Les maladies à polyglutamines (polyQ) sont des maladies neurodégénératives héréditaires dominantes causées par une expansion de CAG traduite en longue expansion de polyglutamine dans la protéine correspondante. Ces maladies comprennent l’ataxie spinocérébélleuse 7 (SCA7) et la maladie de Huntington (MH) causées par une expansion de polyQ dans les protéines ataxine-7 (ATXN7) et huntingtine (htt), respectivement. Les souris SCA7 et MH développent des rétinopathies similaires suggérant des pathomécanismes communs toujours inexpliqués. Durant ma thèse, j’ai trouvé qu’en réponse à la toxicité des polyQ, les photorécépteurs (PR) perdent leur différenciation alors que d’autres migrent ou meurent. De plus, cette mortalité cellulaire active la prolifération des cellules gliales de Müller et leur différenciation en PR. Récemment, j’ai trouvé que l’ATXN7 et la htt se trouvent dans le cil primaire et leur mutation mène à une perte des protéines endogènes des cils associée à des défauts du cil. / Polyglutamine (polyQ) disorders are dominantly inherited neurodegenerative disorders caused by the expansion of CAG repeats translated into long polyQ tracts in the corresponding proteins. These diseases include Spinocerebellar ataxia 7(SCA7) and Huntington’s Disease (HD), caused by polyQ expansion ataxin-7 (ATXN7) and huntingtin (htt), respectively. SCA7 and HD mouse models develop similar retinopathies suggesting common pathomechanisms. In my thesis, I found that, in response to polyQ toxicity, SCA7 photoreceptors (PR) undergo several cell fates ranging from their deconstruction, to their migration and their death. Moreover, this cell death activates the proliferation of Müller glial cells and their differentiation into PR like cells. The pathomechanisms underlying HD and SCA7 are still unknown. Recently, I found that ATXN7 and htt are localized to the PR cilia and that the mutant proteins lead to a progressive loss of the wild-type proteins that correlates with defects in the PR cilia.

Le chien présente de nombreuses maladies génétiques dont les rétinopathies auxquelles je me suis intéressée. Historiquement, l’homme a appliqué aux chiens une sélection artificielle extrêmement forte, créant ainsi près de 400 races répondant à des besoins spécifiques. En uniformisant ainsi de nombreux traits phénotypiques et comportementaux, l’homme a sélectionné les allèles recherchés mais a également concentré involontairement des allèles délétères responsables de maladies génétiques. Ces maladies étant pour beaucoup cliniquement et génétiquement similaires aux maladies humaines, le chien constitue alors un modèle de choix pour en rechercher les bases génétiques et développer de nouvelles thérapies pour un bénéfice mutuel pour l’homme et le chien. J’ai travaillé sur l’Atrophie Progressive de la Rétine (APR) dans deux races avec le concours du Dr Gilles Chaudieu et des clubs de race : le border collie et le berger picard. Concernant l’APR du border collie, les analyses réalisées avant mon arrivée avaient identifié un locus de 20Mb sur le chromosome X. J’ai tout d’abord mis à jour les données épidémiologiques et cliniques d’environ 500 chiens et poursuivi la collecte de prélèvements. Une analyse de liaison génétique pangénomique sur 130 chiens m’a permis de confirmer le mode de transmission et le locus. J’ai ensuite conduis plusieurs analyses génétiques (« homozygosity mapping », analyses des génotypes, séquençage de gènes candidats) sans pour autant réduire le locus ni identifier de mutation causale. Dans ce contexte et grâce à l’avènement des nouvelles technologies de séquençage, j’ai choisi de séquencer le génome complet de trois chiens atteints et deux porteurs apparentés. Ce travail m’a permis d’identifier 117variants dont 9 dans le locus d’intérêt, mais aucun dans des régions codantes. Je me suis donc focalisée sur les variants de régions régulatrices pour 13 gènes candidats. De plus, j’ai identifié cinq variants structuraux, encore en cours d’étude. Concernant l’APR du berger picard, nous avons relancé le projet par la collecte de prélèvements et la réalisation d’un pedigree de 154 chiens. Ce travail a amené à une collaboration tripartite internationale par le séquençage de deux chiens atteints et deux indemnes d’APR, dont les analyses sont en cours. Cette thèse m’a permis d’aborder la génétique d’une maladie génétique rare chez l’homme grâce à un modèle spontané original ; et même si ce travail n’a pas abouti à l’identification de mutations à ce jour, ces APR restent de bons modèles génétique et thérapeutique pour les rétinites pigmentaires humaines. / Dogs are affected by numerous genetic diseases including retinopathies, the subject of my thesis. Historically, humans have exerted a very strong artificial selection to