Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-30Bitstream added on 2014-06-13T20:56:18Z : No. of bitstreams: 1 albano_m_me_sjrp.pdf: 899652 bytes, checksum: 0556dccccf431c3b93be161fdeeb9b15 (MD5) / O interesse mundial pelo aproveitamento de resíduos agroindustriais como fonte renovável para produção de alimentos e biocombustíveis tem aumentado cada vez mais. Os materiais lignocelulósicos (MLCs) são uma fonte rica em polissacarídeos, celulose e hemicelulose, utilizados para o desenvolvimento de tecnologias na produção de álcool, xilose, xilitol, xilooligossacarídeos (XOS), entre outros. Fermentações submersas (FSm) e em estado sólido (FES) foram realizadas utilizando como substrato apenas bagaço de cana-de-açúcar ou suplementado com farelo de trigo, com o objetivo de produzir celulases (CMCase e Avicelase) e xilanases (β-1,4-xilanase e β-xilosidase) por seis fungos filamentosos isolados de bagaço de cana-de-açúcar em trabalhos anteriores. Dentre os estudados, a fermentação submersa (FSm) foi o melhor processo para a produção de xilanases e celulases. Para a produção de β-xilosidase o processo mais eficiente foi a fermentação em estado sólido (FES) . Dentre os microrganismos estudados para a produção de endoglucanases, destacaram-se os fungos filamentosos: U2370 (25,7 U/g), U19 (19,4 U/g) e Aspergillus fumigatus M51 (17,4 U/g), valores bem superiores aos encontrados na FES, cujos maiores destaques foram FS09 e U19 com aproximadamente 13 U/g. Para a produção de avicelase, os destaques foram: U19 (4,6 U/g) em FSM, T. reesei (3,0 U/g) e U2370 (3,8 U/g) todos em FSm. Para a produção de xilanase também os destaques foram todos em FSm: A. fumigatus M51 (1.263 U/g), N51 (1.247 U/g), FS 09 (1.133 U/g) e U 19 (1.129 U/g). Apenas a linhagem 100P (1.000 U/g) foi expressiva em FES. Já a enzima β-xilosidase foi produzida de forma bem mais expressiva apenas pela linhagem N51 (6,6 U/g) em FES. Nessa pesquisa apenas o fungo U19 se destacou para as três atividades (avicelase, xilanase e CMCase), o U2370... / The worldwide interest in the use of agro-industrial residues as a renewable source for food and biofuels production has increased even more. The lignocellulosic materials (MLCs) are a rich source of polysaccharides, cellulose and hemicelluloses, used in developing technology for the production of alcohol, xylose, xylitol and xilooligossacarids (XOS). Submerged fermentation (SmF) and solid state fermentation (SSF were performed using only bagasse cane sugar or supplemented with wheat bran) as substrate, with the goal of producing cellulases (CMCase and Avicelase) and xylanases (β-1, 4-xylanase and β-xylosidase) for six filamentous fungi isolated from crushed sugar cane in previous works. Among the studies, the submerged fermentation (SmF) was the best method for the production of xylanases and cellulases. For the production of β-xylosidase the most efficient process was the solid state fermentation (SSF). Among the microorganisms studied for producing endoglucanases, the most important filamentous fungi is: U2370 (25.7 U/ g), U19 (19.4 U/g) and Aspergillus fumigatus M51 (17.4 U/g), values much higher than those found in FES, whose major activities were FS09 and U19, with approximately 13 U/g. For the production of avicelase, activities were U19 (4.6 U/g) in FSm, T. reesei CCT 2768 (3.0 U/g) and U2370 (3.8 U/g) all in SmF. For the production of xilanases, the best activities were also all in SmF: A. fumigatus M51 (1263 U/g), N51 (1247 U/g), FS 09 (1133 U/g) and U19 (1,129 U/g). Only the strain 100P (1000 U/g) was significant in FES. The enzyme β-xylosidase was produced in a much more expressive only by strain N51 (6.6 U / g) in FES. In this study only the fungus U19 stood out for all three activities (avicelase, xylanase and CMCase), the U2370 is noted only as cellulolytic (avicelase and CMCase), and the N51 was the best producer... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Coorientador: Ana Flávia Azevedo Carvalho / Banca: Lucinéia dos Santos / Banca: Ary Fernandes Júnior / Resumo: O interesse mundial pelo aproveitamento de resíduos agroindustriais como fonte renovável para produção de alimentos e biocombustíveis tem aumentado cada vez mais. Os materiais lignocelulósicos (MLCs) são uma fonte rica em polissacarídeos, celulose e hemicelulose, utilizados para o desenvolvimento de tecnologias na produção de álcool, xilose, xilitol, xilooligossacarídeos (XOS), entre outros. Fermentações submersas (FSm) e em estado sólido (FES) foram realizadas utilizando como substrato apenas bagaço de cana-de-açúcar ou suplementado com farelo de trigo, com o objetivo de produzir celulases (CMCase e Avicelase) e xilanases (β-1,4-xilanase e β-xilosidase) por seis fungos filamentosos isolados de bagaço de cana-de-açúcar em trabalhos anteriores. Dentre os estudados, a fermentação submersa (FSm) foi o melhor processo para a produção de xilanases e celulases. Para a produção de β-xilosidase o processo mais eficiente foi a fermentação em estado sólido (FES) . Dentre os microrganismos estudados para a produção de endoglucanases, destacaram-se os fungos filamentosos: U2370 (25,7 U/g), U19 (19,4 U/g) e Aspergillus fumigatus M51 (17,4 U/g), valores bem superiores aos encontrados na FES, cujos maiores destaques foram FS09 e U19 com aproximadamente 13 U/g. Para a produção de avicelase, os destaques foram: U19 (4,6 U/g) em FSM, T. reesei (3,0 U/g) e U2370 (3,8 U/g) todos em FSm. Para a produção de xilanase também os destaques foram todos em FSm: A. fumigatus M51 (1.263 U/g), N51 (1.247 U/g), FS 09 (1.133 U/g) e U 19 (1.129 U/g). Apenas a linhagem 100P (1.000 U/g) foi expressiva em FES. Já a enzima β-xilosidase foi produzida de forma bem mais expressiva apenas pela linhagem N51 (6,6 U/g) em FES. Nessa pesquisa apenas o fungo U19 se destacou para as três atividades (avicelase, xilanase e CMCase), o U2370... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The worldwide interest in the use of agro-industrial residues as a renewable source for food and biofuels production has increased even more. The lignocellulosic materials (MLCs) are a rich source of polysaccharides, cellulose and hemicelluloses, used in developing technology for the production of alcohol, xylose, xylitol and xilooligossacarids (XOS). Submerged fermentation (SmF) and solid state fermentation (SSF were performed using only bagasse cane sugar or supplemented with wheat bran) as substrate, with the goal of producing cellulases (CMCase and Avicelase) and xylanases (β-1, 4-xylanase and β-xylosidase) for six filamentous fungi isolated from crushed sugar cane in previous works. Among the studies, the submerged fermentation (SmF) was the best method for the production of xylanases and cellulases. For the production of β-xylosidase the most efficient process was the solid state fermentation (SSF). Among the microorganisms studied for producing endoglucanases, the most important filamentous fungi is: U2370 (25.7 U/ g), U19 (19.4 U/g) and Aspergillus fumigatus M51 (17.4 U/g), values much higher than those found in FES, whose major activities were FS09 and U19, with approximately 13 U/g. For the production of avicelase, activities were U19 (4.6 U/g) in FSm, T. reesei CCT 2768 (3.0 U/g) and U2370 (3.8 U/g) all in SmF. For the production of xilanases, the best activities were also all in SmF: A. fumigatus M51 (1263 U/g), N51 (1247 U/g), FS 09 (1133 U/g) and U19 (1,129 U/g). Only the strain 100P (1000 U/g) was significant in FES. The enzyme β-xylosidase was produced in a much more expressive only by strain N51 (6.6 U / g) in FES. In this study only the fungus U19 stood out for all three activities (avicelase, xylanase and CMCase), the U2370 is noted only as cellulolytic (avicelase and CMCase), and the N51 was the best producer... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

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Estima-se que o Brasil produza no ano de 2010 cerca de 160 milhões de toneladas de bagaço e palha de cana-de-açúcar. O bagaço é um subproduto decorrente do esmagamento da cana, constituído por fibras, partículas de terra e resíduos de caldo. A palha é o material remanescente encontrado na superfície da área plantada, após a colheita, constituída por frações de folhas, ponteiros, colmos e raízes. Estes subprodutos são utilizados como fonte de energia dentro das próprias usinas e destilarias. Porém, com o interesse mundial voltado para o uso de outras fontes de energia, além do petróleo, a importância do emprego destes substratos na produção de etanol, aumentou. As fibras presentes nestes subprodutos são constituídas principalmente por celulose, hemicelulose e lignina. Os mecanismos enzimáticos envolvidos na degradação destes materiais, resultando na conversão da biomassa em produtos de alto valor agregado, são bastante complexos, necessitando da participação de enzimas lignocelulolíticas produzidas, sobretudo por fungos. Este estudo visou à caracterização enzimática lignocelulósica e a liberação de açúcares redutores por fungos ligninolíticos e celulolíticos, expostos a duas concentrações de nitrogênio e o comportamento destes organismos perante situação de estresse nutricional. Os fungos utilizados foram Pleurotus sajor caju, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei e Aspergillus niger, selecionados em trabalhos anteriores. Estes organismos foram inoculados em frascos Erlenmeyers, contendo bagaço e palha de cana pré-tratados com H2SO4 (0,5%) e duas concentrações de nitrogênio (0,5% e 1% de extrato de levedura), por 15 dias. Diariamente, foram coletadas amostras e analisadas quanto à concentração de proteínas, atividade específica de Lacase, Peroxidases, Manganês peroxidase, Endoglicanases, atividade celulolítica total, Superóxido dismutase (SOD), Catalase (CAT) e quantificação de açúcares redutores. A enzima SOD foi analisada através de PAGE não desnaturante e o perfil protéico observado em SDS-PAGE. As demais análises foram realizadas em espectrofotômetro. O meio contendo 0,5% de extrato de levedura foi favorável ao crescimento dos fungos P. sajor caju e T. reesei, e o meio com 1% de extrato foi favorável à P. chrysosporium e A. niger. Quanto à produção das enzimas ligninolíticas (µmol.min-1.mg proteína-1), a maior produção de Lacase foi observada em P. sajor caju (2,2; 1%; 13º dia), de Peroxidases também para P. sajor caju (1,5; 1%; 12º dia) e MnP para T. reesei (0,172; 1%; 4º dia). A maior atividade celulolítica total (FPU.mg proteína-1) e de Endoglicanases (CMC.mg proteína-1) foi observada para T. reesei (10,1 e 20,6; 0,5%; 7º dia, respectivamente). Quanto à maior liberação de açúcares redutores, P. chrysosporium (0,757 mgAR.gBS-1; 1%; 9º dia). Foram observadas até quatro isoformas de SOD que variaram entre os fungos, concentrações de nitrogênio e dias. As maiores atividades de CAT (µmol.min-1.mgproteína-1) foram observadas para P. sajor caju (0,811; 5º dia), T. reesei (0,726; 1º dia), P. chrysosporium (0,441; 3º dia) e A. niger (0,194; 10º dia), todos na concentração de 0,5%. As espécies, as concentrações de nitrogênio e o período de incubação influenciaram no crescimento, nas atividades enzimáticas e na liberação de açúcares redutores dos fungos / It is estimated that Brazil will produce in 2010 about 160 million tons of sugarcane bagasse and straw. The bagasse is a byproduct resulting from the crushing of sugarcane, consisting of fibers, particles of dirt and waste broth. The straw is the material found on the surface of the remaining crop, after harvest, consisting of fractions of leaves, pointers, stems and roots. These products are used as an energy source within their own mills and distilleries. However, with the global interest focused on the use of other energy sources instead of petroleum, the importance of using these substrates in ethanol production increased. The fibers in these products are composed primarily of cellulose, hemicellulose and lignin. The mechanisms involved in enzymatic degradation of these materials, resulting in conversion of biomass into high value added products, are quite complex, requiring the participation of lignocellulolytic enzymes produced mainly by fungi. This study aimed to a lignocellulosic enzymatic characterization and the release of reducing sugars by ligninolytic and cellulolytic fungi exposed to two concentrations of nitrogen and the behavior of these organisms against a nutritional stress situation. The fungi used were Pleurotus sajor caju, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei and Aspergillus niger, selected from previous work. These organisms were inoculated in Erlenmeyer flasks containing sugarcane bagasse and straw pretreated with H2SO4 (0.5%) and two concentrations of nitrogen (0.5% and 1% yeast extract) for 15 days. Daily samples were collected and analyzed for proteins concentration, specific activity of Laccase, Peroxidases, Manganese Peroxidase, Endoglucanases, total cellulolytic activity, Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and quantification of total sugar. The enzyme SOD was analyzed by native PAGE gels and the protein profile observed in SDS-PAGE. Other analyses were performed on a spectrophotometer. The medium containing 0.5% yeast extract was favorable to the growth of fungi P. sajor caju and T. reesei and the medium with 1% extract favored P. chrysosporium and A. niger. Regarding the production of lignilolytic enzymes (mol.min-1.mg protein-1), the highest activity of Laccase was found in P. sajor caju (2.2, 1%, 13 days), for Peroxidases also in P. sajor caju (1.5, 1%, day 12) and MnP in T. reesei (0.172, 1%, day 4). The highest total cellulolytic activity (FPU.mg protein-1) and Endoglucanases (CMC.mg protein-1) was observed for T. reesei (10.1 and 20.6, 0.5%, day 7, respectively). As for the highest release of total sugars, P. chrysosporium (0.757 mgAR.gBS-1, 1%, 9 day). It was observed up to four SOD isoforms that varied from fungi, nitrogen concentrations and days. The highest CAT activities (mol.min-1.mg protein-1) were observed for P. sajor caju (0.811, 5 days), T. reesei (0.726, day 1), P. chrysosporium (0.441, day 3) and A. niger (0.194, 10 days), all at 0.5% concentration. The species, nitrogen concentrations and the period of incubation influenced the growth, the enzymatic activity and the release of total sugars in the fungi

O fungo filamentoso Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) é o principal produtor de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas utilizadas para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa lignocelulósica. Para que o custo de produção de etanol de segunda geração (2G), em escala industrial, seja competitivo, uma mistura eficiente de enzimas hidrolíticas é necessária para degradar a biomassa vegetal em açúcares fermentescíveis. Dada a crescente demanda pelo desenvolvimento de processos que reduzam os custos de enzimas de interesse biotecnológico, o presente trabalho se propôs a analisar o perfil global do transcriptoma de T. reesei em presença de celulose, soforose e glicose como fontes de carbono, a fim de prover um melhor entendimento de como essas enzimas são produzidas por esse microrganismo. Para isso, foi utilizada a abordagem RNA-seq e duas linhagens de T. reesei: QM9414 (parental) e xyr1 (mutante). No Capítulo I, foram anlisados 22 genes que codificam celulases e xilanases, com o intuito de verificar a regulação da expressão gênica pelo fator de transcrição XYR1 em diferentes fontes de carbono. Foi observada uma dependência da fonte de carbono e redução da expressão destes genes que codificam celulases e xilanases quando se comparou a linhagem mutante com a parental, cultivados na presença de celulose e soforose. Na presença de glicose, a maior parte dos genes analisados apresentou aumento de expressão no mutante xyr1. Por meio de análises in silico foi identificado o elemento regulatório cis para o fator de transcrição XYR1 usando quatro conjuntos de dados de genes dependente-condição envolvendo os experimentos RNA-seq e qPCR-TR. Foram identificados dois motivos com o consenso de ligação proposto para o regulador XYR1 (nomeado PWMXYR1). Ao usar esses motivos identificados, foi analisada a presença e disposição dos putativos elementos regulatórios cis nesses conjuntos de dados, sendo que sítios com intervalos curtos foram mais associados a promotores dependentes de XYR1 do que sítios simples. Além disso, a abordagem utilizada permitiu a identificação de sítios de ligação XYR1, na região promotora dos genes cel7a e xyn1 e mapear a potencial sequência alvo do regulador na região promotora do gene cel6a. Adicionalmente, sete outros promotores (genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 e swo) apresentaram sítios de ligação putativos de XYR1. Usando a arquitetura do regulador PWMXYR1, foram identificados potenciais genes alvos de regulação direta por XYR1 no genoma de T. reesei. O mapeamento do referido sítio foi realizado, também, nos genes diferencialmente expressos na linhagem mutante xyr1, destacando que a regulação indireta desempenha um papel fundamental nas vias de sinalização. Estes resultados fornecem novas informações sobre os mecanismos de sinalização mediados por XYR1 na regulação de promotores de celulases. No Capítulo II, foi analisado o transcriptoma global da linhagem parental (QM9414) em diferentes fontes de carbono: celulose; soforose e glicose. Aplicando limites rigorosos de corte, 2060 genes foram identificados como diferencialmente expressos em pelo menos uma das fontes de carbono analisadas. Clusterização hierárquica desses genes diferencialmente expressos identificaram-se três possíveis regulons, representando 123 genes controlados por celulose, 154 genes controlados por soforose e 402 genes controlados por glicose. A análise da rede regulatória demonstrou a inter-relação existente entre as condições, permitindo a identicação de 75 genes específicos do crescimento em soforose e 107 de celulose. Esses resultados revelaram novos genes envolvidos na degradação da celulose, tais como: proteínas acessórias, transportadores, fatores de transcrição e CAZymes que respondem especificamente a presença de celulose ou soforose. No Capítulo III, analisou-se o perfil transcricional da linhagem mutante xyr1 comparando com a linhagem parental (QM9414), na presença das três fontes de carbono. As análises de expressão gênica revelaram que 2185 genes foram diferencialmente expressos na condição celulose, 2124 genes na condição soforose e 46 genes em glicose. Esses genes foram utilizados para analisar a inter-relação existente entre as condições, com destaque para grande número de genes exclusivos nas condições de indução (celulose e soforose). Por meio da clusterização hierárquica foram identificados 6 possíveis regulons, sendo 3 deles compostos por genes up-regulados e 3 regulons por genes down-regulados. Na ausência do regulador XYR1, a expressão de genes CAZys, fatores de transcrição, transportadores, entre outros, foram afetadas de modo dependente da fonte de carbono. Essas análises permitiram verificar que o fator de transcrição XYR1 é fundamental no processo de indução de enzimas de interesse biotecnológico, além de participar de outros processos bioquímicos/moleculares. Desse modo, todos os resultados obtidos fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão gênica durante a adaptação de T. reesei frente a diferentes condições ambientais como: diferentes fontes de carbono e necessidades nutricionais. Contribuindo, assim, para uma melhor caracterização desse fungo filamentoso em relação à produção de enzimas e o desenvolvimento de mutantes metabólicos para utilização industrial. / The filamentous fungus Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) is a major producer of cellulolytic enzymes used for biofuels production from lignocellulosic biomass. In order to achieve a low cost second generation ethanol production in industrial scale, an efficient mix of hydrolytic enzymes are required for the degradation of plant biomass into fermentable sugars. Given the growing demand for development of processes in order to reduce the cost of enzymes production, the present work proposes a large-scale transcriptomic analysis of T. reesei in presence of cellulose, sophorose, and glucose as carbon sources, in order to provide insights about the mechanisms of enzymes production by this microorganism. For this purpose, RNA-seq approach was employed, as well, as two T. reesei strains: QM9414 (parental) and xyr1 (mutant). In Chapter I, 22 genes encoding cellulases and xylanases were analyzed regarding the regulation through the transcription factor XYR1. This regulation seems to occur in a carbon source dependence manner, and the expression of cellulases and xylanases was diminished in the mutant strain compared to the parental strain in the presence of cellulose and sophorose. In glucose, most of the analyzed genes showed higher expression in the mutant compared to the parental strain. In silico analysis identified a cis regulatory element for XYR1 using four datasets of condition-dependent genes based on RNA-seq and qPCR experiments. Two binding motifs have been identified with the proposed consensus for the XYR1 (named PWMXYR1). Using these motifs, the presence and arrangement of putative cis regulatory elements was analyzed, and the results indicate that the sites with short intervals were stronger associated with XYR1 dependent promoters than single sites, even with high scores. Moreover, this approach allowed the identification of XYR1 binding sites in the promoter region of cel7a and xyn1, as well as, map the potential target sequence in the promoter of cel6a gene. In addition, seven other promoters from genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 and swo presented XYR1 putative binding sites. Using the cis-regulatory architecture of PWMXYR1, potential targets for direct regulation by XYR1were identified in a genome wide manner. The putative binding sites were also mapped in the differentially expressed genes identified in the mutant strain xyr1, suggesting that indirect regulation plays a key role in signaling pathways. Taken together, the data provided here provides important information regarding signaling mechanisms mediated by XYR1 in the regulation of cellulases promoters. In Chapter II, the transcriptome of the parental strain (QM9414) was analyzed in three carbon sources, cellulose, sophorose and glucose. By applying a stringent cut-off threshold, 2,060 genes were identified as differentially expressed in at least one of the carbon sources analyzed. Hierarchical clustering of differentially expressed genes identified three possible regulons, representing 123 genes controlled by cellulose, 154 genes controlled by sophorose and 402 genes controlled by glucose. The analysis of the regulatory network demonstrated the interrelation between the conditions, allowing the identification of 75 genes specifically expressed in soforose and 107 in cellulose. These results revealed new players involved in cellulose degradation, such as accessory proteins, transporters, transcription factors and CAZymes, that specifically respond to the presence of either cellulose or sophorose. In Chapter III, a genome wide comparative transcriptional analysis were performed between the mutant xyr1 strain and the parental strain (QM9414) using the three carbon sources. Gene expression analysis revealed 2,185 genes differentially expressed in cellulose, 2124 genes in sophorose and 46 genes in glucose. These differentially expressed genes were used to analyze the relationship between the conditions, revealing a greater number of exclusive genes in theinducing conditions (cellulose and sophorose). The hierarchical clustering analysis revealed 6 possible regulons, being three composed by up-regulated genes and 3 regulons composed by down-regulated genes. In the absence of the regulator XYR1, the expression of CAZy genes, transcription factors among other genes were affected in a carbon-dependent manner. These analyses showed that the transcription factor XYR1 has an essential role in induction of enzymes of biotechnological interest and participates in other biochemical/molecular processes. Taken together these results provide important information about the molecular events, involved in gene expression regulation during T. reesei adaptation to different environments such as: carbon sources and/or nutritional needs, thus contributing to a better understanding of this filamentous fungus regarding the the production of enzymes and the development of mutants for industrial applications.

A transcrição pela RNA polimerase II (RNA polimerase B) e a sínteses de proteínas são os mais importantes processos metabólicos em células eucarióticas, e estão envolvidas no controle da expressão gênica. Trichoderma reesei foi utilizado como modelo de estudo para o desenvolvimento deste estudo. Este fungo filamentoso é um microrganismo que vem sendo utilizado por vários laboratórios no mundo para o estudo dos diversos processos biológicos básicos devido à sua grande importância biotecnológica. Foi estabelecido por nosso grupo de pesquisa um banco de dados ESTs (\"Expressed Sequence Tags\") para este microrganismo e, por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs, determinou-se a reposta transcricional de T. reesei em função da disponibilidade de oxigênio e glicose, assim como a alguns estresses ambientais. Com base nesses resultados foram escolhidos alguns transcritos afetados pela limitação de oxigênio, tais como o gene btf3. Este gene codifica para a proteína reguladora BTF3 (Fator Transcricional 3 da RNA polimerase B), muito conservada em eucariotos, envolvida na transcrição de vários promotores da classe II e que faz parte do complexo que se liga aos polipeptídios nascentes (NAC). Com o intuito de estudar a funcionalidade do gene btf3 em condições normais e em choque térmico foi realizada uma análise transcricional comparativa em larga escala da cepa selvagem de T. reesei QM9414 e do mutante nocaute do gene btf3. A expressão de aproximadamente 2.000 genes foi analisada, por meio de \"microarrays\", em células submetidas ao estresse por choque térmico produzido pelo incremento da temperatura de cultura a 40°C. O nocaute do gene btf3 produziu o incremento da expressão dos genes das vias metabólicas primárias (ND4 e FBA), da defesa celular (DnaJ, HSP70 e RCI) e da síntese de proteínas (eIF2); enquanto que reprimiu genes da estrutura celular (HFBII) e da síntese de RNA (ATF21). No choque térmico, genes que codificam para proteínas associadas com a defesa celular, como as chaperonas Hsp70 e DnaJ, tiveram sua expressão induzida enquanto que proteínas associadas à divisão celular, como histonas e septina B, e à síntese de proteínas, como as proteínas ribossomais, foram reprimidas em ambas as cepas como resultado do estresse. Os resultados obtidos na análise por \"microarray\" foram validados através de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estes resultados sugerem que BTF3 possa atuar como repressor de alguns genes transcritos pela RNA polimerase II. / Transcription by RNA polymerase II (RNA polymerase B) and protein synthesis are the most important metabolic processes in eukaryotic cells, and they are involved in the control of gene expression. Trichoderma reesei was used as model of study for the development of this study. This filamentous fungus is a microorganism that has been used by some laboratories around the world for the study of diverse basic biological questions due to its great biotechnological importance. We had established a data base of ESTs (Expressed Sequence Tags) for this microorganism and, through the technique of cDNA microarray, we had determined the transcriptional response of T. reesei to oxygen and glucose availability, as well as some environmental stresses. Based on such studies we chose some transcripts affected by oxygen limitation such as the btf3 gene, for more detailed investigations. This gene codes for the BTF3 regulatory protein (RNA Polymerase B Transcription Factor 3), a conserved transcriptional factor among eukaryotes that is involved in the transcription of several class II promoters and is part of the nascent polypeptide-associated complex (NAC). In order to study the functionality of the btf3 gene in normal and heat shock conditions, a large-scale transcriptional comparative analysis between T. reesei wildtype strain QM9414 and the btf3 knockout mutant was executed. The expression of approximately 2,000 genes was analyzed using microarrays in cells submitted to heat stress produced by culture temperature increment to 40°C. The knockout of btf3 produces the increment of the expression of genes involved with the primary metabolism pathways (ND4 and FBA), cellular defense (DnaJ, HSP70 and RCI) and protein synthesis (eIF2); whereas it repressed genes related to the structure cell (HFBII) and RNA synthesis (ATF21). In heat shock, genes that encode Hsp70 and DnaJ proteins, associated to cellular defense, as chaperones, had their expression induced. On the other hand, genes for proteins associated to cellular division, such as histones and septin B, and those related to protein synthesis, such as ribossomal proteins were transcriptionally repressed in both strains as a result of the stress. The results obtained in the microarray analysis were validated through quantitative real-time PCR (qPCR). These results suggest that BTF3 can act as a repressor for some genes transcribed by RNA polymerase B.

A transcrição pela RNA polimerase II (RNA polimerase B) e a sínteses de proteínas são os mais importantes processos metabólicos em células eucarióticas, e estão envolvidas no controle da expressão gênica. Trichoderma reesei foi utilizado como modelo de estudo para o desenvolvimento deste estudo. Este fungo filamentoso é um microrganismo que vem sendo utilizado por vários laboratórios no mundo para o estudo dos diversos processos biológicos básicos devido à sua grande importância biotecnológica. Foi estabelecido por nosso grupo de pesquisa um banco de dados ESTs (\"Expressed Sequence Tags\") para este microrganismo e, por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs, determinou-se a reposta transcricional de T. reesei em função da disponibilidade de oxigênio e glicose, assim como a alguns estresses ambientais. Com base nesses resultados foram escolhidos alguns transcritos afetados pela limitação de oxigênio, tais como o gene btf3. Este gene codifica para a proteína reguladora BTF3 (Fator Transcricional 3 da RNA polimerase B), muito conservada em eucariotos, envolvida na transcrição de vários promotores da classe II e que faz parte do complexo que se liga aos polipeptídios nascentes (NAC). Com o intuito de estudar a funcionalidade do gene btf3 em condições normais e em choque térmico foi realizada uma análise transcricional comparativa em larga escala da cepa selvagem de T. reesei QM9414 e do mutante nocaute do gene btf3. A expressão de aproximadamente 2.000 genes foi analisada, por meio de \"microarrays\", em células submetidas ao estresse por choque térmico produzido pelo incremento da temperatura de cultura a 40°C. O nocaute do gene btf3 produziu o incremento da expressão dos genes das vias metabólicas primárias (ND4 e FBA), da defesa celular (DnaJ, HSP70 e RCI) e da síntese de proteínas (eIF2); enquanto que reprimiu genes da estrutura celular (HFBII) e da síntese de RNA (ATF21). No choque térmico, genes que codificam para proteínas associadas com a defesa celular, como as chaperonas Hsp70 e DnaJ, tiveram sua expressão induzida enquanto que proteínas associadas à divisão celular, como histonas e septina B, e à síntese de proteínas, como as proteínas ribossomais, foram reprimidas em ambas as cepas como resultado do estresse. Os resultados obtidos na análise por \"microarray\" foram validados através de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estes resultados sugerem que BTF3 possa atuar como repressor de alguns genes transcritos pela RNA polimerase II. / Transcription by RNA polymerase II (RNA polymerase B) and protein synthesis are the most important metabolic processes in eukaryotic cells, and they are involved in the control of gene expression. Trichoderma reesei was used as model of study for the development of this study. This filamentous fungus is a microorganism that has been used by some laboratories around the world for the study of diverse basic biological questions due to its great biotechnological importance. We had established a data base of ESTs (Expressed Sequence Tags) for this microorganism and, through the technique of cDNA microarray, we had determined the transcriptional response of T. reesei to oxygen and glucose availability, as well as some environmental stresses. Based on such studies we chose some transcripts affected by oxygen limitation such as the btf3 gene, for more detailed investigations. This gene codes for the BTF3 regulatory protein (RNA Polymerase B Transcription Factor 3), a conserved transcriptional factor among eukaryotes that is involved in the transcription of several class II promoters and is part of the nascent polypeptide-associated complex (NAC). In order to study the functionality of the btf3 gene in normal and heat shock conditions, a large-scale transcriptional comparative analysis between T. reesei wildtype strain QM9414 and the btf3 knockout mutant was executed. The expression of approximately 2,000 genes was analyzed using microarrays in cells submitted to heat stress produced by culture temperature increment to 40°C. The knockout of btf3 produces the increment of the expression of genes involved with the primary metabolism pathways (ND4 and FBA), cellular defense (DnaJ, HSP70 and RCI) and protein synthesis (eIF2); whereas it repressed genes related to the structure cell (HFBII) and RNA synthesis (ATF21). In heat shock, genes that encode Hsp70 and DnaJ proteins, associated to cellular defense, as chaperones, had their expression induced. On the other hand, genes for proteins associated to cellular division, such as histones and septin B, and those related to protein synthesis, such as ribossomal proteins were transcriptionally repressed in both strains as a result of the stress. The results obtained in the microarray analysis were validated through quantitative real-time PCR (qPCR). These results suggest that BTF3 can act as a repressor for some genes transcribed by RNA polymerase B.

Estima-se que o Brasil produza no ano de 2010 cerca de 160 milhões de toneladas de bagaço e palha de cana-de-açúcar. O bagaço é um subproduto decorrente do esmagamento da cana, constituído por fibras, partículas de terra e resíduos de caldo. A palha é o material remanescente encontrado na superfície da área plantada, após a colheita, constituída por frações de folhas, ponteiros, colmos e raízes. Estes subprodutos são utilizados como fonte de energia dentro das próprias usinas e destilarias. Porém, com o interesse mundial voltado para o uso de outras fontes de energia, além do petróleo, a importância do emprego destes substratos na produção de etanol, aumentou. As fibras presentes nestes subprodutos são constituídas principalmente por celulose, hemicelulose e lignina. Os mecanismos enzimáticos envolvidos na degradação destes materiais, resultando na conversão da biomassa em produtos de alto valor agregado, são bastante complexos, necessitando da participação de enzimas lignocelulolíticas produzidas, sobretudo por fungos. Este estudo visou à caracterização enzimática lignocelulósica e a liberação de açúcares redutores por fungos ligninolíticos e celulolíticos, expostos a duas concentrações de nitrogênio e o comportamento destes organismos perante situação de estresse nutricional. Os fungos utilizados foram Pleurotus sajor caju, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei e Aspergillus niger, selecionados em trabalhos anteriores. Estes organismos foram inoculados em frascos Erlenmeyers, contendo bagaço e palha de cana pré-tratados com H2SO4 (0,5%) e duas concentrações de nitrogênio (0,5% e 1% de extrato de levedura), por 15 dias. Diariamente, foram coletadas amostras e analisadas quanto à concentração de proteínas, atividade específica de Lacase, Peroxidases, Manganês peroxidase, Endoglicanases, atividade celulolítica total, Superóxido dismutase (SOD), Catalase (CAT) e quantificação de açúcares redutores. A enzima SOD foi analisada através de PAGE não desnaturante e o perfil protéico observado em SDS-PAGE. As demais análises foram realizadas em espectrofotômetro. O meio contendo 0,5% de extrato de levedura foi favorável ao crescimento dos fungos P. sajor caju e T. reesei, e o meio com 1% de extrato foi favorável à P. chrysosporium e A. niger. Quanto à produção das enzimas ligninolíticas (µmol.min-1.mg proteína-1), a maior produção de Lacase foi observada em P. sajor caju (2,2; 1%; 13º dia), de Peroxidases também para P. sajor caju (1,5; 1%; 12º dia) e MnP para T. reesei (0,172; 1%; 4º dia). A maior atividade celulolítica total (FPU.mg proteína-1) e de Endoglicanases (CMC.mg proteína-1) foi observada para T. reesei (10,1 e 20,6; 0,5%; 7º dia, respectivamente). Quanto à maior liberação de açúcares redutores, P. chrysosporium (0,757 mgAR.gBS-1; 1%; 9º dia). Foram observadas até quatro isoformas de SOD que variaram entre os fungos, concentrações de nitrogênio e dias. As maiores atividades de CAT (µmol.min-1.mgproteína-1) foram observadas para P. sajor caju (0,811; 5º dia), T. reesei (0,726; 1º dia), P. chrysosporium (0,441; 3º dia) e A. niger (0,194; 10º dia), todos na concentração de 0,5%. As espécies, as concentrações de nitrogênio e o período de incubação influenciaram no crescimento, nas atividades enzimáticas e na liberação de açúcares redutores dos fungos / It is estimated that Brazil will produce in 2010 about 160 million tons of sugarcane bagasse and straw. The bagasse is a byproduct resulting from the crushing of sugarcane, consisting of fibers, particles of dirt and waste broth. The straw is the material found on the surface of the remaining crop, after harvest, consisting of fractions of leaves, pointers, stems and roots. These products are used as an energy source within their own mills and distilleries. However, with the global interest focused on the use of other energy sources instead of petroleum, the importance of using these substrates in ethanol production increased. The fibers in these products are composed primarily of cellulose, hemicellulose and lignin. The mechanisms involved in enzymatic degradation of these materials, resulting in conversion of biomass into high value added products, are quite complex, requiring the participation of lignocellulolytic enzymes produced mainly by fungi. This study aimed to a lignocellulosic enzymatic characterization and the release of reducing sugars by ligninolytic and cellulolytic fungi exposed to two concentrations of nitrogen and the behavior of these organisms against a nutritional stress situation. The fungi used were Pleurotus sajor caju, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei and Aspergillus niger, selected from previous work. These organisms were inoculated in Erlenmeyer flasks containing sugarcane bagasse and straw pretreated with H2SO4 (0.5%) and two concentrations of nitrogen (0.5% and 1% yeast extract) for 15 days. Daily samples were collected and analyzed for proteins concentration, specific activity of Laccase, Peroxidases, Manganese Peroxidase, Endoglucanases, total cellulolytic activity, Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and quantification of total sugar. The enzyme SOD was analyzed by native PAGE gels and the protein profile observed in SDS-PAGE. Other analyses were performed on a spectrophotometer. The medium containing 0.5% yeast extract was favorable to the growth of fungi P. sajor caju and T. reesei and the medium with 1% extract favored P. chrysosporium and A. niger. Regarding the production of lignilolytic enzymes (mol.min-1.mg protein-1), the highest activity of Laccase was found in P. sajor caju (2.2, 1%, 13 days), for Peroxidases also in P. sajor caju (1.5, 1%, day 12) and MnP in T. reesei (0.172, 1%, day 4). The highest total cellulolytic activity (FPU.mg protein-1) and Endoglucanases (CMC.mg protein-1) was observed for T. reesei (10.1 and 20.6, 0.5%, day 7, respectively). As for the highest release of total sugars, P. chrysosporium (0.757 mgAR.gBS-1, 1%, 9 day). It was observed up to four SOD isoforms that varied from fungi, nitrogen concentrations and days. The highest CAT activities (mol.min-1.mg protein-1) were observed for P. sajor caju (0.811, 5 days), T. reesei (0.726, day 1), P. chrysosporium (0.441, day 3) and A. niger (0.194, 10 days), all at 0.5% concentration. The species, nitrogen concentrations and the period of incubation influenced the growth, the enzymatic activity and the release of total sugars in the fungi

O fungo filamentoso Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) é o principal produtor de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas utilizadas para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa lignocelulósica. Para que o custo de produção de etanol de segunda geração (2G), em escala industrial, seja competitivo, uma mistura eficiente de enzimas hidrolíticas é necessária para degradar a biomassa vegetal em açúcares fermentescíveis. Dada a crescente demanda pelo desenvolvimento de processos que reduzam os custos de enzimas de interesse biotecnológico, o presente trabalho se propôs a analisar o perfil global do transcriptoma de T. reesei em presença de celulose, soforose e glicose como fontes de carbono, a fim de prover um melhor entendimento de como essas enzimas são produzidas por esse microrganismo. Para isso, foi utilizada a abordagem RNA-seq e duas linhagens de T. reesei: QM9414 (parental) e xyr1 (mutante). No Capítulo I, foram anlisados 22 genes que codificam celulases e xilanases, com o intuito de verificar a regulação da expressão gênica pelo fator de transcrição XYR1 em diferentes fontes de carbono. Foi observada uma dependência da fonte de carbono e redução da expressão destes genes que codificam celulases e xilanases quando se comparou a linhagem mutante com a parental, cultivados na presença de celulose e soforose. Na presença de glicose, a maior parte dos genes analisados apresentou aumento de expressão no mutante xyr1. Por meio de análises in silico foi identificado o elemento regulatório cis para o fator de transcrição XYR1 usando quatro conjuntos de dados de genes dependente-condição envolvendo os experimentos RNA-seq e qPCR-TR. Foram identificados dois motivos com o consenso de ligação proposto para o regulador XYR1 (nomeado PWMXYR1). Ao usar esses motivos identificados, foi analisada a presença e disposição dos putativos elementos regulatórios cis nesses conjuntos de dados, sendo que sítios com intervalos curtos foram mais associados a promotores dependentes de XYR1 do que sítios simples. Além disso, a abordagem utilizada permitiu a identificação de sítios de ligação XYR1, na região promotora dos genes cel7a e xyn1 e mapear a potencial sequência alvo do regulador na região promotora do gene cel6a. Adicionalmente, sete outros promotores (genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 e swo) apresentaram sítios de ligação putativos de XYR1. Usando a arquitetura do regulador PWMXYR1, foram identificados potenciais genes alvos de regulação direta por XYR1 no genoma de T. reesei. O mapeamento do referido sítio foi realizado, também, nos genes diferencialmente expressos na linhagem mutante xyr1, destacando que a regulação indireta desempenha um papel fundamental nas vias de sinalização. Estes resultados fornecem novas informações sobre os mecanismos de sinalização mediados por XYR1 na regulação de promotores de celulases. No Capítulo II, foi analisado o transcriptoma global da linhagem parental (QM9414) em diferentes fontes de carbono: celulose; soforose e glicose. Aplicando limites rigorosos de corte, 2060 genes foram identificados como diferencialmente expressos em pelo menos uma das fontes de carbono analisadas. Clusterização hierárquica desses genes diferencialmente expressos identificaram-se três possíveis regulons, representando 123 genes controlados por celulose, 154 genes controlados por soforose e 402 genes controlados por glicose. A análise da rede regulatória demonstrou a inter-relação existente entre as condições, permitindo a identicação de 75 genes específicos do crescimento em soforose e 107 de celulose. Esses resultados revelaram novos genes envolvidos na degradação da celulose, tais como: proteínas acessórias, transportadores, fatores de transcrição e CAZymes que respondem especificamente a presença de celulose ou soforose. No Capítulo III, analisou-se o perfil transcricional da linhagem mutante xyr1 comparando com a linhagem parental (QM9414), na presença das três fontes de carbono. As análises de expressão gênica revelaram que 2185 genes foram diferencialmente expressos na condição celulose, 2124 genes na condição soforose e 46 genes em glicose. Esses genes foram utilizados para analisar a inter-relação existente entre as condições, com destaque para grande número de genes exclusivos nas condições de indução (celulose e soforose). Por meio da clusterização hierárquica foram identificados 6 possíveis regulons, sendo 3 deles compostos por genes up-regulados e 3 regulons por genes down-regulados. Na ausência do regulador XYR1, a expressão de genes CAZys, fatores de transcrição, transportadores, entre outros, foram afetadas de modo dependente da fonte de carbono. Essas análises permitiram verificar que o fator de transcrição XYR1 é fundamental no processo de indução de enzimas de interesse biotecnológico, além de participar de outros processos bioquímicos/moleculares. Desse modo, todos os resultados obtidos fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão gênica durante a adaptação de T. reesei frente a diferentes condições ambientais como: diferentes fontes de carbono e necessidades nutricionais. Contribuindo, assim, para uma melhor caracterização desse fungo filamentoso em relação à produção de enzimas e o desenvolvimento de mutantes metabólicos para utilização industrial. / The filamentous fungus Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) is a major producer of cellulolytic enzymes used for biofuels production from lignocellulosic biomass. In order to achieve a low cost second generation ethanol production in industrial scale, an efficient mix of hydrolytic enzymes are required for the degradation of plant biomass into fermentable sugars. Given the growing demand for development of processes in order to reduce the cost of enzymes production, the present work proposes a large-scale transcriptomic analysis of T. reesei in presence of cellulose, sophorose, and glucose as carbon sources, in order to provide insights about the mechanisms of enzymes production by this microorganism. For this purpose, RNA-seq approach was employed, as well, as two T. reesei strains: QM9414 (parental) and xyr1 (mutant). In Chapter I, 22 genes encoding cellulases and xylanases were analyzed regarding the regulation through the transcription factor XYR1. This regulation seems to occur in a carbon source dependence manner, and the expression of cellulases and xylanases was diminished in the mutant strain compared to the parental strain in the presence of cellulose and sophorose. In glucose, most of the analyzed genes showed higher expression in the mutant compared to the parental strain. In silico analysis identified a cis regulatory element for XYR1 using four datasets of condition-dependent genes based on RNA-seq and qPCR experiments. Two binding motifs have been identified with the proposed consensus for the XYR1 (named PWMXYR1). Using these motifs, the presence and arrangement of putative cis regulatory elements was analyzed, and the results indicate that the sites with short intervals were stronger associated with XYR1 dependent promoters than single sites, even with high scores. Moreover, this approach allowed the identification of XYR1 binding sites in the promoter region of cel7a and xyn1, as well as, map the potential target sequence in the promoter of cel6a gene. In addition, seven other promoters from genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 and swo presented XYR1 putative binding sites. Using the cis-regulatory architecture of PWMXYR1, potential targets for direct regulation by XYR1were identified in a genome wide manner. The putative binding sites were also mapped in the differentially expressed genes identified in the mutant strain xyr1, suggesting that indirect regulation plays a key role in signaling pathways. Taken together, the data provided here provides important information regarding signaling mechanisms mediated by XYR1 in the regulation of cellulases promoters. In Chapter II, the transcriptome of the parental strain (QM9414) was analyzed in three carbon sources, cellulose, sophorose and glucose. By applying a stringent cut-off threshold, 2,060 genes were identified as differentially expressed in at least one of the carbon sources analyzed. Hierarchical clustering of differentially expressed genes identified three possible regulons, representing 123 genes controlled by cellulose, 154 genes controlled by sophorose and 402 genes controlled by glucose. The analysis of the regulatory network demonstrated the interrelation between the conditions, allowing the identification of 75 genes specifically expressed in soforose and 107 in cellulose. These results revealed new players involved in cellulose degradation, such as accessory proteins, transporters, transcription factors and CAZymes, that specifically respond to the presence of either cellulose or sophorose. In Chapter III, a genome wide comparative transcriptional analysis were performed between the mutant xyr1 strain and the parental strain (QM9414) using the three carbon sources. Gene expression analysis revealed 2,185 genes differentially expressed in cellulose, 2124 genes in sophorose and 46 genes in glucose. These differentially expressed genes were used to analyze the relationship between the conditions, revealing a greater number of exclusive genes in theinducing conditions (cellulose and sophorose). The hierarchical clustering analysis revealed 6 possible regulons, being three composed by up-regulated genes and 3 regulons composed by down-regulated genes. In the absence of the regulator XYR1, the expression of CAZy genes, transcription factors among other genes were affected in a carbon-dependent manner. These analyses showed that the transcription factor XYR1 has an essential role in induction of enzymes of biotechnological interest and participates in other biochemical/molecular processes. Taken together these results provide important information about the molecular events, involved in gene expression regulation during T. reesei adaptation to different environments such as: carbon sources and/or nutritional needs, thus contributing to a better understanding of this filamentous fungus regarding the the production of enzymes and the development of mutants for industrial applications.

Orientadores: Gustavo Henrique Goldman, Juliana Velasco de Castro Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T05:49:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borin_GustavoPagotto_M.pdf: 4025117 bytes, checksum: 5d652481786ac0f6cf4259069d181514 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A parede celular vegetal é uma estrutura recalcitrante, composta por polissacarídeos complexos que podem ser quebrados em açúcares fermentáveis. A desconstrução desse material complexo pode ser feita por diversos tipos de enzimas hidrolíticas, que são produzidas naturalmente por uma variedade de microrganismos. Entre eles, o fungo Trichoderma reesei se destaca pela capacidade de produzir e secretar estas enzimas em grandes quantidades. Embora alguns trabalhos utilizando abordagens de proteômica e transcriptômica já tenham sido realizados com esse fungo, ainda não são conhecidos em detalhes os mecanismos moleculares responsáveis pela degradação da parede e a regulação gênica envolvida nesse sistema lignocelulolítico. O presente trabalho tem como objetivo principal a análise da expressão gênica global de T. reesei, crescido por 6, 12 e 24 horas em bagaço e colmo de cana-de-açúcar como fontes únicas de carbono, pela técnica de sequenciamento high-throughput de RNA (RNA-Seq). No transcriptoma de T. reesei foram identificadas sendo hiper-expressas as principais celulases, hemicelulases e proteínas acessórias relacionadas direta ou indiretamente com a desconstrução da parede vegetal. De modo geral, as celulases e hemicelulases apresentaram uma expressão maior do que outras enzimas, e o nível dos seus transcritos foi crescente ao longo do tempo tanto em colmo quanto no bagaço. A grande maioria dos genes de CAZymes e proteínas acessórias hiper-expressos foram compartilhados pelos dois substratos, o que demonstra que a estratégia usada por T. reesei para degradar a parede celular do colmo e do bagaço é similar. Adicionalmente, vários fatores de transcrição, proteínas de função desconhecida e transportadores supostamente envolvidos na assimilação dos açúcares liberados também foram hiper-expressos nas condições amostradas. Para validação do RNA-Seq, foi realizado PCR em tempo real de diversos genes hiper-expressos que codificam para enzimas hidrolíticas, reguladores transcricionais, proteínas acessórias e genes ainda não caracterizados. Para isso, a análise temporal foi ampliada para 30 minutos, 2, 4, 6, 12 e 24 horas de crescimento após o inóculo, o que permitiu uma análise mais detalhada da expressão desses genes. Como objetivo secundário, foi analisado o secretoma deste fungo e os açúcares concomitantemente liberados no sobrenadante. Estas análises indicaram que a desconstrução da parede celular já se inicia dentro de 6 horas pós inoculo, com a liberação de monômeros (principalmente xilose e glicose) dos polissacarídeos e secreção de diversas CAZymes. Ensaios enzimáticos também foram realizados, mostrando atividades celulo e hemicelulolíticas. Assim, descrevemos pela primeira vez o arsenal de enzimas transcritas e secretadas por T. reesei RUT C30, desde pontos inicias de crescimento, em bagaço explodido e colmo de cana-de-açúcar. Por fim, este trabalho também permitiu a identificação de vários genes, com função predita ou não, que podem abrir caminho para a descoberta de novos atuantes na resposta do fungo ao substrato lignocelulósico / Abstract: Plant cell wall is a recalcitrant structure composed of complex polysaccharides which can be broken down into fermentable sugars. The deconstruction of this complex material can be made by a variety of hydrolytic enzymes which are naturally produced by a variety of microorganisms. Among them, stands out the fungus Trichoderma reesei, able to produce and secrete those enzymes in large quantities. Although some studies using transcriptomics and proteomics approaches have been performed with this fungus, the molecular mechanisms responsible for the degradation of the cell wall and gene regulation involved in this lignocellulosic system are not well known. This work has as main objective the analysis of global gene expression of T. reesei grown at 6, 12 and 24 hours in sugarcane bagasse and culm as sole carbon sources by high-throughput RNA sequencing technology (RNA-Seq). In the T. reesei transcriptome, it was identified the major cellulases, hemicellulases and accessory proteins directly or indirectly related to the deconstruction of plant cell wall. In general, cellulases and hemicellulases exhibited higher expression than other enzymes, and the level of their transcripts was increased over the time in both culm and bagasse cultures. Most of up-regulated CAZymes and accessory proteins were shared between the two substrates, which demonstrates the strategy used by T. reesei to degrade the bagasse and culm cell wall is similar. Furthermore, several transcription factors, proteins of unknown function and transporters supposedly involved in the assimilation of sugars were also up-regulated in the sampled conditions. To validate the RNA-Seq data, real-time PCR of several up-regulated genes encoding hydrolytic enzymes, transcriptional regulators, accessory proteins and proteins not yet characterized was carried out. The time points was extended to 30 min, 2, 4, 6, 12 and 24 hours of growth after inoculation, allowing a more detailed analysis of the expression of these genes. As a secondary objective, T. reesei secretome and the sugars released in the supernatant were analyzed. It was shown that the sugarcane cell wall deconstruction begins within the first 6 hours post inoculation, releasing sugar monomers (mainly xylose and glucose) from polysaccharides due to the secretion of several hydrolytic enzymes. Enzymatic assays were also performed, showing cellulosic and hemicellulosic activities. Finally, this is the first study showing the arsenal of enzymes transcribed and secreted by T. reesei grown on steam exploded sugarcane bagasse and culm, at early time points. It was possible identify several genes, with predicted function or not, that can open new paths to discover novel players on the fungus response to lignocellulosic substrate / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular