Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T16:40:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AnnaCarolinaCançadoFigueiredo PDF.pdf: 7197319 bytes, checksum: 5f6169b4110cbabcb3410f58366dedfb (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T16:41:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AnnaCarolinaCançadoFigueiredo PDF.pdf: 7197319 bytes, checksum: 5f6169b4110cbabcb3410f58366dedfb (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T16:41:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AnnaCarolinaCançadoFigueiredo PDF.pdf: 7197319 bytes, checksum: 5f6169b4110cbabcb3410f58366dedfb (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-18T16:41:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AnnaCarolinaCançadoFigueiredo PDF.pdf: 7197319 bytes, checksum: 5f6169b4110cbabcb3410f58366dedfb (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou / O diagnóstico precoce acurado do câncer cervical, relevante problema de saúde pública no mundo e no Brasil, pela citologia oncótica (Teste de Papanicolaou), é muito prejudicado pela subjetividade e variabilidade dos resultados falsos negativos e falsos positivos do método, particularmente diante de células escamosas atípicas (ASC). Recentes inovações técnicas, como citologia em meio líquido e imunocitoquímica com biomarcadores de proliferação celular, aumentaram a expectativa de melhorias no rastreamento do câncer cervical. No entanto, a aplicabilidade destas inovações nos estágios mais iniciais de atipia e displasias epiteliais permanecem incertas. Assim, considerando resultado prévio do nosso grupo de pesquisa, que identificou a proteína RAP1 como biomarcador diagnóstico da displasia cervical, este trabalho tem como objetivo caracterizar a expressão da proteína RAP1, comparativamente à expressão dos biomarcadores p16 e Ki-67, por imunocitoquímica, em blocos de células escamosas cervicais para possível aplicabilidade na triagem do câncer do colo do útero. Para tal, 34 amostras, 27 pacientes com diagnóstico de alterações celulares benignas (ACB) e 7 pacientes com diagnóstico de ASC foram coletadas na unidade Jenny Faria do Hospital das Clínicas da UFMG. Os resultados indicaram que 85% das amostras de blocos celulares foram satisfatórias para análise morfológica e a técnica reproduziu os principais parâmetros citopatológicos da citologia convencional. Em relação a sua utilização para diagnóstico, o bloco de células apresentou sensibilidade de 38,46%, especificidade de 90,47% e uma variabilidade interobervador com taxa de concordância de aproximadamente 30% para os grupos ACB e ASC. A expressão da proteína RAP1 foi positiva na maioria das amostras do grupo “ACB” (15/27 ou 55,56%) e resultado negativo na maioria das amostras do grupo “ASC” (4/7 ou 57,14%) com sensibilidade de 16,66%, especificidade de 75, %. As reações imunocitoquímicas das proteínas p16 e Ki-67 demonstraram, em ambos os grupos, apresentaram predomínio absoluto ou totalidade de resultados negativos. O DNA de HPV foi detectado em 9 (33,33%) das 27 amostras do grupo ACB e em 4 (57,14%) das 7 amostras do grupo ASC. O HPV-16 foi detectado nas 4 amostras do grupo ASC. Nas amostras do grupo ACB foram detectados os HPV-16, em 5 amostras, HPV-58, em 2 amostras, HPV-45, em 1 amostra e HPV-66 em 1 amostra. Observamos inexistência de relação entre a presença do HPV e a expressão imunocitoquímica de RAP1 em ambos os grupos. Em conclusão, os blocos de células podem complementar o teste de Papanicolaou na triagem do câncer do colo uterino e a expressão da proteína RAP1 está aumentada em células cervicais em ambiente inflamatório, associado ou não à presença de HPV / The accurate early diagnosis of cervical cancer, relevant public health problem worldwide and in Brazil by cytology (Pap test), is hampered by its subjectivity and variability of false positive and false negative results, particularly on atypical squamous cell (ASC). Recent technical innovations, such as based liquid cytology and immunocytochemistry for with cell proliferation biomarkers, increased the expectation cervical cancer screening. However, the applicability of these innovations in early stages of epithelial dysplasia and atypia remains uncertain. Considering previous findings of our research group, which identified the RAP1 protein as a biomarker diagnosis of cervical dysplasia, this study aims to characterize the expression of RAP1 (compared to the expression of p16 and Ki-67 biomarkers) by immunocytochemistry in cell blocks of cervical squamous cells, for possible applicability in screening for cervical cancer. For this purpose, 27 patients with benign cellular changes (ACB) and 7 patients with ASC diagnosis were collected in Hospital das Clínicas from UFMG. The results indicated that 85% of the samples of cell blocks were satisfactory for morphological analysis and also that the cytological technique reproduces the main parameters of the conventional cytology. Regarding its use for diagnosis, the cell block had a sensitivity of 38.46%, specificity of 90.47% and an interobserver variability with concordance rate of approximately 30% for the ACB and ASC groups. The RAP1 expression was positive in most of the samples of the group "ACB" (15/27 or 55.56%) and most negative in the sample group "ASC" (4/7 or 57.14%) with a sensitivity of 16.66% and specificity of 75%. The immunocytochemical reactions for p16 and Ki-67 showed predominance of negative or all negative staining in both groups. HPV DNA was detected in 9 (33.33%) of the 27 samples of the ACB group and in 4 (57.14%) of 7 ASC group samples. HPV-16 was detected in 4 samples ASC group. Samples from the group ACB HPV-16 were detected in 5 samples, HPV-58 in 2 samples, HPV-45, HPV-1 sample, and 66 in one sample. We observed no relationship between the presence of HPV and immunostaining of RAP1 in both groups. In conclusion, cell blocks can be a ancillary tool to the Pap test for cervical cancer in screening and the expression of the RAP1 protein is increased in cervical cells in an inflammatory environment, with or without the presence of HPV.

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Nos indivíduos com obesidade, o excesso de tecido adiposo, exerce um papel fundamental induzindo um estado inflamatório crônico e sistêmico. A obesidade mimetiza processos celulares semelhantes aos do envelhecimento tais como a deterioração de tecidos e órgãos e diminuição na capacidade de reparo dos danos induzidos ao DNA. Nesse contexto, as citocinas pró-inflamatórias induzem atritos ao DNA que impactam, principalmente nas regiões mais susceptíveis dos cromossomos, os telômeros. Os telômeros, presentes nas extremidades dos cromossomos, estão associados a um complexo proteico denominado complexo shelterin. O complexo shelterin é formado por 6 proteínas (TRF1, TRF2, TIN2, POT1, TPP1 e RAP1), que junto com proteínas acessórias como a disquerina (DKC1), participam da regulação do comprimento dos telômeros e protegem os cromossomos dede atividades indesejadas de erosão enzimática, recombinação não-homóloga e fusão das terminações cromossômicas. Nos últimos anos, foram estabelecidas relações positivas entre condições patológicas clinicamente diferentes, como as moduladas por inflamação, e o comprimento dos telômeros. Recentemente, nosso grupo demonstrou telômeros encurtados em indivíduos portadores de obesidade mórbida. Assim o objetivo do presente trabalho foi explorar fatores adicionais associados ao metabolismo telomérico, como a expressão gênica das proteínas do complexo shelterin e citocinas pró-inflamatórias, as quais podem contribuir para o encurtamento acelerado de telômeros. Utilizamos amostras de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos adultos saudáveis (n = 27) e indivíduos adultos portadores de obesidade (n = 39). Quantificamos a expressão gênica por transcrição reversa e PCR quantitativa (RT-qPCR) de todos os genes do complexo shelterin, DKC1, IL-1β e TNF-α. Nossos resultados demonstram um perfil de expressão gênica alterado quando comparada a expressão gênica das proteínas analisadas nos dois grupos estudados, controles e portadores de obesidade. Os indivíduos portadores de obesidade mostraram um perfil significativamente elevado dos genes TRF1, POT1, RAP1 e DKC1 (P < 0,05). Não observamos correlação de expressão gênica entre os diferentes genes e o comprimento dos telômeros nos grupos estudados, mas sim com a DKC1 na obesidade. Entretanto, quando analisamos as associações entre os genes de complexo shelterin observamos mudanças significativas nas associações intra-grupo dependentes da condição de obesidade. Nossos resultados salientam a complexa e intrincada rede de fatores associados e desregulados durante o processo fisiopatológico da obesidade. Estudos adicionais serão necessários acrescentando novos fatores para tentar dissecar a regulação coordenada do comprimento dos telômeros na homeostase e no processo patológico da obesidade. / In individuals with obesity, the excess of adipose tissue plays a key role in inducing a chronic and systemic inflammatory state. Like aging, obesity mimics cellular processes such as deterioration of tissues and organs and decreased ability to repair age-dependent DNA damages. In this context, the proinflammatory cytokines induce DNA damage that impact, especially in the most susceptible regions of the chromosomes, the telomeres. The telomeres, present at the ends of the chromosomes, are associated with a protein complex called the shelterin complex. The shelterin complex consists of 6 proteins (TRF1, TRF2, TIN2, POT1, TPP1 and RAP1), which together with accessory proteins such as dyskerin (DKC1), participate in telomere’s length regulation and protect chromosomes from undesired erosion, enzymatic activities, non-homologous recombination and fusion of chromosomal terminations. In recent years, positive relationships have been established between clinically different pathological conditions, such as those modulated by inflammation, and telomeres’ length. Recently, our group demonstrated shortened telomeres in individuals with morbid obesity. Thus, the aim of the present study was to explore additional factors associated with telomeres’ metabolism, such as gene expression of the shelterin complex components and proinflammatory cytokines, which may contribute to the accelerated shortening of the telomeres. We used peripheral blood mononuclear cells (PBMC) samples from healthy adults (n = 27) and adults with obesity (n = 39). We quantified gene expression by reverse transcription and quantitative PCR (RT-qPCR) of all shelterin complex genes, DKC1, IL-1β and TNF-α. Our results demonstrate an altered gene expression profile when compared to the gene expression of the proteins analyzed in the two studied groups, controls and individuals with obesity. Individuals with obesity showed a significantly elevated profile of TRF1, POT1, RAP1 and DKC1 (P < 0.05) genes. We did not observe correlation of gene expression between the different shelterin genes and the length of telomeres in the studied groups, but with DKC1 in obesity. However, when we analyzed the associations between the shelterin complex genes we observed significant changes in the intra-group associations dependent on the obesity condition. Our results highlight the complex and intricate network of associated and deregulated factors during the pathophysiological process of obesity. Further studies are needed together with the inclusion of additional factors to try to dissect the coordinated regulation of telomeres’ length in homeostasis and in the pathological process of obesity.

Background: Selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI) antidepressants prevent serotonin (5-HT) uptake by the serotonin transporter (SERT). Since blood platelets express SERT, SSRIs may modify platelet function and the risk of cardiovascular disease. However, the beneficial or adverse effects of SSRIs on arterial thrombosis are poorly characterised and detailed in vitro experimental data is limited. The SSRI citalopram is a racemate, the (S)-isomer being the more potent SERT inhibitor. Although citalopram has been shown to inhibit platelets in vitro, it is unclear whether this is mediated via SERT blockade. Aim: To determine if citalopram inhibits platelet function via SERT blockade, or through a novel mechanism of action. Findings: 5-HT uptake into platelets was blocked by both citalopram isomers at concentrations that had no apparent effect on platelet function. Despite the (S)-citalopram isomer being the more potent SERT inhibitor, (R)-citalopram was equally potent at inhibiting other platelet functions. These findings strongly suggest that inhibition of platelet function by citalopram in vitro is not mediated by blocking SERT. Subsequent experiments identified two putative mechanisms for citalopram-mediated platelet inhibition: 1) citalopram did not inhibit calcium store release induced by the platelet agonist U46619, despite blocking subsequent Rap1 activation. A credible target for this inhibitory mechanism is the calcium and diacylglycerol guanine nucleotide exchange factor-1 (CalDAG-GEFI): 2) citalopram suppressed early protein phosphorylation within the GPVI pathway, resulting in the inhibition of subsequent platelet responses. Further experiments show that other commonly used antidepressants also inhibit platelets. As with citalopram, inhibition was only observed at concentrations above those required to block SERT, suggesting that alternative inhibitory mechanism(s) are responsible. Conclusions: Data presented in this thesis support two novel putative mechanisms of citalopram-induced platelet inhibition. These findings demonstrate that citalopram and other antidepressants inhibit platelets independently of their ability to block SERT-dependent 5-HT transport. The identification of thesemechanisms provides a pharmacological approach to develop novel antiplatelet agents based on current antidepressants.

Nos indivíduos com obesidade, o excesso de tecido adiposo, exerce um papel fundamental induzindo um estado inflamatório crônico e sistêmico. A obesidade mimetiza processos celulares semelhantes aos do envelhecimento tais como a deterioração de tecidos e órgãos e diminuição na capacidade de reparo dos danos induzidos ao DNA. Nesse contexto, as citocinas pró-inflamatórias induzem atritos ao DNA que impactam, principalmente nas regiões mais susceptíveis dos cromossomos, os telômeros. Os telômeros, presentes nas extremidades dos cromossomos, estão associados a um complexo proteico denominado complexo shelterin. O complexo shelterin é formado por 6 proteínas (TRF1, TRF2, TIN2, POT1, TPP1 e RAP1), que junto com proteínas acessórias como a disquerina (DKC1), participam da regulação do comprimento dos telômeros e protegem os cromossomos dede atividades indesejadas de erosão enzimática, recombinação não-homóloga e fusão das terminações cromossômicas. Nos últimos anos, foram estabelecidas relações positivas entre condições patológicas clinicamente diferentes, como as moduladas por inflamação, e o comprimento dos telômeros. Recentemente, nosso grupo demonstrou telômeros encurtados em indivíduos portadores de obesidade mórbida. Assim o objetivo do presente trabalho foi explorar fatores adicionais associados ao metabolismo telomérico, como a expressão gênica das proteínas do complexo shelterin e citocinas pró-inflamatórias, as quais podem contribuir para o encurtamento acelerado de telômeros. Utilizamos amostras de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos adultos saudáveis (n = 27) e indivíduos adultos portadores de obesidade (n = 39). Quantificamos a expressão gênica por transcrição reversa e PCR quantitativa (RT-qPCR) de todos os genes do complexo shelterin, DKC1, IL-1β e TNF-α. Nossos resultados demonstram um perfil de expressão gênica alterado quando comparada a expressão gênica das proteínas analisadas nos dois grupos estudados, controles e portadores de obesidade. Os indivíduos portadores de obesidade mostraram um perfil significativamente elevado dos genes TRF1, POT1, RAP1 e DKC1 (P < 0,05). Não observamos correlação de expressão gênica entre os diferentes genes e o comprimento dos telômeros nos grupos estudados, mas sim com a DKC1 na obesidade. Entretanto, quando analisamos as associações entre os genes de complexo shelterin observamos mudanças significativas nas associações intra-grupo dependentes da condição de obesidade. Nossos resultados salientam a complexa e intrincada rede de fatores associados e desregulados durante o processo fisiopatológico da obesidade. Estudos adicionais serão necessários acrescentando novos fatores para tentar dissecar a regulação coordenada do comprimento dos telômeros na homeostase e no processo patológico da obesidade. / In individuals with obesity, the excess of adipose tissue plays a key role in inducing a chronic and systemic inflammatory state. Like aging, obesity mimics cellular processes such as deterioration of tissues and organs and decreased ability to repair age-dependent DNA damages. In this context, the proinflammatory cytokines induce DNA damage that impact, especially in the most susceptible regions of the chromosomes, the telomeres. The telomeres, present at the ends of the chromosomes, are associated with a protein complex called the shelterin complex. The shelterin complex consists of 6 proteins (TRF1, TRF2, TIN2, POT1, TPP1 and RAP1), which together with accessory proteins such as dyskerin (DKC1), participate in telomere’s length regulation and protect chromosomes from undesired erosion, enzymatic activities, non-homologous recombination and fusion of chromosomal terminations. In recent years, positive relationships have been established between clinically different pathological conditions, such as those modulated by inflammation, and telomeres’ length. Recently, our group demonstrated shortened telomeres in individuals with morbid obesity. Thus, the aim of the present study was to explore additional factors associated with telomeres’ metabolism, such as gene expression of the shelterin complex components and proinflammatory cytokines, which may contribute to the accelerated shortening of the telomeres. We used peripheral blood mononuclear cells (PBMC) samples from healthy adults (n = 27) and adults with obesity (n = 39). We quantified gene expression by reverse transcription and quantitative PCR (RT-qPCR) of all shelterin complex genes, DKC1, IL-1β and TNF-α. Our results demonstrate an altered gene expression profile when compared to the gene expression of the proteins analyzed in the two studied groups, controls and individuals with obesity. Individuals with obesity showed a significantly elevated profile of TRF1, POT1, RAP1 and DKC1 (P < 0.05) genes. We did not observe correlation of gene expression between the different shelterin genes and the length of telomeres in the studied groups, but with DKC1 in obesity. However, when we analyzed the associations between the shelterin complex genes we observed significant changes in the intra-group associations dependent on the obesity condition. Our results highlight the complex and intricate network of associated and deregulated factors during the pathophysiological process of obesity. Further studies are needed together with the inclusion of additional factors to try to dissect the coordinated regulation of telomeres’ length in homeostasis and in the pathological process of obesity.

Nos indivíduos com obesidade, o excesso de tecido adiposo, exerce um papel fundamental induzindo um estado inflamatório crônico e sistêmico. A obesidade mimetiza processos celulares semelhantes aos do envelhecimento tais como a deterioração de tecidos e órgãos e diminuição na capacidade de reparo dos danos induzidos ao DNA. Nesse contexto, as citocinas pró-inflamatórias induzem atritos ao DNA que impactam, principalmente nas regiões mais susceptíveis dos cromossomos, os telômeros. Os telômeros, presentes nas extremidades dos cromossomos, estão associados a um complexo proteico denominado complexo shelterin. O complexo shelterin é formado por 6 proteínas (TRF1, TRF2, TIN2, POT1, TPP1 e RAP1), que junto com proteínas acessórias como a disquerina (DKC1), participam da regulação do comprimento dos telômeros e protegem os cromossomos dede atividades indesejadas de erosão enzimática, recombinação não-homóloga e fusão das terminações cromossômicas. Nos últimos anos, foram estabelecidas relações positivas entre condições patológicas clinicamente diferentes, como as moduladas por inflamação, e o comprimento dos telômeros. Recentemente, nosso grupo demonstrou telômeros encurtados em indivíduos portadores de obesidade mórbida. Assim o objetivo do presente trabalho foi explorar fatores adicionais associados ao metabolismo telomérico, como a expressão gênica das proteínas do complexo shelterin e citocinas pró-inflamatórias, as quais podem contribuir para o encurtamento acelerado de telômeros. Utilizamos amostras de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos adultos saudáveis (n = 27) e indivíduos adultos portadores de obesidade (n = 39). Quantificamos a expressão gênica por transcrição reversa e PCR quantitativa (RT-qPCR) de todos os genes do complexo shelterin, DKC1, IL-1β e TNF-α. Nossos resultados demonstram um perfil de expressão gênica alterado quando comparada a expressão gênica das proteínas analisadas nos dois grupos estudados, controles e portadores de obesidade. Os indivíduos portadores de obesidade mostraram um perfil significativamente elevado dos genes TRF1, POT1, RAP1 e DKC1 (P < 0,05). Não observamos correlação de expressão gênica entre os diferentes genes e o comprimento dos telômeros nos grupos estudados, mas sim com a DKC1 na obesidade. Entretanto, quando analisamos as associações entre os genes de complexo shelterin observamos mudanças significativas nas associações intra-grupo dependentes da condição de obesidade. Nossos resultados salientam a complexa e intrincada rede de fatores associados e desregulados durante o processo fisiopatológico da obesidade. Estudos adicionais serão necessários acrescentando novos fatores para tentar dissecar a regulação coordenada do comprimento dos telômeros na homeostase e no processo patológico da obesidade. / In individuals with obesity, the excess of adipose tissue plays a key role in inducing a chronic and systemic inflammatory state. Like aging, obesity mimics cellular processes such as deterioration of tissues and organs and decreased ability to repair age-dependent DNA damages. In this context, the proinflammatory cytokines induce DNA damage that impact, especially in the most susceptible regions of the chromosomes, the telomeres. The telomeres, present at the ends of the chromosomes, are associated with a protein complex called the shelterin complex. The shelterin complex consists of 6 proteins (TRF1, TRF2, TIN2, POT1, TPP1 and RAP1), which together with accessory proteins such as dyskerin (DKC1), participate in telomere’s length regulation and protect chromosomes from undesired erosion, enzymatic activities, non-homologous recombination and fusion of chromosomal terminations. In recent years, positive relationships have been established between clinically different pathological conditions, such as those modulated by inflammation, and telomeres’ length. Recently, our group demonstrated shortened telomeres in individuals with morbid obesity. Thus, the aim of the present study was to explore additional factors associated with telomeres’ metabolism, such as gene expression of the shelterin complex components and proinflammatory cytokines, which may contribute to the accelerated shortening of the telomeres. We used peripheral blood mononuclear cells (PBMC) samples from healthy adults (n = 27) and adults with obesity (n = 39). We quantified gene expression by reverse transcription and quantitative PCR (RT-qPCR) of all shelterin complex genes, DKC1, IL-1β and TNF-α. Our results demonstrate an altered gene expression profile when compared to the gene expression of the proteins analyzed in the two studied groups, controls and individuals with obesity. Individuals with obesity showed a significantly elevated profile of TRF1, POT1, RAP1 and DKC1 (P < 0.05) genes. We did not observe correlation of gene expression between the different shelterin genes and the length of telomeres in the studied groups, but with DKC1 in obesity. However, when we analyzed the associations between the shelterin complex genes we observed significant changes in the intra-group associations dependent on the obesity condition. Our results highlight the complex and intricate network of associated and deregulated factors during the pathophysiological process of obesity. Further studies are needed together with the inclusion of additional factors to try to dissect the coordinated regulation of telomeres’ length in homeostasis and in the pathological process of obesity.

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