dogs, thus creating some 400 breeds to perform specific tasks or to harbour specific traits. By such an homogenisation of phenotypic and behavioural traits, humans have selected desired alleles but also concentrated undesired deleterious alleles responsible of genetic diseases. These diseases are clinically and genetically similar to human genetic diseases, making dogs a model of choice to search for the genetic bases of such genetic diseases and to develop new therapies for a mutual benefit for dogs and humans. I worked on Progressive Retinal Atrophies (PRA) in two breeds, thanks to the contribution of the veterinary ophthalmologist Dr. Gilles Chaudieu and the breed clubs of border collies and berger picard. Concerning the border collie PRA, genetic analyses performed before my thesis allowed the identification of a locus of 20Mb on the X chromosome. I first completed and supplemented the epidemiological and clinical data for about 500 dogs and continued the sample and data collection. A first genetic linkage analysis on 130 dogs allowed to confirm the transmission mode and the locus. I then performed several genetic analyses (« homozigosity mapping », genotypes analyses, candidate gene sequencing) without significantly reducing the locus,neither finding the causal mutation, unfortunately. In this context and thanks to the development of new sequencing technologies, I chose to sequence the entire genome of three PRA affected border collies and two unaffected related dogs. This work allowed the identification of 117variants, 9 in the locus but none in coding regions. I thus focused my research on genetic variants from potential regulatory regions for 13 candidate genes. In addition, I identified five structural variants. The analysis of these variants is still ongoing. Concerning the berger picard PRA, we have re-initiated the project by collecting samples and designing a large pedigree of 154 dogs. This workled to an international collaboration by the sequencing of the entire genomes of 2 affected and 2 unaffected bergers picards for which the statistical analyses are ongoing. This thesis allowed me to work on the genetics of rare diseases in humans with a spontaneous and original animal model and even if thiswork has not yet reached the identification of the mutations, these two PRAs in these two breeds remain good genetic and therapeutic models for human RP RetinitisPigmentosa.

L’ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7) est une maladie neurodégénérative à transmission autosomale dominante, causée par une expansion toxique de polyglutamine (polyQ) dans la protéine Ataxine-7. Elle se caractérise par une dégénérescence des photorécepteurs en cônes et en bâtonnets, ainsi que des cellules cérébelleuses de Purkinje et granuleuses. La nature sélective de cette dégénérescence reste peu claire, l’expression d’Ataxine-7 étant ubiquitaire. Dans ce contexte, nous avons exploré la fonction de l’orthologue d’Ataxine-7 chez le poisson-zèbre au cours du développement de l’œil. L’inactivation d’atxn7 chez le poisson-zèbre – par des approches utilisant des oligonucléotides anti-sens ou par CRISPR/Cas9 – résulte principalement en un colobome, malformation structurelle de l’œil causée par un défaut de fermeture de la fissure choroïde. Les morphants atxn7 présentent une altération du motif proximo-distal de la vésicule optique causée par une élévation de la signalisation Hedgehog (Hh). Une étude minutieuse des photorécepteurs révèle un défaut de la morphogénèse des segments externes. La sensibilité de l’œil aux variations de fonction d’atxn7 pourrait expliquer la phyiopathologie SCA7. Notre étude suggère également qu’une perte de fonction d’atxn7 contribuerait au développement du colobome chez l’Homme. / Spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7) is an autosomal-dominant neurodegenerative disorder caused by a toxic polyglutamine (polyQ) expansion in Ataxin-7 which leads to degeneration of cone and rod photoreceptors. The selective nature of degeneration remains unclear since Ataxin-7 is ubiquitously expressed. Here, we have explored the function of the Ataxin-7 ortholog in zebrafish during eye development. Inactivation of atxn7 in zebrafish primarily resulted in a coloboma defect, a structural malformation of the eye caused by failure of the choroid fissure to close. atxn7 morphants displayed altered proximo-distal patterning of the optic vesicle, caused by elevated Hedgehog (Hh) signaling. Careful examination of the photoreceptors reveals a defect in the morphogenesis of the outer segments. The eye sensitivity to variations in atxn7 function could account for SCA7 physiopathology. Our study also suggests that atxn7 loss of function may contribute to the development of human coloboma.

Le gène Egfl7 codant une protéine majoritairement sécrétée par les cellules endothéliales a été découvert au sein du laboratoire. Ce gène a la particularité d’héberger dans sa séquence intronique deux microARNs complémentaires nommés miR126-3p et miR-126-5p. Les microARNs sont de petites séquences de 20 à 25 nucléotides régulant l’expression de leurs cibles en se fixant sur leurs ARNm pour induire leur dégradation ou l’inhibition de leur traduction. L’expression endothéliale et les fonctions du microARN miR126-3p (microARN principal du duplex miR126-3p/126-5p) ont déjà été très largement abordées alors que celles de miR126-5p (microARN secondaire du duplex) restent inconnues. Les objectifs de notre étude ont donc été d’établir le patron d’expression de miR-126-5p lors du développement vasculaire et de caractériser ses fonctions dans les cellules endothéliales. Par hybridation in situ, miR-126-5p a été détecté dans les vaisseaux sanguins embryonnaires de souris principalement dans les cellules endothéliales. Cette spécificité endothéliale a été retrouvée dans différents organes tels que le cœur et les poumons et est maintenue in vitro. L’inhibition et la surexpression de miR-126-5p dans des cellules endothéliales veineuses (HUVEC) in vitro n’affectent pas les capacités de prolifération, de migration ou d’organisation en pseudocapillaires de ces cellules. En revanche, l’inhibition de miR-126-5p dans les HUVECs entraine une répression de l’adhérence des leucocytes à la surface d’un tapis de cellules endothéliales ainsi qu’une augmentation de la transmigration de monocytes à travers une monocouche endothéliale. A l’inverse, sa surexpression génère des phénotypes opposés. Des analyses in silico de recherche de cibles pour miR-126-5p en lien avec le recrutement leucocytaire ont permis d’identifier une protéine participant à la transmigration des leucocytes in vitro et in vivo nommée ALCAM. A l’aide de test de transactivation, nous avons pu démontrer que miR-126-5p était capable de se fixer au 3’UTR de l’ARNm d’ALCAM afin de réprimer l’expression de la protéine. De plus, l’augmentation de la transmigration induite par la chute d’expression de miR-126-5p dans les cellules endothéliales est inhibée suite au blocage direct de la protéine ALCAM montrant ainsi que l’effet répresseur de miR-126-5p sur ce mécanisme est établi via ALCAM. Une étude par microarray, réalisée sur des HUVECs où miR-126-5p a été inhibé, a permis d’identifier une seconde cible pour miR-126-5p nommée SetD5 pour laquelle aucune fonction n’est connue à ce jour. Des tests de transactivation ont permis de confirmer que SetD5 était une cible de miR-126-5p. De plus, l’effet de miR-126-5p sur l’adhérence des leucocytes aux cellules endothéliales est directement lié à la modulation d’expression de ce gène. Enfin, l’analyse de l’inhibition de miR-126-5p in vivo a permis de montrer que notre microARN d’intérêt contrôle effectivement les expressions d’ALCAM et de SetD5. Cependant, alors que miR-126-5p régule uniquement l’expression d’ALCAM dans les poumons, celle de SetD5 est sous le contrôle de miR-126-5p dans la rétine.Nos travaux ont donc permis de mettre en évidence l’expression endothéliale de miR-126-5p et d’identifier deux de ses cibles lui permettant de jouer un rôle dans le recrutement des leucocytes au niveau de l’endothélium. / The Egfl7 gene which was identified within the laboratory codes for a protein mainly secreted by endothelial cells. This gene harbors in its intronic sequence two complementary microRNAs named miR-126-3p and miR-126-5p. MicroRNAs are 20-25 nucleotides-long non coding RNAs which repress protein expression through binding to a complementary sequence of their target mRNAs, leading to mRNA degradation or translation inhibition. Endothelial expression and functions of miR-126-3p (The main miRNAs of the miR-126-3p/miR-126-5p duplex) was widely described while those of miR-126-5p remain unknown. The goal of our study was to establish the expression of miR-126-5p during the vascular development and to characterize its functions in endothelial cells. By in situ hybridization, miR-126-5p was detected in mouse embryonic vessels mainly in endothelial cells. This miR-126-5p endothelial specific expression was also found in different organs such as in the heart or lungs and is maintained in vitro. The inhibition and overexpression of miR-126-5p in vein endothelial cells (HUVECs) did not affect HUVECs proliferation, neither their migration nor their ability to form pseudocapillaries in vitro. On the other hand, miR-126-5p inhibition in HUVEC led to a repression of leukocyte adhesion onto endothelial cells as well as an increase of leukocyte transmigration across an endothelial cell monolayer. Interestingly, opposite phenotypes were observed after miR-126-5p overexpression. In silico analyses of miR-126-5p targets led to identify ALCAM as a potential mRNA transcript that could be regulated by miR-126-5p and which was already involved in leukocyte transmigration in vitro and in vivo. By transactivation assays, we showed that miR-126-5p was able to bind the 3’UTR of ALCAM mRNA and to repress ALCAM protein expression. Furthermore, endothelial cell treatment with an ALCAM blocking antibody abolished the effect of miR-126-5p inhibition on leukocyte transmigration indicating that miR-126-5p controls this process via ALCAM. A microarray analysis performed on HUVEC after miR-126-5p inhibition allowed the identification of another target for miR-126-5p named SetD5, a gene with unknown function. Transactivation assays confirmed that SetD5 is a target for miR126-5p. Furthermore, we showed that miR-126-5p controls leukocyte adhesion onto endothelial cells by regulating SetD5 expression. Finally, the inhibition of miR-126-5p in vivo demonstrated that miR-126-5p controls ALCAM and SetD5 expression in mouse. However, while miR-126-5p exclusively regulates ALCAM expression in lungs, SetD5 expression is controlled by miR-126-5p in the retina.In this study, we demonstrated that miR-126-5p is a functional microRNA expressed in endothelial cells. We identified two targets for this microRNA indicating that miR-126-5p participates in the control of leukocyte trafficking onto endothelial cells.

La netrine-1 joue un rôle important en tant qu’un élément de guidance pour la croissance axonale au début du développement du système nerveux central. Des études récentes ont démontré une expression de la netrin-1 dans le cerveau antérieur adulte, où elle régule la fonction synaptique et la plasticité dans les neurones corticaux. Cependant, la contribution de la netrine-1 dans la rétine adulte reste encore inconnue. Le but de cette étude est donc de caractériser l'expression de la netrine-1 dans la rétine des souris adultes sauvages (rétine intacte) et malades (rétine blessée). L'expression rétinéene de la netrine-1 et de son récepteur, supprimée dans le cancer colorectal (DCC), a été déterminée, à partir des immunobuvardages, chez des souris post-natales de jour 0 (P0), P14 et adultes. Le recours au double marquage de la netrine-1 avec un anticorps spécifique contre RBPMS, un marqueur sélectif pour les cellules ganglionnaires de la rétine (RGC), a permis l’identification de sa localisation sur les sections transversales de rétine. De plus, les niveaux de netrin-1 ont également été quantifiés à trois et sept jours après l'axotomie du nerf optique. Nous avons démontré que la netrine-1 et DCC sont fortement exprimés dans la rétine à P0, toutefois l’expression de netrin-1 est relativement stable pendant le développent alors que l’expression de DCC est remarquablement réduite à l'âge adulte. De plus, ces expériences ont conclu une expression robuste de la netrin-1 dans le soma RGC adulte et, une expression des récepteurs DCC autour du corps cellulaire. Fait important, nous avons aussi pu démontrer que les niveaux d’expressions de la netrine-1 et DCC sont réduits à trois et sept jours suivant l'axotomie du nerf optique. Cependant, la surexpression de la protéine netrin-1 n'a pas eu un effet significatif sur la survie du RGC par rapport aux témoins injectés par un véhicule. Les résultats obtenus suggèrent que : (i) la netrine-1 est abondamment exprimée dans la rétine néonatale et subit une diminution importante à l'âge adulte, (ii) la netrine-1 et son récepteur DCC sont présents dans les RGC et, (iii) l'expression de la netrine-1 diminue considérablement suite à une lésion axonale. Ensemble, ces résultats suggèrent un rôle pour la netrin-1 dans le système visuel chez les adultes. / Netrin-1 plays a highly-conserved role as a guidance cue directing axonal growth during the early stages of central nervous system development. Recent data has shown that netrin-1 is continued to be expressed in the adult forebrain where it regulates synaptic function and plasticity in cortical neurons. However, the contribution of netrin-1 in the adult retina remains unknown. The purpose of this study was to characterize the expression of netrin-1 in the intact and injured adult mouse retina. The retinal expression of netrin-1 and its receptor, deleted in colorectal cancer (DCC), was examined at postnatal day 0 (P0), P14, and adult mice using western blots. Double labeling of netrin-1 with an antibody against RBPMS, a selective marker for retinal ganglion cells (RGCs), was used to determine its location on retinal cross-sections. Netrin-1 levels were also quantified at 3 and 7 days after optic nerve axotomy. We demonstrate that netrin-1 and DCC are abundantly and widely expressed in the retina at P0, but although the expression level of netrin-1 remains relatively stable during development, the expression level of DCC is markedly downregulated in adulthood. Adult RGC soma were shown to be endowed with robust netrin-1 expression. DCC receptors were also found to be expressed around the cell body. Importantly, we show that netrin-1 and DCC levels are further downregulated at 3 and 7 days after optic nerve axotomy. However, the over-expression of netrin-1 protein failed to exert any significant effect on RGC survival in comparison to vehicle-injected controls. Our data support that: 1) netrin-1 is abundantly expressed in the neonatal retina and undergoes marked downregulation in adulthood, 2) netrin-1 and DCC are present in RGCs, 3) netrin-1 expression decreases rapidly after axonal injury. Together, these results suggest a role for netrin-1 in the mature visual system.

La dystrophine Dp71, issue du gène DMD impliqué dans la dystrophie musculaire de Duchenne intervient dans le maintien de l'homéostasie rétinienne et de la barrière hémato-rétinienne. Nous avons mis en évidence une localisation rétinienne jusque-là méconnue de la Dp71 au sein des astrocytes rétiniens. Nous avons également étudié l'effet in vivo de l'absence de Dp71, sur le développement vasculaire et observé une plus faible densité et une morphologie astrocytaire différente comparativement aux souris contrôles, à l'origine d'un développement vasculaire retardé. Compte tenu de la spécificité du réseau vasculaire rétinien dont l'étanchéité des parois est maintenue en partie par les pieds des CGM et des astrocytes, nous avons émis l'hypothèse, étant donné l'implication de la Dp71 dans la stabilisation de ces cellules, d'une altération de cette protéine dans les phénomènes de rupture de la BHR. Ainsi dans un modèle transitoire de rupture de la BHR in vivo relativement " pur ", sans ischémie ni injection de VEGF, nous avons observé une diminution de l'expression de la dystrophine Dp71 ainsi que du canal aqueux AQP4 et une délocalisation du canal potassique Kir4.1 dans les CGM. L'injection intra-vitréenne de Dexaméthasone dans ce modèle a permis de prévenir les modifications d'expression et de localisation de ces protéines. / Dp71, a dystrophin produced from DMD gene, is involved in retinal homeostasis and maintenance of blood retinal barrier. We have previously shown that Dp71, part of a complex called Dystrophin associated protein, is involved in the localization of aqueous and potassic channels in Muller glial cell (MGC), particularly around blood vessels, allowing maintenance of retinal homeostasis. Based on the knowledge that growing retinal vessels migrate on an astrocyte template during development, we highlighted the expression of Dp71 in retinal astrocytes. In absence of Dp71, in vivo, we observed a lower density and a different morphology of retinal astrocytes compared to control retina in mice, responsible for a delayed vascular development. Due to the role of barrier of the retinal vascular network, insured also by astrocytes, we studied a model of post surgical BRB breakdown and found a decreased of Dp71 protein expression associated with Kir4.1 delocalization and AQP4 decrease in MGC. Intravitreal Dexamethasone prevents these protein expression changes. We suggest here that the membrane associated cytoskeletal protein, Dp71, expressed in astrocytes is involved in the maintenance of astrocytes density and morphology necessary as a template for retinal vascular development. This protein insure also a key role in retinal homeostasis by localizing and maintaining aqueous and potassic channels in MGC. Moreover when this protein is altered, Dexamethasone seems to be capable to promote Dp71 expression which could have wide clinical implications in retinal diseases treatment and the target for retinal neuroprotection under pathological conditions seems to be the macroglial cells.

Chez l’Homme, le vieillissement de la rétine peut aboutir à des pathologies telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) ou la rétinopathie diabétique (RD). Il semble qu’une alimentation riche en acides gras polyinsaturés à longue chaîne (AGPI-LC), notamment en oméga-3 comme l’EPA et le DHA, soit potentiellement protecteur vis-à-vis du développement de la DMLA et de l’insulinorésistance (IR), principal facteur de risque de la RD. Dans ce contexte, nous avons tenter d’évalué 1- l’impact de facteurs endogènes et environnementaux générateurs de stress oxydatif, de produits terminaux de glycation (PTG) ou d’insulinorésistance sur la fonction et le vieillissement de la rétine, et 2- l’adaptation de la rétine à un régime riche en AGPI-LC oméga-3 dans modèle murin de vieillissement de la rétine humaine, la souris ApoB100,LDLR-/-.Les animaux soumis à un stress oxydatif et à des PTG présentent une altération de la fonction rétinienne associée à une accumulation de cellules microgliales et/ou macrophages dans la rétine externe. L’IR induit une modulation de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides, l’inflammation et dans la synthèse de facteurs nucléaires. Une alimentation riche en AGPI-LC oméga-3 induit une amélioration de l’incorporation d’acides gras oméga-3 dans la rétine et la modulation du gène codant le récepteur aux LDL dans la rétine neurosensorielle.En conclusion, nos travaux montrent une adaptation de la rétine d’une part à des conditions propices au vieillissement de la rétine et l’insulinorésistance, et d’autre part à un régime alimentaire riche en acides gras oméga-3 et pauvre en oméga-6, reconnu comme protecteur du vieillissement de la rétine / With advanced age, aging of the human retina can evolve into pathological forms, age-related macular degeneration (AMD) or diabetic retinopathy (DR). Meanwhile, epidemiological studies suggest that a diet rich in long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) such as EPA and DHA, potentially protects against the development of AMD and insulin resistance, the main risk factor for DR. Within this context, our research objectives were to assess: 1 - the impact of endogen and environmental factors, known to trigger oxidative stress, advanced glycation end-products (AGEs) or insulin resistance, on the function and aging of the retina, and 2 - the response of the retina to a omega-3 LC-PUFA-enriched diet in a murine model of aging of the human retina, the ApoB100,LDLR-/- mouse.The animals exposed to oxidative stress and AGEs showed an alteration of the retinal function associated with an accumulation of microglial cells and/or macrophages in the outer retina. The insulin resistance induced a modulation of the expression of genes coding proteins involved in lipid metabolism, inflammation and nuclear factors. An omega-3 LC-PUFA-enriched diet improved the incorporation of omega-3 LC-PUFA in the retina and modulated the expression of the LDL-receptor gene in the neurosensory retina.In conclusion, our works reported the adaptive response of the retina to environmental and endogenous factors known to promote aging of the retina. It included the impairment of the retinal function, and the modulation of gene expression. Our data also gave a better understanding of the effects of omega-3 LC-PUFA against aging of the retina

La rétraction des dendrites de cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) est parmi les changements pathologiques qui conduisent à des déficits fonctionnels lors du glaucome. Récemment, on a montré que l’administration de l’insuline promeut une importante régénération des dendrites des cellules ganglionnaires de la rétine et rétablie les synapses. On se basant sur ces données, on a posé les questions suivantes: 1) Est ce que la réduction de la pression intraoculaire (PIO) élevée est suffisante pour promouvoir la régénération des dendrites en absence d’apport exogène de l’insuline? 2) Quels sont les mécanismes moléculaires en aval de l’insuline qui permettent la régénération des dendrites des CGR lors du glaucome? Les souris transgéniques Thy1-YFP, qui permettent la visualisation des dendrites des CGR, ont reçu une injection intra-camérale de microbilles magnétiques pour induire l’hypertension oculaire. Des gouttes journalières du brinzolamide ont été administrées pour réduire la PIO. Les CGR ont été imagés à l’aide du microscope confocal et les dendrites ont été reconstruites en 3D grâce au logiciel Imaris. Pour l’analyse des mécanismes moléculaires, les CGR ont été isolées grâce à la technique de cytométrie FACS, à partir des rétines traitées à l’insuline et au véhicule suivi par un séquençage d’ARN (ARNseq). Le brinzolamide réduit de façon effective la PIO, cependant cette réduction ne permet pas la régénération des dendrites des CGR. Le séquençage de l’ARN des rétines glaucomateuses et des rétines contrôles a aidé à identifier des voies de signalisation candidates pour participer à la régénération des dendrites des CGR incluant mTOR, Notch, glycolyse, métabolisme des acides gras, réparations d’ADN et myc-cibles. Ces données nous ont conduit à retirer les conclusions suivantes: 1) La réduction de la PIO n’est pas suffisant pour promouvoir la régénération IV des dendrites des CGR, suggérant que l’insuline endogène ne remplit pas le rôle de l’insuline exogène. 2) De nombreuses voies moléculaires sont activées pour mener l'effet régénérateur de l’insuline sur les dendrites des CGR. Ces résultats supportent le rôle de l’administration de l’insuline pour restaurer les connections et le fonctionnement de la rétine et identifient des gènes qui pourraient être de nouvelles cibles pour traiter le glaucome. / Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide. High intraocular pressure (IOP) is the most important risk factor to develop the disease. The retraction of retinal ganglion cell (RGC) dendrites is one of the earliest pathological changes leading to substantial functional deficits. We recently demonstrated that insulin, administered after arbor retraction, promoted remarkable RGC dendrite and synapse regeneration. Here, we asked the following questions: 1) is insulin effective at promoting RGC dendrite regeneration in experimental glaucoma? 2) is reduction of IOP sufficient to promote dendrite regeneration in the absence of exogenous insulin? 3) what are the signaling components downstream of insulin that stimulate RGC dendrite regeneration in glaucoma? Thy1-YFP mice, which allow visualization of RGC dendritic arbors, received an intracameral injection of magnetic microbeads to induce ocular hypertension. RGC dendrites were imaged by confocal microscopy and arbors were 3D reconstructed. Total RGC dendritic length and complexity increased in glaucomatous eyes treated with insulin to values similar to those found in intact non-injured controls, but not in eyes treated with brinzolamide, to lower IOP, or vehicle. RGCs were isolated by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) from insulin- or vehicle-treated glaucomatous retinas as well as shamoperated controls, followed by RNA sequencing analysis (RNA-seq). Our data show a global decrease in transcriptional efficiency in glaucomatous retinas. In addition, we identified a number of key regulatory pathways potentially implicated in insulin-induced RGC dendrite regeneration including: the mammalian target of rapamycin (mTOR), glycolysis, fatty acid metabolism, DNA repair, and myc-targets. These data allow us to draw the following conclusions: 1) insulin promotes robust RGC dendrite regeneration in glaucoma, 2) IOP reduction alone is not sufficient to promote dendritic regrowth, and 3) multiple molecular pathways are activated during insulin-mediated regeneration. These findings support a critical role for insulin administration to restore RGC dendritic structure, and identify differential gene expression that might reveal novel therapeutic targets for glaucoma.

Les modifications post-traductionnelles (MPTs) permettent un haut degré de régulation de l'expression des gènes en générant une diversité fonctionnelle au niveau du protéome. Dans le système nerveux, les MPTs régulent entre autres des facteurs de transcription permettant une adaptation rapide à un microenvironnement dynamique. Dans ce contexte, je me suis concentrée sur l’étude des Glycogène Synthase Kinases 3 (GSK3s). Elles sont au centre de la régulation de nombreuses voies de signalisation et contrôlent la stabilité de multiples cibles par phosphorylation. Au cours du développement du cerveau, les kinases GSK3 contrôlent la balance entre la prolifération et la différenciation. La dérégulation de l'activité des kinases GSK3 a un rôle clé dans les maladies neurodégénératives du cerveau. En revanche, le rôle important de ces kinases au cours du développement rétinien ainsi que dans les maladies neurodégénératives rétiniennes reste une question ouverte.L'objectif de ma thèse était d'étudier le rôle de ces kinases au cours du développement et de l'homéostasie rétinienne. J’ai montré que l'absence totale de Gsk3α et de Gsk3β très tôt au cours du développement rétinien entraîne une microphtalmie chez l'adulte. Les deux kinases jouent des rôles redondants puisque l'expression d'un seul allèle Gsk3 est suffisante pour prévenir le phénotype de microphtalmie. Cependant, une analyse phénotypique approfondie dans ce contexte génétique (un seul allèle Gsk3) a révélé une forte augmentation du nombre de cellules ganglionnaires déplacées (dRGCs) dans la couche nucléaire interne, associée à une modification des projections axonales des cellules ganglionnaires dans le cerveau par rapport aux contrôles. Dans l’ensemble, ces données suggèrent que les kinases GSK3s sont essentielles au maintien des progéniteurs rétiniens et sont impliquées dans la genèse des dRGCs. Compte tenu du très faible nombre de dRGCs en conditions normales, la fonction de ces cellules a été très peu étudiée à ce jour. Le modèle génétique que j’ai développé offre par conséquent un modèle de choix pour étudier l’ontogenèse et la fonction de ces cellules.Mes travaux de thèse se sont ensuite concentrés sur le rôle de GSK3 dans les photorécepteurs. En effet, des défauts de développement ou leur mort est l’une des principales causes de dégénérescence rétiniennes. Afin de mieux comprendre la fonction de ces kinases dans la maintenance des photorécepteurs, j'ai donc utilisé des souris invalidées de manière conditionnelle pour Gsk3α et Gsk3β spécifiquement dans les précurseurs des photorécepteurs. L’absence de GSK3 conduit à une altération de la maturation et de la fonction des photorécepteurs, suivie de leur dégénérescence. J’ai alors combiné des analyses transcriptomiques et des approches in vitro pour élucider les mécanismes sous-jacents. Mes données m’ont conduit à proposer un modèle selon lequel l’absence de GSK3 dans les photorécepteurs conduit à des défauts de phosphorylation de NRL (facteur de transcription nécessaire au développement des photorécepteurs de type bâtonnet), augmentant sa stabilité. Cette dérégulation post-traductionnelle conduit à la diminution d’expression d'un sous-ensemble de gènes cibles de NRL, co-régulés par CRX, et impliqués dans le développement et l'homéostasie des photorécepteurs. Cette dérégulation conduirait alors à la dégénérescence des photorécepteurs observée dans les mutants GSK3. Ce travail suggère donc que GSK3 joue un rôle essentiel dans la régulation de NRL pour contrôler la maturation et l'homéostasie des photorécepteurs. De telles données suggèrent également que ce mécanisme de régulation pourrait être déficient chez les patients atteints de rétinites pigmentaires dues à des mutations de NRL empêchant sa phosphorylation par GSK3. / Post-translational modifications (PTMs) allow a higher degree of regulation for the control of gene expression by generating functional diversity at the proteome level. In the central nervous system, PTMs regulate stability or activity of transcription factors allowing a rapid response to external signals and a quick adaptation to a dynamic cellular microenvironment. In this context, I focused on the ubiquitously expressed and highly conserved Glycogen Synthase Kinases 3 (GSK3s). They are at the crossroad of multifunctional signalling pathways. During mammalian brain development, GSK3 kinases control the balance between proliferation and differentiation. Deregulation of GSK3 kinases activity has also a key role in neurodegenerative diseases by causing the accumulation/aggregations of proteins causing neuronal cell death. Drugs targeting GSK3s hold a lot of promises to treat such diseases. Whether these kinases are also important during retinal development and involved in retinal diseases remains an open question. Several studies suggest the importance of regulating GSK3 function in photoreceptor under pathological conditions. Therefore, the main objective of my PhD was to investigate the role of these kinases during photoreceptor development and homeostasis. To better understand the role of these two kinases during retinal development and to highlight potential differences with the developing brain, we also investigated their function in the control of the balance between proliferation and differentiation of retinal progenitors. To achieve my work, I used conditional knockout mice for Gsk3α and Gsk3β specifically deleted either in photoreceptor precursors or in retinal progenitors during early development. The lack of GSK3 kinases in photoreceptor precursors led to impaired photoreceptor maturation and function followed by their degeneration. Transcriptomic analysis (RNAseq) 6, 10 and 14 days postnatally prior degeneration revealed several genes downregulated belonging to biological processes involved in eye development and visual functions. Among them, the expression of the transcription factor Nrl that is required for rod photoreceptor development was decreased. Astonishingly, NRL expression was highly increased at protein level. By in vitro approaches, I demonstrated that GSK3-dependent phosphorylation regulates NRL protein stability. Despite such increase, a large number of NRL target genes were downregulated leading to impaired photoreceptor maturation and function. Surprisingly, a vast majority of these downregulated genes were also target genes for CRX, another transcription factor working in synergy with NRL. This work demonstrates that PTMs of NRL play a critical role in fine tuning the expression of a subset of genes involved photoreceptor development and homeostasis. Such findings could allow the development of innovative therapeutic strategies for retinal dystrophies. The functional characterisation of GSK3 in the course of retinal development by invalidating both Gsk3α and Gsk3β in retinal progenitors early during development revealed their requirement for controlling cell cycle exit and neuronal differentiation. Indeed, the complete lack of Gsk3α and Gsk3β led to microphtalmia in adults. Interestingly, the expression of only one Gsk3 allele was enough to rescue the phenotype. However, further analysis revealed a large number of displaced ganglion cells in the inner nuclear layer. The function of these cells remains to be determined, but their timing of production corresponds to other ganglion cells. Strikingly, these displaced ganglion cells project in distinct brain regions than normal ganglion cells. Therefore, our work could provide the first step toward determining the function of the displaced ganglion cells, which appear at low number in wildtype but whose function remains to be clarified.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Facteur de transcription Ikaros / La rétine constitue un modèle très intéressant pour l'étude du développement du système nerveux. Elle origine de cellules neuroépithéliales qui se diviseront et se différencieront pour donner naissance à 6 différents types de neurones et un type de cellule gliale. Au cours du développement, la majorité des cellules progénitrices de la rétine (CPRs) sont multipotentes et quelques unes ont même le potentiel de générer tous les différents types cellulaires de la rétine. Cependant, à des stades plus tardifs, les CPRs perdent alors la compétence qui leur permet de générer les cellules dites précoces et acquièrent la capacité de générer les cellules dites tardives. Il est clair que l'ensemble des types cellulaires est produit dans un ordre bien précis et concomitant, mais les mécanismes moléculaires par lesquels les CPRs changent leur compétence au cours du temps pour générer chaque type de cellule au bon moment restent toutefois inconnus. Le facteur de transcription Ikaros avait été largement étudié dans le système hématopoïétique, cependant son rôle potentiel au niveau du système nerveux n'avait que très peu été exploré. Dans cette étude nous avons investigué l'hypothèse qu'Ikaros puisse contrôler la compétence temporelle des CPRs. Nous avons premièrement observé qu'Ikaros est exprimé dans les CPRs au début du développement tandis qu'à des stades plus avancés son expression devient alors restreinte à une sous-population pour finalement être absente dans l'ensemble des CPRs aux derniers stades du développement de la rétine. De plus, chez la rétine adulte, Ikaros est exprimé dans les neurones différenciés de type précoce. En effectuant une analyse clonale à l'aide de rétrovirus, nous avons montré qu'en induisant l'expression d'Ikaros dans les CPRs à des stades tardifs, où il n'est normalement pas exprimé, il est possible d'induire la production de cellules de type précoce au dépend des cellules produites tardivement. De plus, l'analyse de souris dont le gène Ikaros à été inactivé nous a révélé que plusieurs cellules nées précocement au cours du développement sont manquantes. L'ensemble de ces résultats suggère donc un modèle dans lequel l'expression d'Ikaros est à la fois nécessaire et suffisante pour conférer une compétente temporelle précoce au CPRs. Une fois la diversité cellulaire générée, des vagues d'apoptoses successives ont lieu de manière à éliminer les cellules extranuméraires ou corriger les erreurs de connections. La mort cellulaire programmée ou apoptose est donc un procédé essentiel au développement du système nerveux. Cependant, les régulateurs extracellulaires de cette mort cellulaire developpementale restent toutefois très méconnus. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de la voie de signalisation du CNTF/LIF durant le développement rétinien in vivo. Nous démontrons que l'exposition au CNTF durant le développement postnatal de la rétine in vivo retarde l'expression de la rhodopsine et résulte en un important déficit spécifique en photorécepteurs. Plus spécifiquement, nous montrons que l'exposition au CNTF induit une augmentation importante de la mort cellulaire des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets. De plus, nous montrons que le blocage de la voie du CNTF/LIF durant le développement de la rétine de souris in vivo résulte en une diminution significative de la mort cellulaire developpementale des photorécepteurs. Nous démontrons aussi que la voie CNTF/LIF est responsable de l'apoptose spécifique des photorécepteurs issuent de clones contenant seulement des photorécepteurs sans toutefois affecter les photorécepteurs issuent de clones mixtes. Nous avons observé que la stimulation ou le blocage de la voie du CNTF/LIF contrôle l'expression génique des isoformes neuronale et endotheliale de la synthase d'oxide nitrique (NOS) et la production subséquente d'oxide nitrique (NO) à partir de ces enzymes est responsable de l'apoptose induite par CNTF . Ces résultats suggèrent donc que la voie de signalisation du CNTF/LIF est active au cours du dévelopement rétinien et agit via la régulation de la production d'oxide nitrique afin de moduler la mort cellulaire programmée des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets.