure was defined based on167 parasite NGS genomes (2008 - 2011) originating from four locations in Cambodia,recovered from the ENA database. Based on calling of 21257 SNPs, eight parasite subpopulations were described. Presence of admixture parasite subpopulation couldbe supporting artemisinin resistance transmission. Functional analysis based on significant genes validated similar background for resistant isolates and revealed PI3K pathway in resistant populations supporting acquisition of resistance by assisting the parasite in ring stage form.Our findings question the origin and the persistence of the P. falciparum subpopulations in Cambodia, provide evidence of gene flow among subpopulations anddescribe a model of artemisinin resistance acquisition.The variant calling approach was also implemented on the Babesia microti genome.This is a malaria like syndrome, and is endemic in the North-Eastern USA. Theobjective was to validate the taxonomic position of B. microti as out-group amongpiroplasmida and improve the functional genome annotation based on genetic variation, gene expression and protein antigenicity. We identified new proteins involved in parasite host interactions.

La leishmaniose est une zoonose à transmission vectorielle due au parasite protozoaire Leishmania ; des co-infections avec plusieurs espèces de Leishmania ont également été rapportées. Il a été démontré que les vésicules extracellulaires (VE) de ce parasite jouent un rôle dans l'infection précoce, ainsi que la propagation de la résistance in vitro aux médicaments. Peu de médicaments anti-Leishmania sont disponibles, et la résistance continue de croître chez ce parasite; il est donc impératif de comprendre la propagation de la résistance aux antileishmaniens. Nous avons exploré la capacité des VE xénogéniques de Leishmania à moduler la physiopathologie de l'infection et la sensibilité du parasite aux médicaments après contact in vivo. La co-inoculation de parasites et de VE provenant de souches/espèces de Leishmania présentant divers profils de résistance aux médicaments a été réalisée chez la souris. La physiopathologie et la charge parasitaire ont été suivies, et des tests de sensibilité aux médicaments effectués. Les résultats ont démontré que les VE de Leishmania infantum influencent la physiopathologie de Leishmania major dans le cadre in vivo. Nous avons également constaté que ces VE modulent la sensibilité aux médicaments de L. major après un contact in vivo dans un modèle d'infection précoce, entraînant une diminution significative de la sensibilité à l’antileishmanien antimoine. Nous démontrons ici pour la première fois que les VE des parasites xénogéniques peuvent participer à la propagation de la résistance aux médicaments entre les populations de parasites après un contact in vivo, ce qui pourrait expliquer en partie l'augmentation des taux d'échec des traitements contre Leishmania. / Leishmaniasis is a zoonotic disease caused by the protozoan parasite Leishmania, endemic to 98 countries and territories. There are several manifestations of leishmaniasis, some fatal if left untreated. Furthermore, co-infections with multiple species of Leishmania have also been reported. Extracellular vesicles (EVs) from Leishmania have been demonstrated to play a role in early infection, as well as spread of drug resistance in vitro. Few antileishmanial drugs are available, and drug resistance to those in use continues to grow; as such, there is an urgent need to better understand the spread of Leishmania drug resistance. In this study, the ability of xenogeneic Leishmania EVs to modulate infection pathophysiology and parasite drug sensitivity after in vivo contact was explored. Co-inoculation of parasites and purified EVs from strains/species of Leishmania with contrasting drug resistance profiles was performed in BALB/c mice. Pathophysiology and parasite burden were monitored, and drug-susceptibility testing performed on recovered parasites. Results demonstrated that EVs from Leishmania infantum influence pathophysiology of Leishmania major in in vivo experiments. These EVs were also found to modulate drug sensitivity of L. major after in vivo contact in a 6-hour infection model, leading to a highly significant decrease in susceptibility to antileishmanial antimony. Here it is demonstrated for the first time that EVs from xenogeneic parasites can participate directly in propagating drug resistance between parasite populations after in vivo contact. These findings may help explain current observations of rising rates of Leishmania treatment failure.

La résistance du virus de l’herpès simplex (VHS) aux antiviraux est un problème courant chez les individus immunosupprimés. Des mutations au sein du gène de la thymidine kinase (TK) virale sont principalement à l’origine de la résistance au traitement de première ligne, i.e. les analogues des nucléosides. La cible ultime de tous les antiviraux anti-herpétique demeure cependant l’ADN polymérase (pol) virale. Ces deux gènes viraux (TK et ADN pol) démontrent un certain degré de polymorphisme génétique et il peut devenir difficile d’identifier avec certitude les mutations responsables de la résistance aux antiviraux. Les travaux présentés dans cette thèse de Doctorat démontrent le développement de nouvelles méthodes afin d’établir un lien entre l’apparition de mutations au niveau de gênes viraux et un phénotype de résistance particulier. Un système d’expression du gène de la TK virale chez le parasite Leishmania et un ensemble de cosmides et de plasmides recombinants permettant de générer des virus ADN pol mutants ont été mis au point. Ces nouvelles stratégies nous ont permis de caractériser les mutations virales impliquées dans la résistance aux antiviraux. / Drug resistant HSV isolates are responsible form substantial morbidity among immunocompromised subjects. The genetic basis for resistance to nucleoside analogs such as acyclovir (ACV) have been mapped to point mutations in the viral thymidine kinase (TK) gene while mutations within the viral DNA pol gene, the main target for all anti-herpetic drug actually available, could lead to a multidrug resistance phenotype. However, the distinction between viral mutations (TK and DNA pol) involved in antiviral resistance or part of viral polymorphism can be difficult to evaluate with current methodologies. OBJECTIVE: The aim of this research project is thus to evaluate the role of particular mutations within the HSV TK and DNA pol gene with regard to drug-resistance patterns and viral fitness, by designing new gene expression systems. METHODS: The protozoan parasite Leishmania stably transfected with a TK expression vector (pSP72αNEOα) was used as an heterologous system to evaluate the role of several different point mutations within the coding region of the TK gene in conferring resistance to nucleoside analogs. Susceptibility of TK-expressing parasites to nucleoside analogs can thus be tested very easily by a simple measurement of the optic density of cultures grown in the presence or in the absence of the drug. Finally, a set of overlapping viral cosmids and plasmids for the rapid generation of recombinant HSV-1 DNA pol mutants have been developed. RESULTS: Expression of the TK gene from ACV-susceptible clinical isolates resulted in Leishmania susceptibility to the antiviral, whereas expression of a TK gene with frameshift mutations or nucleotide substitutions from ACV-resistant isolates gave rise to parasites with high levels of antiviral resistance. Twenty HSV-1 recombinants with single or dual mutations within the DNA pol gene were successfully generated with the cosmid/plasmid based approach. Mutations within the central part of the enzyme’s catalytic domain (regions II and VI) were associated with resistance to ACV, FOS, and ADV, whereas mutations inserted within extremities (δ-region C, I, V, and VII) were mostly related to the replicative activity of the enzyme. CONCLUSION: Such new strategies provide an easy, reliable, and sensitive means of evaluating the functional role of viral mutations which should translate in improved management of drug-resistant HSV infections.

Le récepteur à activité tyrosine kinase MET et son ligand le facteur de croissance des hepatocytes (Hepatocyte Growth Factor/Scattor Factor (HGF/SF)) sont essentiels pour la migration, la morphogenèse et la survie des cellules épithéliales. En plus de son implication et son importance physiologiques, la dérégulation de la signalisation de MET favorise la progression et l’invasion tumorales dans plusieurs types de cancers. Au sein des tumeurs, l’hypoxie est également un phénomène crucial qui induit une réponse adaptative menant à l’invasion, la métastase cancéreuses et la résistance aux traitements.Nous avons démontré que dans des conditions hypoxiques, la phosphorylation de MET induite par sa liaison au ligand, des mutations activatrices ou sa surexpression, est diminuée de manière importante in vitro et in vivo dans des modèles de tumeurs expérimentales chez la souris. Cette baisse de phosphorylation est très rapide et est réversible quand les cellules sont replacées en normoxie. Alors que la phosphorylation de GAB1, principal partenaire de MET, est également diminuée en hypoxie, l’activation des voies de signalisation en aval AKT et ERK n’est pas affectée et reste bien dépendante de l’activité du récepteur et du recrutement de GAB1. De la même façon, l’HGF/SF induit des réponses de motilité, de dispersion, de morphogenèse et de survie similaires en normoxie et en hypoxie. De manière intéressante, le traitement par deux inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) ciblant MET (PHA-665752 et SU11274) est moins efficace en hypoxie pour inhiber les voies de signalisation AKT et ERK ainsi les réponses cellulaires induites par MET. Comme pour la phosphorylation de MET, la résistance à ces ITK est un phénomène réversible. Ainsi, alors que l’hypoxie n’affecte pas les voies de signalisation en aval ni les effets biologiques, elle diminue la sensibilité de MET aux ITK induisant donc une résistance immédiate. L’ensemble de ces données pourrait fournir de nouvelles perspectives dans l’utilisation des thérapies ciblant MET dans les tumeurs solides. / The receptor tyrosine kinase MET and its ligand the Hepatocyte Growth Factor/Scattor Factor (HGF/SF) are essential for migration, morphogenesis and survival of epithelial cells. Beside its physiological involvement, deregulation of MET signaling has been shown to promote tumor progression and invasion in many cancers. Inside the tumors, hypoxia is also a crucial phenomenon promoting an adaptive response able to induce invasion, metastasis and resistance to treatment.We show that under hypoxia, MET phosphorylation induced by ligand-stimulation, activating mutation or overexpression, is drastically decreased both in cell culture and in experimental tumors. This decrease in MET phosphorylation occurs within minutes and is reversible when cells are returned to normoxia. While phosphorylation of the proximal signaling adaptor GAB1 is also decreased in hypoxia, activation of the downstream kinases ERK and AKT is not affected, but is still dependent on MET receptor activity. Consistently, several cellular responses induced by HGF/SF, including motility, morphogenesis or survival, are still efficiently induced. Interestingly, treatment with two tyrosine kinase inhibitors targeting MET (PHA-665752 and SU11274) are less efficient to inhibit the downstream kinases ERK and AKT and cellular responses induced by MET in hypoxia compared to normoxia. Similarly to MET phosphorylation, this resistance to TKI is a reversible phenomenon. Therefore, while hypoxia does not affect downstream signaling and cellular responses, it decreases MET sensitivity to TKIs targeting the receptor thus providing an immediate resistance. This may provide new insights in the use of MET targeted therapies in solid tumors.

La tri-thérapie utilisée pour le traitement du VIH-1 est efficace mais limitée par l'apparition de résistances. Par conséquent, des cibles virales alternatives sont nécessaires. Une des cibles les plus prometteuses est la protéine nucléocapside (NC), qui est hautement conservée et qui joue un rôle essentiel dans le cycle viral. Dans ce contexte, le projet européen THINPAD a eu pour but de développer des inhibiteurs de la NC en combinant plusieurs approches : criblage virtuel, criblage secondaire in vitro, tests antiviraux et de toxicité. Pour le criblage in vitro, nous avons utilisé le test de déstabilisation de cTAR, hautement spécifique de l’activité chaperonne de NC. Cinq séries de molécules ont été sélectionnées par les premiers criblages et tests antiviraux. Après des études de relation structure-activité, une seule des cinq séries a été poursuivie jusqu’aux tests d'efficacité chez les souris. Les composés de cette série présentent une activité antivirale à des concentrations nanomolaires, mais ne sont pas actifs dans le modèle murin. Les études de mécanisme d'action ont révélés que leur activité antivirale était bien consécutive au ciblage de la NC. / Highly Active Anti-Retroviral Therapy (HAART) is successfully used for HIV-1 treatment, but is hampered by the appearance of drug resistance. Thereby, alternative drug targets are required. One of the most promising target is the nucleocapsid protein (NC), which is highly conserved and plays essential role in HIV life cycle. In this context, the European project THINPAD was organized with the aim to develop NC inhibitors. To fulfil this objective, several approaches were used, including virtual screening, in vitro secondary screening, in cellulo antivirals tests, and toxicity evaluation. For in vitro screening, the specific NC-promoted cTAR destabilization assay was used. Five series of molecules were selected by the first screenings and antiviral tests. After structure-activity relationship studies, only one series was continued until efficacy testing in mice. The compounds of this series exhibit antiviral activity at nanomolar concentrations but are not active in the murine model. The mechanisms of action studies revealed that their antiviral activity was indeed consecutive to the targeting of the NC.

La résistance aux médicaments constitue un obstacle majeur pour le traitement du cancer. Les systèmes nanoparticulaires de délivrance de médicaments (nanoparticule drug delivery system, NDDS) sont pressentis pour apporter un nouvel espoir dans le traitement du cancer afin de surmonter la résistance aux médicaments en délivrant spécifiquement l’agent anticancéreux dans la lésion tumorale par effet EPR. Cela aura pour effet d’augmenter la concentration locale en médicaments et par conséquent d’améliorer l'efficacité thérapeutique tout en épargnant les tissus sains afin d'éviter les effets secondaires liés à la thérapie. Dans la mesure où la tumeur a souvent un microenvironnement acide, nous souhaiterions en outre doter nos nanoparticules NDDS d’une sensibilité pH-dépendante afin de permettre une délivrance spécifique dans la tumeur. Au cours de cette thèse, nous avons élaboré différents NDDSs sensibles aux variations de pH en employant des stratégies différentes. Ces NDDSs peuvent spécifiquement libérer le médicament au niveau du tissu tumoral et dans les cellules elles-mêmes à des valeurs de pH acides. En augmentant la concentration intracellulaire de médicament, l'objectif de surmonter la résistance aux médicaments pourrait ainsi être atteint. La présente étude a permis de fournir de nouvelles connaissances sur la conception de nano-transporteurs pour surmonter la résistance multidrogue par l’élaboration de NDDS sensibles au pH et constitue donc un exemple illustrant parfaitement le fait que les progrès des nanotechnologies peuvent être avantageusement mis en œuvre pour développer de nouvelles perspectives thérapeutiques. / Drug resistance presents a great hurdle to cancer treatment. Nanotechnology-based drug delivery systems (NDDSs) are widely expected to bring new hope for cancer therapy to overcome drug resistance by specifically delivering anticancer drugs to tumor lesions via the EPR effect, hence increasing local drug concentrations and consequently enhancing therapeutic efficacy, and at the same time, sparing healthy tissues to avoid side effects. As tumors often have an acidic microenvironment, we would like to further endow the NDDS with a pH-responsive drug releasing property for specific tumor targeting. In this thesis, we established different pH-responsive NDDSs by employing different strategies. These NDDSs could specifically control drug release at tumor tissues and within tumor cells in response to acidic pH. By increasing the intracellular drug concentration, the goal of circumventing drug resistance in cancer was achieved. The present study provides new insights into the design of nanocarriers to overcome drug resistance through pH-responsive drug delivery, and illustrates how advances in nanotechnology can be advantageously implemented to enhance therapeutic outcomes.

The Major Facilitator Superfamily groups a vast number of secondary transporters that import or export distinct substrates. Among these, multidrug antiporters constitute a peculiar class of transporters, both because of their multispecificity, recognizing structurally very diverse substrates, and because of their transport mechanism, that relies on bilayer-mediated extrusion of cytotoxic compounds. An accurate and detailed description of the conformational changes that underlie the transport cycle is still lacking and the structural basis for energetic coupling in these transporters has not been elucidated, with so far only limited crystallographic evidence available. We investigate the molecular basis of secondary multidrug transport with biochemical and biophysical studies on LmrP, a Major Facilitator Superfamily multidrug transporter from Lactococcus lactis. We used extensive continuous-wave electron paramagnetic resonance and double electron-electron resonance measurements on a library of spin-labeled LmrP mutants to uncover the conformational states involved in transport and to investigate how protons and ligands shift the equilibrium between conformers to enable transport. We find that the transporter switches between outward-open and outward-closed conformations depending on the protonation states of specific acidic residues forming a transmembrane protonation relay. We observe that substrate binding restricts the conformational freedom of LmrP and induces localized conformational changes. Our data allows to build a model of secondary multidrug transport wherein substrate binding initiates the transport cycle by opening the extracellular side to protons. Subsequent protonation of membrane-embedded acidic residues induces substrate release to the extracellular side and triggers a cascade of conformational changes that culminates in a proton release to the intracellular side. Parallel to this, we have optimized our purification and expression protocol in order to set up crystallization trials on LmrP. Through extensive screening and optimization of the lipidation state of LmrP, using ad hoc methods for sample preparation, we were able to obtain low-resolution diffracting crystals. By improving our lipidation technique and modifying the lipid composition we further improved crystal quality. Other factors such as ligand addition, the presence of secondary detergent and additives for controlling phase separation and nucleation were tested, paving the way to high resolution structure determination of LmrP. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Malgré la disponibilité d’un traitement curatif et un vaccin largement utilisé, l’OMS estime qu’approximativement un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis, l’agent étiologique de la tuberculose, et qu’environ 2 millions de personnes en meurent chaque année. La compréhension de l’épidémiologie de la tuberculose et les actions de contrôle de la maladie ont été, récemment, compliquées par l’émergence de bacilles tuberculeux résistants aux antibiotiques et par la synergie fournie par la co-infection avec le VIH. Une tendance alarmante pour la santé publique est l’émergence de souches résistantes à plusieurs antibiotiques (multi-résistantes, MDR), définies comme des isolats résistants au moins à l’isoniazide (INH) et la rifampicine (RIF), les deux agents anti-tuberculeux les plus puissants.<p><p>La sélection de mutants résistants se produit chez le patient lorsque les taux d’antibiotiques présents dans le corps sont sub-thérapeutiques ou lorsque la thérapie est inappropriée. Un des facteurs favorisant est l’exceptionnelle durée de la chémothérapie. Le besoin de maintenir des taux élevés d’antibiotiques pendant des mois, combiné avec la toxicité inhérente des agents, résultent en une observance incomplète du traitement par le patient et le risque d’acquérir des résistances. La résistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis résulte d’altérations dans des gènes chromosomiques spécifiques. Les causes génétiques de la résistance ont été définies pour certains antibiotiques bien que plusieurs inconnues persistent. <p><p>Le présent travail a consisté en l’étude du problème de la résistance aux antibiotiques anti-tuberculeux par différentes approches :l’analyse génétique des mécanismes de résistance, l’évaluation de l’activité thérapeutique de nouvelles molécules et la caractérisation du profil de résistance de souches cliniques. <p><p>L’acide p-aminosalicylique (PAS) est un antibiotique bactériostatique de deuxième ligne dont le mécanisme d'action sur le bacille tuberculeux est incompris. Récemment, en utilisant la mutagenèse par transposon, la résistance au PAS fut associée à des mutations de la thymidylate synthase encodée par le gène thyA. Suite à cette découverte, nous avons entrepris une étude moléculaire de souches cliniques et de mutants spontanés résistants au PAS. Des mutations du gène thyA furent identifiées chez seulement 37% des souches. En tout, vingt-quatre mutations différentes furent identifiées dans le gène thyA. Les séquences nucléotidiques de cinq autres gènes de la voie de synthèse du folate et de la thymine (dfrA, folC, folP1, folP2, et thyX) ainsi que de 3 gènes encodant des N-acétyltransférases (nhoA, aac1 et aac2) furent également analysées mais aucune mutation associée à la résistance au PAS n’a pu être mise en évidence. L’utilisation de techniques bioinformatiques de prédiction structurelle révèle que les mutations identifiées affectent soit la structure soit le site fonctionnel de ThyA. L’étude des profils de croissance des organismes résistants au PAS nous permit de constater que les organismes porteurs d’une mutation de la protéine ThyA présentent un profil de croissance constant en présence de concentrations croissantes de PAS. Les organismes résistants au PAS possédant une protéine ThyA sauvage répondent, quant à eux, aux concentrations croissantes de PAS de façon dose-dépendante, indiquant que le(s) mécanisme(s) alternatif(s) de résistance au PAS est (sont) dose-dépendant(s).<p><p>La thymidylate synthase est également une des cibles du 5-fluorouracil (5-FU), l’agent chimiothérapeutique le plus largement utilisé pour le traitement du cancer colorectal avancé. Etant donné l’augmentation du nombre de souches résistantes de M. tuberculosis, de nouveaux composés anti-tuberculeux sont nécessaires de façon urgente. Ici, nous avons évalué l’efficacité in vitro et in vivo du 5-FU sur M. tuberculosis. La concentration minimale inhibitrice du 5-FU fut déterminée sur une collection de souches cliniques sensibles et multi-résistantes ainsi que sur des mutants spontanés résistants au PAS. Tous les isolats montrèrent une sensibilité au 5-FU à des concentrations allant de 0.4 à 1.8 µg/ml, et ce indépendamment de leur profil de sensibilité/résistance aux agents anti-tuberculeux actuels. Les études in vivo du 5-FU (sur un modèle murin de tuberculose active) montrèrent une efficacité de celui-ci durant les deux premières semaines de traitement puis une perte d’activité à la troisième semaine, vraisemblablement engendrée par les effets secondaires du 5-FU.<p><p>L’éthionamide (ETH) est un autre antibiotique de deuxième ligne dont l’utilisation est limitée aux tuberculoses multi-résistantes étant donné les effets secondaires qu’il engendre. Ces dernières années, les études ont montré que l’ETH est un pro-médicament, transformé en forme active par l’enzyme monooxygénase EthA dont l’expression est contrôlée par le répresseur transcriptionnel EthR. Notre étude décrit l’élaboration d’inhibiteur d’EthR capable d’augmenter la sensibilité de M. tuberculosis à l’ETH suite à l’amélioration de son activation. Les composés synthétisés et sélectionnés pour leur capacité à inhiber l’interaction EthR-ADN furent co-cristallisés avec EthR. Les structures tridimensionnelles des complexes furent utilisées pour la synthèse d’analogues capables d’améliorer la puissance de l’ETH en culture. Les molécules les plus prometteuses furent testées sur un modèle murin de tuberculose. Pour un des inhibiteurs d’EthR testés, nous avons montré que sa co-administration avec l’ETH permet une réduction de la dose d’ETH utilisée de 3 fois, pour l’obtention d’une même réduction de charge mycobactérienne pulmonaire. Ce travail démontre la possibilité d’augmenter l’index thérapeutique de l’éthionamide en agissant pharmacologiquement sur le mécanisme régulateur de son activation.<p><p>Dans certaines régions du monde, le problème de la multi-résistance devient très présent. Nous avons étudié l’état de la situation à Mourmansk (Fédération russe), une région à haute incidence de tuberculose. La résistance aux antibiotiques et l’épidémiologie moléculaire de la tuberculose furent étudiées sur des isolats collectés en 2003 et 2004 dans cette région. Une extrêmement haute prévalence de tuberculose multi-résistante (MDR-TB) fut constatée à la fois pour les nouveaux cas (primaires) (26%) et les cas précédemment traités (72.9%). Le typage des souches MDR primaires révèle une appartenance au génotype Beijing pour la plupart des isolats (79.8%) et l’homogénéité génétique des souches suggère une transmission active au sein de la population. L’analyse moléculaire des gènes impliqués dans la résistance à l’INH et à la RIF montre la présence des mutations katG codon 315 et rpoB codon 531 chez, respectivement, 98,2% et 76,3% des isolats MDR-TB primaires. La haute fréquence de ces mutations « communes » suggère la possible utilisation de tests moléculaires ciblant spécifiquement ces mutations pour détecter rapidement la plupart des cas de MDR-TB.<p><p>Nos travaux illustrent les différentes voies à suivre pour maitriser le problème de la résistance aux antibiotiques :l’élucidation des mécanismes de résistance, le développement de nouveaux médicaments et la détection rapide des cas de résistance.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le paludisme, maladie parasitaire et vectorielle, sévissant principalement dans les zones intertropicales où vit près de 40% de la population mondiale, reste un problème majeur en santé publique. Les cinq espèces de Plasmodium connues infectées le paludisme chez l'homme sont présentes au Cambodge, qui est reconnu comme l'épicentre de l'émergence de souches de P. falciparum multi-résistantes (chloroquine, sulfadoxine- pyriméthamine, méfloquine, artémisinine), pouvant entraver les progrès accomplis depuis plus d'une décennie. Le travail de thèse intitulé « Approche génomique et bio-informatique de l'émergence et de la diffusion des résistances chez Plasmodium au Cambodge » avait pour objectif de développer de nouveaux outils moléculaires et biologiques pour 1) une meilleure compréhension de l'impact des stratégies mises en place pour lutter contre le paludisme à P. falciparum sur les autres espèces de Plasmodium, 2) la mise en place d'outils biologique et moléculaire, permettant de mieux définir l'épidémiologie des parasites résistants, en particulier la résistance à la quinine et aux dérivés de l'artémisinine, 3) l'étude et la définition des sous-populations parasitaires circulant au Cambodge afin d'estimer les risques associés à la diffusion de la résistance à l'artémisinine. Cette thèse a été réalisée dans l'Unité d'Epidémiologie Moléculaire du Paludisme à l'Institut Pasteur du Cambodge (IPC) sous la codirection du Dr. Didier Ménard (Chef de laboratoire à l'IP) et du Pr. Emmanuel Cornillot (Professeur à l'Université Montpellier I). Le premier objectif visait à étudier l'impact de la pression médicamenteuse sur la dynamique d'évolution des populations parasitaires. Nous avons d'abord évalué le polymorphisme des gènes associés à la résistance à la pyriméthamine (gène dhfr, dihydrofolate reductase) chez Plasmodium malariae et Plasmodium ovale (article 1 et manuscrit en préparation1), et le polymorphisme du gène mdr-1 (multidrug resistance 1) associé à la résistance à la mefloquine chez P. vivax (article 2). De plus, en collaboration avec l'Institut Pasteur de Madagascar, nous avons étudié le lien pouvant exister entre le polymorphisme du gène candidat Plasmodium falciparum Na+/H+ exchanger (Pfnhe-1) et la résistance (clinique et in vitro) de P. falciparum à la quinine (articles 3 et 4).Le deuxième objectif s'est interessé au développement d'outils biologiques et moléculaires permettant d'évaluer la résistance des souches de P. falciparum aux dérivés de l'artémisinine. Les 3 articles présentés (articles 5, 6 et 7) decrivent la méthodologie d'approche originale utilisée associant la génomique, la biologie, la clinique et l'épidémiologie, qui a permis d'aboutir à la découverte d'un marqueur moléculaire (mutations au sein du gène Kelch 13) fiable pour identifier les souches résistantes aux dérivés de l'artémisinine.Le dernier objectif était consacré au développement de la technique PCR-LDR-FMA appliqué à la détection d'un panel de 24 SNPs permettant de caractériser par un « barcode » chaque isolat de P. falciparum. Cette technique couplée avec une analyse bio-informatique et statistique des données nous a permis d'étudier et de définir la structuration des populations parasitaires circulant au Cambodge afin d'estimer les zones à risque de diffusion de la résistance à l'artémisinine (manuscrit en préparation 2).A travers ce travail de thèse, nous nous sommes efforcés de montrer la puissance des techniques de biologie moléculaire disponibles couplées avec des approches génomique et bio-informatique pour améliorer notre compréhension de la dynamique d'évolution des populations parasitaires. Ce travail s'est essentiellement concentré sur les phénomènes liés à l'émergence et de la diffusion des parasites résistants aux antipaludiques, le but final de ce travail étant d'améliorer les stratégies de lutte mises en place pour atteindre l'ambitieux objectif d'élimination du paludisme. / Malaria, a protozoan vector-borne disease, is mainly prevalent in tropical areas, where nearly 40% of the world population is residing and remains one of the most concerns for public health worldwide. In Cambodia, the five Plasmodium species known to cause malaria in humans are present. The main feature of this country is that it is recognized as the epicenter of the emergence of multi-resistant P. falciparum parasites (to chloroquine, sulfadoxine-pyrimethamine, mefloquine, and artemisinin), a very significant menace to public health in the Mekong region that could impact the worldwide strategy to fight malaria. The thesis presented here, entitled “Genomics and Bioinformatics in the emergence and spread of resistant Plasmodium in Cambodia” aimed to develop new molecular and biological tools for:1) improving our understanding of the collateral impact of the strategies implemented to fight against falciparum malaria on the other Plasmodium species; 2) defining the molecular epidemiology of antimalarial resistant parasites, especially resistance to quinine and artemisinin derivatives;3) studying and defining the structure of P. falciparum parasite populations circulating in Cambodia to estimate areas at risk of spread of artemisinin resistance, using genomic approaches and bioinformatics. This thesis was carried out in the Malaria Molecular Epidemiology Unit at Pasteur Institute in Cambodia (IPC) under the co-direction of Dr. Didier Ménard (Head of the Unit, IP) and Pr. Emmanuel Cornillot (Professor, University of Montpellier I). The first objective of this work was to study the impact of drug used to treat falciparum malaria on the dynamics of other Plasmodium species. In a first step, we evaluated the polymorphism in gene associated to pyrimethamine resistance (dhfr gene, dihydrofolate reductase) in Plasmodium malariae and in Plasmodium ovale (article 1 and manuscript in preparation 1) and the polymorphism in mdr-1 gene (multidrug resistance 1 gene) associated to mefloquine resistance in P. vivax (article 2). Secondly, in collaboration with Pasteur Institute in Madagascar, we investigated the association between the polymorphism in Plasmodium falciparum Na + / H + exchanger gene (Pfnhe-1) and quinine resistance defined either by clinical or in vitro phenotypes (articles 3 and 4). The second objective was focused on the development of novel biological and molecular tools to assess the resistance of P. falciparum to artemisinin derivatives. The three papers presented (articles 5, 6 and 7) describe an original approach combining genomics, biological, clinical and epidemiological studies, which lead to the discovery of a molecular marker (mutations Kelch 13 gene) associated to artemisinin resistance.The third and final objective was devoted to the development of the PCR-LDR-FMA technology applied to the detection of a panel of 24 SNPs to characterize a "barcode" of P. falciparum isolates. This technic coupled with bioinformatics and statistical analysis allowed us to study and define the structure of the parasite populations circulating in Cambodia for estimating areas at risk of spread of artemisinin resistance (manuscript in preparation 2). Through this work, we have tried to show the usefulness of available molecular biology methods coupled with genomic and bioinformatics approaches to improve our understanding of the dynamics of the malaria parasite populations. This work has been mainly focused on the emergence and spread of antimalarial resistant parasites, keeping in mind that the ultimate goal of this work was to improve strategies implemented to achieve the ambitious goal of malaria elimination.

Comme décrit dans la partie But du Travail, les tumeurs gliales sont particulièrement agressives d’un point de vue clinique. Le glioblastome, qui correspond au grade de malignité le plus élevé des gliomes, est associé à un pronostic très sombre car aucun patient atteint de ce cancer n’a pu être guéri à ce jour. Ces tumeurs envahissent de manière diffuse (par essaimage de cellules tumorales isolées) le parenchyme cérébral, ce qui empêche une résection chirurgicale complète de la tumeur. De plus, les cellules tumorales gliales d’origine astrocytaire sont souvent résistantes à l’apoptose et donc aux thérapies adjuvantes telles que la chimiothérapie et la radiothérapie. La galectine-1 est une petite protéine intervenant directement dans les processus migratoires des cellules gliales tumorales. Nous avons donc poursuivi la caractérisation des rôles biologiques que pourrait exercer la galectine-1 au sein des gliomes.<p>Nous avons tout d’abord montré que la galectine-1 est impliquée dans la chimiorésistance des gliomes. En effet, nous avons démontré que la diminution du taux d’expression de la galectine-1, au moyen d’un siRNA au sein d’un modèle de gliome expérimental, permet d’augmenter le bénéfice thérapeutique du témozolomide in vivo sans toutefois induire d’apoptose, d’autophagie ou de perméabilisation de la membrane des lysosomes. Nous avons également montré que la diminution du taux d’expression de la galectine-1 au sein de ce modèle de gliome expérimental affecte les processus d’angiogenèse in vivo et de « vasculogenic mimicry » in vitro. Nous avons identifié la protéine ORP150 comme l’une des principales cibles de l’effet pro-angiogénique de la galectine-1, sachant que la protéine ORP150 contrôle la maturation du facteur VEGF. Nous avons ensuite montré que le rôle de la galectine-1 dans la chimiorésistance des gliomes et dans l’angiogenèse est directement lié à l’implication de la galectine-1 dans le processus de réponse au stress du réticulum endoplasmique. Via ce processus, la galectine-1 modulerait l’expression d’un certain nombre de gènes tels que ATF3, DUSP5 et HERP, qui sont impliqués dans la chimiorésistance et des gènes tels que ORP150 et MDG1 qui sont impliqués dans l’angiogenèse. <p>Enfin, nous avons également montré que la galectine-1 régule l’expression du gène BEX2 et que celui-ci joue un rôle important dans la biologie des gliomes, notamment dans les processus d’angiogenèse et de migration cellulaire. <p>En conclusion, notre travail suggère que l’étiquette « biomarqueur » pourrait être attribuée à la galectine-1 pour qualifier l’agressivité biologique des gliomes malins et que la galectine-1 pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique dans le combat contre les gliomes malins en général, et le glioblastome en particulier.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished