京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20228号 / 医博第4187号 / 新制||医||1019(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 小池 薫, 教授 福原 俊一, 教授 湊谷 謙司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Objective: The aim was to determine if isolated rabbit cardiomyocytes could be preconditioned. Methods: Cardiomyocytes isolated from rabbit hearts were subjected to 15 min oxygenated preincubation, with and without substrate, prior to concentration into an ischaemic slurry, with or without glucose present. The effects of an adenosine agonist (CCPA), an adenosine receptor blocker (SPT), and the protein kinase C blocker, calphostin C, on rates of ischaemic contracture and survival of the myocytes were determined after various times of ischaemia, following resuspension of the cells in hypotonic media. Results: A glucose-free preincubation period protected myocytes from subsequent ischaemic injury, with a 40% reduction of cell death at 90-120 min and 1-2 h delay in cell death. CCPA added during preincubation and during the ischaemic period also tended to protect from injury, but the differences were not significant and protection was less than with a glucose-free preincubation. Although preincubation with CCPA did not precondition, SPT added to the preincubation medium only, or to both the preincubation medium and the ischaemic pellet, inhibited the preconditioning effect of a glucose-free preincubation period. Calphostin C, added only into the ischaemic pellet, inhibited the preconditioning effect of glucose-free preincubation. Conclusions: Glucose-free preincubation protects ischaemic isolated myocytes from subsequent ischaemia. The degree of protection is great enough to account for protection seen in intact hearts, following preconditioning protocols. Protection is blocked by SPT and a highly specific protein kinase C inhibitor, calphostin C. Protection from ischaemic injury that seems to mimic ischaemic preconditioning can be induced in isolated cardiomyocytes, and appears dependent on adenosine receptors and activation of protein kinase C.Cardiovascular Research 1994;28:72-77.

Cardiovascular disease is a leading cause of death in the United States. Toll-like receptor (TLR)-mediated pathways have been demonstrated to play a role in myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury. We and others have shown that PI3K/Akt signaling is involved in regulating cellular survival and protecting the myocardium from I/R induced injury. In this dissertation, we provide compelling evidence that miR-125b serves to “fine tune” TLR mediated NF-kB responses by repressing TNF-a and TRAF6 expression. We constructed lentiviral expressing miR-125b, delivered it into the myocardium. The data showed that delivery of lentivirus expressing miR-125b significantly reduces myocardial infarct size and improves cardiac function in I/R hearts. Mechanistic studies demonstrated that miR-125b negatively regulates TLR mediated NF-kB activation pathway by repressing TNF-a and TRAF6 expression in the myocardium. We also observed that transfection of the myocardium with lentivirus expressing miR-214 markedly attenuates I/R induced myocardial infarct size and cardiac dysfunction. We demonstrated that miR-214 activates PI3K/Akt signaling by targeting PTEN expression in the myocardium. We also investigated the role of TLR3 in neonatal heart repair and regeneration following myocardial infarction (MI). Wild type (WT) neonatal mice showed fully cardiac functional recovery and small infarct size, while TLR3 deficient mice exhibited impaired cardiac functional recovery and large infarct area after MI. Poly (I:C), a TLR3 ligand, administration significantly enhances glycolysis, YAP1 activation and the proliferation of WT neonatal cardiomyocytes. 2-deoxyglucose (2-DG), a glycolysis inhibitor treatment abolished cardiac functional recovery and YAP1 activation in neonatal mice after MI. In vitro either inhibition of glycolysis by 2-DG or inhibition of YAP1 activation prevents Poly (I:C) induced YAP1 activation and neonatal cardiomyocyte proliferation. Importantly, YAP1 activation increases miR-152 expression, leading to cardiomyocyte proliferation through suppression P27kip1 and DNMT1 expression. We conclude that microRNAs play an important role in TLR modulation induced protection against myocardial I/R injury by increasing the activation of PI3K/Akt signaling pathway, decreasing TLR/NF-kB mediated inflammatory response, and suppressing activation of apoptotic signaling following myocardial I/R injury. In addition, TLR3 is an essential for neonatal heart repair and regeneration after myocardial infarction. TLR3 modulation could be a novel strategy for heart regeneration and repair.

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Background: Despite recent advances and refinements in perioperative management of kidney transplantation (KT), early renal graft injury (eRGI) remains a critical problem with serious impairment of graft function as well as short- and long-term outcome. Serial monitoring of peripheral blood innate immune cells might be a useful tool in predicting post-transplant eRGI and graft outcome after KT. Methods: In this prospective study, medical data of 50 consecutive patients undergoing KT at the University Hospital of Leipzig were analyzed starting at the day of KT until day 10 after the transplantation. The main outcome parameter was the occurrence of eRGI and other outcome parameters associated with graft function/outcome. eRGI was defined as graft-related complications and clinical signs of renal IRI (ischemia reperfusion injury), such as acute tubular necrosis (ATN), delayed graft function (DGF), initial nonfunction (INF) and graft rejection within 3 months following KT. Typical innate immune cells including neutrophils, natural killer (NK) cells, monocytes, basophils and dendritic cells (myeloid, plasmacytoid) were measured in all patients in peripheral blood at day 0, 1, 3, 7 and 10 after the transplantation. Receiver operating characteristics (ROC) curves were performed to assess their predictive value for eRGI. Cutoff levels were calculated with the Youden index. Significant diagnostic immunological cutoffs and other prognostic clinical factors were tested in a multivariate logistic regression model. Results: Of the 50 included patients, 23 patients developed eRGI. Mean levels of neutrophils and monocytes were significantly higher on most days in the eRGI group compared to the non-eRGI group after transplantation, whereas a significant decrease in NK cell count, basophil levels and DC counts could be found between baseline and postoperative course. ROC analysis indicated that monocytes levels on POD 7 (AUC: 0.91) and NK cell levels on POD 7 (AUC: 0.92) were highly predictive for eRGI after KT. Multivariable analysis identified recipient age (OR 1.53 (95% CI: 1.003–2.350), p = 0.040), recipient body mass index > 25 kg/m2 (OR 5.6 (95% CI: 1.36–23.9), p = 0.015), recipient cardiovascular disease (OR 8.17 (95% CI: 1.28–52.16), p = 0.026), donor age (OR 1.068 (95% CI: 1.011–1.128), p = 0.027), <0.010), deceased-donor transplantation (OR 2.18 (95% CI: 1.091–4.112), p = 0.027) and cold ischemia time (CIT) of the renal graft (OR 1.005 (95% CI: 1.001–1.01), p = 0.019) as clinically relevant prognostic factors associated with increased eRGI following KT. Further, neutrophils > 9.4 × 103/μL on POD 7 (OR 16.1 (95% CI: 1.31–195.6), p = 0.031), monocytes > 1150 cells/ul on POD 7 (OR 7.81 (95% CI: 1.97–63.18), p = 0.048), NK cells < 125 cells/μL on POD 3 (OR 6.97 (95% CI: 3.81–12.7), p < 0.01), basophils < 18.1 cells/μL on POD 10 (OR 3.45 (95% CI: 1.37–12.3), p = 0.02) and mDC < 4.7 cells/μL on POD 7 (OR 11.68 (95% CI: 1.85–73.4), p < 0.01) were revealed as independent biochemical predictive variables for eRGI after KT. Conclusions: We show that the combined measurement of immunological innate variables (NK cells and monocytes on POD 7) and specific clinical factors such as prolonged CIT, increased donor and recipient age and morbidity together with deceased-donor transplantation were significant and specific predictors of eRGI following KT. We suggest that intensified monitoring of these parameters might be a helpful clinical tool in identifying patients at a higher risk of postoperative complication after KT and may therefore help to detect and—by diligent clinical management—even prevent deteriorated outcome due to IRI and eRGI after KT.

Die Niere ist ein lebenswichtiges Organ, das für die Homöostase des Körpers unentbehrlich ist. Bei einem Funktionsverlust, entweder kongenital oder durch ein akutes oder chronisches Nierenversagen, muss die Funktion ersetzt werden. Für die Nierenersatztherapie gibt es als Ersatzverfahren die Dialyse und die Nierentransplantation. Da eine Dialyse nicht alle Funktionen der Niere ersetzen kann sowie eine hohe Belastung für den Patienten darstellt, ist die Nierentransplantation der Goldstandard im Organersatz. Das vorhandene Angebot an Spenderorganen kann den aktuellen Bedarf allerdings nicht decken, sodass die aktuelle durchschnittliche Wartezeit auf ein postmortal gespendetes Organ in Deutschland derzeit bei etwa sieben bis zehn Jahren liegt. Erschwerend kommt hinzu, dass die verfügbaren Organe häufig von älteren Spendern mit Komorbiditäten stammen. Diese Nieren haben oft eine unklare Funktionsfähigkeit. Aus diesem Grund werden diese Nieren nicht immer für eine Transplantation angenommen oder gar nicht erst entnommen. Eine Methode, den verfügbaren Spenderpool zu vergrößern, ist daher, diese Nieren so gut als möglich nutzbar zu machen. Dafür müssen die Nieren vor der Transplantation medizinisch bewertet werden. Die Maschinenperfusion (MP) ist eine Methode der dynamischen Konservierung und Konditionierung von Organen. Die Vorteile einer Lagerung mittels hypothermer MP für die Niere sind bereits bekannt. Bei der normothermen MP wird die Niere mit einer oxygenierten, temperierten Perfusionslösung durchströmt. So wird der Metabolismus der Zellen aufrechterhalten und die Ischämiezeit verkürzt. Damit bietet die normotherme MP eine Plattform, um Nieren unter reperfusionsähnlichen Bedingungen zu observieren. Für diese Arbeit wurden die Nieren aus Schlachthofschweinen gewonnen und autologes Vollblut als Perfusionslösung verwendet. Die Perfusion erfolgte mittels einer eigens dafür vom Kooperationspartner (Institut für Biomedizinische Technik) konzipierten Perfusionsmaschine. Es konnte gezeigt werden, dass die Nieren damit stabil für 4 h mit Vollblut perfundiert werden können. Die Level verschiedener Biomarker wurden im Gewebe (Biopsien nach 0 und 4 h Perfusion), Urin (1 h-Sammelurin nach 1, 2 und 4 h Perfusion) und Plasma (nach 0, 1, 2 und 4 h) analysiert. Die Nieren wurden anhand verschiedener Kriterien in jeweils zwei Gruppen (gut und schlecht) eingeteilt. So erfolgte eine direkte Bewertung der Makroskopie nach der Perfusion durch einen anwesenden Arzt. Während diese direkte Bewertung der Situation dem klinischen Alltag ähnelt, ist diese jedoch subjektiver Art. Um diese Subjektivität zu relativieren, wurden die Nieren weiterhin durch mehrere Gutachter nach einem Makroskopischen Score eingeteilt. Dabei zeigte sich teilweise eine große Varianz zwischen den Gutachtern. Neben der Makroskopie wurden die Nieren auch nach ihrer Histologie bewertet. Hierfür wurden diese über den Remuzzi-Score klassifiziert. Dabei zeigte sich, dass die Nieren zum größten Teil sehr gut bewertet wurden und nur wenige Schäden aufzeigten. Da die Tubuli besonders schnell unter Ischämie geschädigt werden, wurden die Nieren insbesondere nach der Tubulus-Atrophie histologisch bewertet. Hierbei konnten häufiger und schneller Schäden an den Nieren beobachtet werden. Auch die Information über die Filtrationsleistung der Niere stellt einen wesentlichen Wissensgewinn dar, ist jedoch nur aufwändig bestimmbar. Mittels Inulin-Clearance-Bestimmung während der MP wurden die Nieren anhand dieser in eingeschränkt und nicht funktionsfähig eingeteilt. Auffällig dabei war, dass die einzelnen Klassifikationen nur eine vergleichsweise geringe Übereinstimmung hatten. Insbesondere die als Inulin-Clearance gemessene Funktionsfähigkeit korrelierte in keiner Weise mit der Makroskopie oder der Histologie. Im Gewebe wurden die Level der Biomarker für oxidativen Stress, 8-OHdG, und für Schäden des Epithels des proximalen Tubulus, KIM-1, mittels IHC untersucht. Der Ischämie-Reperfusionsschaden spiegelte sich hierbei in der Zunahme der Intensität der 8-OHdG-Färbung wider. Es zeigten sich jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den guten und schlechten Nieren. Die immunohistochemische KIM-1-Färbung nahm in histologisch guten Nieren häufiger ab als in histologisch schlechten Nieren. In den anderen Klassifizierungen zeigten sich keine Unterschiede. Aus dem Gewebe wurde die mRNA isoliert und die Expressionslevel mehrerer Biomarker vor und nach der Perfusion analysiert. Die Kim-1-mRNA war nicht nachweisbar. Die mRNA-Level der Marker EDN-1, TLR 4 und IL-6 nahmen im Verlauf der Zeit zu. Bei den meisten Klassifikationen zeigten sich keine Unterschiede zwischen den jeweiligen Gruppen. Einzig in den Nieren, welche nach dem Remuzzi-Score eingeteilt wurden, waren die NGAL-mRNA-Level in den schlechten Nieren signifikant höher als in den guten. Dieser Unterschied trat jedoch nur bei der 0 h-Probe auf, am Ende der Perfusion war er nicht mehr zu beobachten. Im Urin wurden die Level von IL-6, KIM-1, NAG und NGAL bestimmt. Die Level der vier Biomarker nahmen im Verlauf der Zeit zu. Die jeweiligen Gruppen der verschiedenen Klassifizierungen unterschieden sich in den Urinsammelproben nicht anhand der IL-6-, NAG- und KIM-1-Level. Einzig in den guten und schlechten Nieren nach dem Makroskopischem Score waren die NGAL-Level signifikant unterschiedlich. Dieser Unterschied war nur im Sammelurin der 1 h-Probe nachzuweisen. Die gleichen Biomarker wurden ebenfalls im Plasma untersucht. Auch hier kam es zu einem Anstieg der Level aller Marker im Verlauf der Perfusion. KIM-1 unterschied sich in keiner Klassifikation in den jeweiligen guten und schlechten Nieren. NGAL war hingegen nach 1 h in Nieren, die nach dem Makroskopischen Score als schlecht beurteilt wurden, signifikant höher als in Nieren, die nach dem Score als gut eingeteilt wurden. In Nieren, welche von dem anwesenden Arzt als nicht transplantabel bewertet wurden, waren die Level von IL-6 und NAG in der 4 h-Plasmaprobe signifikant höher als in potentiell transplantablen Nieren. Dies weist darauf hin, dass die Plasma-basierten Marker IL-6 und NAG nach 4 h robust makroskopisch schlechte und gute Nieren differenzieren konnten. Dahingegen zeigte sich ein Unterschied in den NGAL-Leveln frühzeitig, aber nicht robust. Es konnte noch kein Marker gefunden werden, der frühzeitig und robust zwischen den jeweils stärker und schwächer geschädigten Nieren unterscheiden konnte. Trotzdem könnten sie nach einer Validierung dafür geeignet sein, in einem experimentellen Setting als Parameter dienen zu können, die die Qualität einer Niere unter NMP bewerten können. Weitere Biomarker, welche prädikativ für die Funktionalität oder Histologie des Organs sind, müssen in zukünftigen Versuchen evaluiert werden.:Inhaltsverzeichnis I Abkürzungen V 1 Einleitung 1 1.1 Die Niere 1 1.1.1 Aufgaben und Funktion der Niere 1 1.1.2 Das Nephron 1 1.2 Ausfall der Nierenfunktion 3 1.2.1 Akutes Nierenversagen 3 1.2.2 Chronische Niereninsuffizienz 4 1.3 Nierenersatztherapie 5 1.3.1 Die Dialyse 5 1.3.2 Leben unter Dialyse 5 1.4 Die Nierentransplantation 6 1.4.1 Aktueller Stand der Nierentransplantation in Deutschland 6 1.4.2 Allokation in der Eurotransplant-Region 7 1.4.3 Spendernieren 8 1.4.4 Transplantatfunktion 9 1.5 Ischämie und Reperfusion 11 1.5.1 Warme Ischämiezeit 11 1.5.2 Kalte Ischämiezeit 12 1.5.3 Ischämie-Reperfusionsschaden 12 1.6 Organkonservierung 14 1.6.1 Static cold storage 14 1.6.2 Hypotherme Maschinenperfusion 15 1.6.3 Normotherme Maschinenperfusion 15 1.6.4 Perfusionsgeräte 16 1.6.5 Die Maschinenperfusion als Bewertungstool 18 1.7 Biomarker 19 1.7.1 8-Hydroxyl-Desoxyguanosin 19 1.7.2 Endothelin-1 20 1.7.3 Toll-like receptor-4 20 1.7.4 Interleukin-6 21 1.7.5 Kidney injury molecule 1 22 1.7.6 N-Acetyl-/β-glucosaminidase 22 1.7.7 Neutrophile Gelatinase-assoziiertes Lipocalin 23 2 Zielstellung der Arbeit 24 3 Material 25 3.1 Geräte 25 3.2 Verbrauchsmaterial 26 3.3 Software 27 3.4 Chemikalien und Reagenzien 27 3.5 Kits 28 3.6 Medien, Puffer und Lösungen 29 3.7 qPCR-Assays 30 3.8 Antikörper 31 4 Methoden 32 4.1 Normotherme Maschinenperfusion 32 4.1.1 Nieren- und Vollblutentnahme bei Schlachthof-Tieren 32 4.1.2 Lagerung und Transport 33 4.1.3 Vorbereiten der Nieren 33 4.1.4 Vorbereiten des Perfusionskreislaufes 34 4.1.5 Nierenperfusion 38 4.1.6 Probenentnahme 40 4.2 Histologische Färbungen von Biopsien 42 4.2.1 Einbetten der Biopsien und Anfertigung von Schnitten 42 4.2.2 Hämalaun-Eosin-Färbung 44 4.2.3 Etablierung eines geeigneten IHC-Färbeprotokolls 45 4.2.4 Immunohistochemische Färbungen 46 4.2.5 Mikroskopie 47 4.2.6 Semi-quantitative Auswertung der Färbungen 48 4.3 RNA-Isolation aus Biopsien 48 4.3.1 Gewebeaufschluss der Biopsien 48 4.3.2 RNA-Aufreinigung mittels RNAeasy lipid tissue-Kit 48 4.4 RNA-Konzentrationsbestimmung 50 4.4.1 RNA-Konzentrationsbestimmung über Spektralphotometrie 50 4.4.2 Prüfen der RNA-Qualität mittels automatisierter Elektrophorese 50 4.5 cDNA-Synthese aus RNA mittels Superskript III Reverse Transkriptase 51 4.6 Real Time quantitative PCR 52 4.7 Quantifizierung der Markerkonzentration mittels ELISA 53 4.7.1 Prinzip des ELISA 53 4.7.2 Interleukin-6-ELISA 55 4.7.3 KIM-1-ELISA und NAG-ELISA 55 4.7.4 NGAL-ELISA 56 4.8 Gesamtprotein-Bestimmung mittels BCA-Assay 56 4.9 Bestimmung der Inulin-Clearance 57 4.10 Nierenklassifikation 61 4.10.1 Direkte makroskopische Bewertung 61 4.10.2 Bewertung nach dem Makroskopischen Score 61 4.10.3 Bewertung nach Remuzzi-Score 62 4.10.4 Bewertung nach Tubuli-Atrophie 63 4.10.5 Bewertung nach Funktionalität 64 4.11 Sequenzen und Alignments 64 4.12 Statistik 65 4.12.1 Signifikanzberechnungen 65 4.12.2 Receiver operated characteristic-Kurven 65 5 Ergebnisse 66 5.1 Ergebnisse der Methodenetablierung 66 5.1.1 Immunohistochemie 66 5.1.2 Eine gute RNA-Aufarbeitung kann allein durch Mörsern der Biopsie erreicht werden 71 5.1.3 GAPDH und RPL19 sind als Referenzgene für die qPCR geeignet 73 5.2 Ergebnisse der Klassifikation der Nieren 74 5.2.1 Die Nieren wurden anhand verschiedener Merkmale in fünf Gruppen eingeteilt 74 5.2.2 Die Übereinstimmung zwischen direkter Bewertung, Makroskopischem Score und Remuzzi-Score ist nicht hoch 75 5.2.3 Die Filtrationsleistung ist nicht mit den makroskopischen Bewertungen assoziiert 77 5.3 Analyse der mRNA-Level der potentiellen Biomarker im Gewebe von perfundierten Nieren 79 5.3.1 EDN-1-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 79 5.3.2 TLR-4-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 81 5.3.3 IL-6-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 83 5.3.4 KIM-1-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 85 5.3.5 NGAL-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 85 5.4 Auswertung der histologischen und immunohistochemischen Färbungen 87 5.4.1 Leichte Zunahme des Remuzzi-Scores über die Zeit 87 5.4.2 In histologisch wenig geschädigten Nieren kommt es häufiger zu einer Abnahme der KIM-1-Färbung 88 5.4.3 Der 8-OHdG-Gehalt steigt im Verlauf der Zeit an 88 5.5 Analyse der potentiellen Biomarker im Urin im Verlauf der NMP 89 5.5.1 IL-6-Konzentrationsverlauf im Urin während der NMP 90 5.5.2 KIM-1-Konzentrationsverlauf im Urin während der NMP 91 5.5.3 NAG-Aktivitätsverlauf im Urin während der NMP 93 5.5.4 NGAL-Konzentrationsverlauf im Urin während der NMP 94 5.6 Analyse der potentiellen Biomarker im Plasma im Verlauf der NMP 96 5.6.1 IL-6-Konzentrationsverlauf im Plasma während der NMP 96 5.6.2 KIM-1-Konzentrationsverlauf im Plasma während der NMP 96 5.6.3 NAG-Aktivitätsverlauf im Plasma während der NMP 98 5.6.4 NGAL-Konzentrationsverlauf im Plasma während der NMP 100 5.7 ROC-Analysen der statistisch signifikanten Biomarker 101 6 Diskussion 104 6.1 Evaluation der Methodenetablierung 104 6.1.1 Kritische Betrachtung der Nutzbarkeit der Immunohistochemie 104 6.1.2 Wahl der Methodik für eine maximale RNA-Ausbeute 105 6.2 Das Modell „Schlachthofschwein“ 105 6.3 Setting der Maschinenperfusion im Vergleich zur Literatur 106 6.4 Vergleich der verschiedenen Klassifikationen 107 6.5 Evaluation der Biomarker auf ihre Eignung 108 6.5.1 8-OHdG als Biomarker für oxidative Schäden in der NMP 108 6.5.2 Endothelin-1 als Biomarker für die Endothelaktivierung in der NMP 110 6.5.3 TLR-4 als Biomarker für die Aktivierung der Immunantwort in der NMP 111 6.5.4 IL-6 als Biomarker für die akute Phase in der NMP 112 6.5.5 NAG als Biomarker für Zellschäden in der NMP 114 6.5.6 KIM-1 als Biomarker für Schäden am proximalen Tubulus in der NMP 116 6.5.7 NGAL als Biomarker für Schäden am proximalen Tubulus in der NMP 119 6.6 Kritische Betrachtung der Faktoren, welche die Aussagekraft einschränken können 121 6.7 Andere Parameter zur Vorhersage der Nierenqualität 122 6.8 Aussichten auf einen Bewertungsscore und Zukunft der NMP 122 7 Zusammenfassung 124 8 Summary 127 9 Literatur 129 Danksagung 160 Eigenständigkeitserklärung 161 Erklärung zur Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 162 Anhang 163 10.1 Abbildungsverzeichnis 163 10.2 Tabellenverzeichnis 164

[ES] La lesión por isquemia-reperfusión (I/R) hepática (IRI) es una causa importante de mortalidad y morbilidad en la resección hepática y el trasplante de hígado. Durante la hipoxia, el hígado permanece sin oxígeno, cambiando su metabolismo y parando la síntesis de ATP. Paradójicamente, el restablecimiento del flujo de oxígeno causa más daño, activando el sistema inmunitario que generará una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) causando daño celular y tisular. La ciclooxigenasa-2 (COX-2) es una enzima clave en la biosíntesis de prostaglandinas y su importancia en la IRI es controvertida. La PGE2, prostaglandina E2, es el principal producto de la COX-2, y participa en la mediación de procesos patológicos como la inflamación, la fiebre y el dolor. El uso de AINEs, inhibidores específicos de la COX, apunta a un efecto beneficioso en la resolución del proceso inflamatorio, pero cada vez más estudios apoyan el papel antiinflamatorio de la COX-2. De hecho, estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de COX-2 en hepatocitos protege a los ratones de la apoptosis y el estrés celular, además de reducir la respuesta inflamatoria en diferentes modelos de enfermedad hepática. En esta tesis doctoral, se utilizó un ratón transgénico que sobreexpresa COX-2 en los hepatocitos (h-COX-2 Tg) para dilucidar el papel y la implicación de la COX-2 en la IRI. Los animales de tipo silvestre (Wt) y h-COX-2 Tg fueron sometidos a 90 min de isquemia, seguidos de 4 o 24 h de reperfusión. Comparando los animales h-COX-2 Tg con sus hermanos Wt, el daño celular y tisular se atenúa tras la IRI. Entre las distintas vías modificadas, la cascada inflamatoria está menos activada, con menor liberación de citoquinas pro-inflamatorias, menor reclutamiento hepático, e infiltración de neutrófilos. Las vías de necrosis y apoptosis también se atenúan así como se reduce del estrés del retículo endoplásmico, y aumenta la autofagia. La respuesta antioxidante se potencia en el contexto de la sobreexpresión de COX-2 y la producción total de ROS es menor, lo que contribuye a un menor daño tisular. Cuando los animales Wt se someten un pre-condicionamiento (PC), la COX-2 endógena se induce a niveles más altos que sin PC, mostrando menos daño, una inflamación atenuada, y una respuesta antioxidante mejorada. Además, se muestra que el papel de la COX-2 en esta protección es específico, ya que su inhibición con DFU revierte los efectos observados e iguala el daño causado a los animales Wt. Las mitocondrias son actores centrales en la fisiopatología de la IRI. En este sentido, la función mitocondrial está preservada en los hígados que sobreexpresan COX-2, con un potencial de membrana mitocondrial conservado y una tasa respiratoria preservada. Estos efectos pueden explicarse por una estabilización de las crestas mitocondriales, invaginaciones de la membrana mitocondrial interna (IMM) que se mantienen mediante interacciones de varias isoformas de la proteína OPA1. Su procesamiento está mediado por proteasas, como OMA1. En ratones h-COX-2 Tg hay un menor procesamiento de OPA1, que se correlaciona con una actividad atenuada de OMA1. Por otro lado, se realizó un estudio retrospectivo en pacientes que habían sido sometidos a un trasplante hepático. Se analizaron los niveles de PGE2 y se correlacionaron con las funciones hepáticas tras el trasplante. Este análisis muestra que la presencia de PGE2 en el plasma de los pacientes receptores se correlaciona con un mejor pronóstico, mientras que unos niveles más bajos de PGE2 se asocian con una disfunción precoz del injerto. Todos estos resultados presentan a la COX-2 como un nuevo actor en la protección del hígado tras I/R, mostrando un papel antiinflamatorio y antioxidante, así como reduciendo el daño mitocondrial, el estrés celular y la muerte celular. Además, se demuestra cómo las prostaglandinas derivadas de la COX-2 en condiciones fisiológicas pueden desempeñar un papel protector en casos de trasplante hepático. / [CA] La lesió per isquèmia-reperfusió (I/R) hepàtica (IRI) és una causa important de mortalitat i morbiditat en la resecció hepàtica i el trasplantament de fetge. Durant la hipòxia, el fetge roman sense oxigen, canviant el seu metabolisme i aturant la síntesi d'ATP. Paradoxalment, el restabliment del flux d'oxigen causa més danys, activant el sistema immunitari que genera una gran quantitat d'espècies reactives d'oxigen (ROS) causant dany cel·lular i tissular. La ciclooxigenasa-2 (COX-2) és un enzim clau en la biosíntesi de prostaglandines i la seva importància a l'IRI és controvertida. La PGE2, prostaglandina E2, és el principal producte de la COX-2, i participa en la mediació de processos patològics com la inflamació i la febre. Mentre que l'ús d'AINEs, inhibidors específics de la COX-2, apunta a un efecte beneficiós en la resolució del procés inflamatori, cada cop més estudis donen suport a un paper antiinflamatori de la COX-2. De fet, estudis previs han demostrat que la sobreexpressió de COX-2 en hepatòcits protegeix els ratolins de l'apoptosi i l'estrès cel·lular, a més de reduir la resposta inflamatòria, en diferents models de malaltia hepàtica. En aquesta tesi, s'ha utilitzat un ratolí transgènic que sobreexpressa la COX-2 en els hepatòcits (h-COX-2 Tg) per dilucidar el paper i la implicació de la COX-2 a l'IRI. Els animals de tipus silvestre (Wt) i h-COX-2 Tg van ser sotmesos a 90 min d'isquèmia, seguits de 4 o 24 h de reperfusió. Comparant els animals h-COX-2 Tg amb els seus germans Wt, el dany cel·lular i tissular s'atenua després de l'IRI. Entre les diferents vies modificades, la cascada inflamatòria està menys activada, s'alliberen menys citocines proinflamatòries , hi ha un menor reclutament hepàtic i menor infiltració de neutròfils. Les vies de necrosi i apoptosi també s'atenuen, així com es redueix l'estrès del reticle endoplasmàtic, i l'autofàgia augmenta. La resposta antioxidant es potencia i la producció total de ROS també és menor, fet que contribueix a un menor dany tissular. Quan els animals Wt se sotmeten a un precondicionament (PC), la COX-2 endògena s'indueix a nivells més alts que sense PC, i aquests fetges mostren menys dany, una inflamació atenuada i una resposta antioxidant millorada. A més, es mostra que el paper de la COX-2 en aquesta protecció és específic, ja que la seva inhibició amb DFU, reverteix els efectes observats i iguala el dany causat als animals Wt. Els mitocondris són actors centrals en la fisiopatologia de l'IRI. En aquest sentit, la funció mitocondrial és preservada als fetges que sobreexpressen COX-2, com es pot demostrar per un potencial de membrana mitocondrial conservat i una taxa respiratòria preservada. Aquests efectes es poden explicar per una estabilització de les crestes mitocondrials, invaginacions de la membrana mitocondrial interna (IMM) que es mantenen mitjançant interaccions de diverses isoformes d'OPA1, una proteïna de la IMM. El seu processament està mediat per proteasas, com OMA1. En ratolins h-COX-2 Tg hi ha un menor processament d'OPA1, que es correlaciona amb una activitat atenuada d'OMA1, mostrant una estabilització de les crestes. D'altra banda, es va fer un estudi retrospectiu amb pacients que havien estat sotmesos a un trasplantament hepàtic. Es van analitzar els nivells de PGE2 i es van correlacionar amb les funcions hepàtiques després del trasplantament. Aquesta anàlisi mostra que la presència de PGE2 en el plasma dels pacients receptors es correlaciona amb un millor pronòstic, mentre que uns nivells més baixos de PGE2 s'associen amb una disfunció precoç de l'empelt. Tots aquests resultats presenten a la COX-2 com un nou actor en la protecció del fetge després d'I/R, mostrant un paper antiinflamatori i antioxidant, així com reduint la lesió mitocondrial, l'estrès cel·lular i la mort cel·lular. A més, es demostra com les prostaglandines derivades de la COX-2 en condicions fisiològiques poden exercir un paper protector en casos de trasplantament hepàtic. / [EN] Hepatic ischemia-reperfusion (I/R) injury (IRI) is a major cause of mortality and morbidity in liver resection and liver transplantation. During the hypoxia, the liver remains without oxygen supply, shifting its metabolism and stopping the ATP synthesis. Paradoxically, the restoration of oxygen flow causes the most damage with an activation of the immune system that will generate a burst of reactive species of oxygen (ROS) that will cause cell and tissue damage. Cyclooxygenase-2 (COX-2) is a key enzyme in prostaglandin biosynthesis and its importance in IRI is controversial. PGE2, prostaglandin E2, is the main product of COX-2, and is mainly involved in mediating pathological processes such as inflammation, fever and pain. While the use of NSAIDs, specific COX inhibitors, points to a beneficial effect in the resolution of the inflammatory process, several studies support the idea of an anti-inflammatory role of COX-2. In fact, previous studies have shown that COX-2 overexpression in hepatocytes protects mice from apoptosis and cellular stress, as well as reducing the inflammatory response, in different liver disease models. In this PhD thesis, a hepatocyte-specific COX-2 transgenic mouse (h-COX-2 Tg) was used to elucidate the role and involvement of COX-2 in IRI. Wild type (Wt) and h-COX-2 Tg animals were subjected to 90 min of ischemia, followed by 4 or 24 h of reperfusion. Comparing h-COX-2 Tg animals with their Wt littermates, cellular and tissue damage resulting from IRI is attenuated. Among these pathways, the inflammatory cascade is less activated, with less pro-inflammatory cytokine release, less hepatic recruitment and neutrophil infiltration. Necrosis and apoptosis pathways are also attenuated such as reduced endoplasmic reticulum stress, and increased autophagy. The antioxidant response appears to be enhanced in the context of COX-2 overexpression and total ROS production is also lower, contributing to less tissue damage. When Wt animals are subjected to preconditioning (PC), endogenous COX-2 is induced at higher levels than without PC, and these livers show less damage, attenuated inflammation, and an enhanced antioxidant response. Furthermore, the role of COX-2 in this observed protection has been shown to be specific, as its inhibition with DFU, reverses the observed effects, and matched the damage caused to Wt animals. Mitochondria are central players in the pathophysiology of IRI. In this regard, mitochondrial function is preserved in COX-2-overexpressing livers, as can be demonstrated by a conserved mitochondrial membrane potential and a preserved respiratory rate. These results can be explained by a stabilisation of mitochondrial cristae, invaginations of the inner mitochondrial membrane (IMM) that maintained through interactions of various isoforms of OPA1. Its processing is mediated by proteases, such as OMA1, which acts under certain stimuli. In h-COX-2 Tg mice, there is a reduced OPA1 processing that correlates with attenuated OMA1 activity, showing a stabilisation of cristae in the context of COX-2 overexpression after I/R. On the other hand, a retrospective study was conducted in patients who had undergone liver transplantation. In this part of the study, PGE2 levels were analysed and correlated with liver functions after transplantation. This analysis shows that the presence of PGE2 in the plasma of recipients correlates with a better prognosis, while lower PGE2 levels are associated with early graft dysfunction. All these results present COX-2 as a new player in liver protection after I/R, showing an anti-inflammatory and antioxidant role, as well as reducing mitochondrial damage, cell stress and cell death. Furthermore, it is shown how COX-2-derived prostaglandins under physiological conditions can play a protective role in cases of liver transplant. / This work has been carried out with the financial support of the Spanish Ministry of Science and Innovation (SAF2016-75004R and PID2019-108977RB-100), the CIBERehd (Centro de Investigaciones Biomédicas En Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas) and the COST Action (CA15203 - Mitochondrial mapping: Evolution - Age - Gender - Lifestyle - Environment (MITOEAGLE)). Marina Fuertes Agudo benefited from a pre-doctoral FPI contract (BES-2017- 081928) associated with the SAF2016-75004R project. She spent 3 months in the laboratory of Dr. Pau Sancho Bru at the Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS, Barcelona, Spain) funded by a short stay grant awarded by the CIBERehd and 3 months in the laboratory of Dr. Anne Dubart Kupperschmitt and Dr. Jean Charles Duclos Vallée at the Institut Nationale de la Santé et la Recherche Médicale (INSERM, Villejuif, France) funded by a short stay grant awarded by the European Molecular Biology Organisation (EMBO, SEG_9771). / Fuertes Agudo, M. (2023). Role of Cyclooxygenase-2 in Ischemia-Reperfusion Injury in the Liver [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/196602

Thesis (MScMed)--Stellenbosch University, 2008. / ENGLISH ABSTRACT: It has recently been observed that the application of multiple short cycles of reperfusion and ischaemia, at the onset of reperfusion, elicits cardioprotection against injury due to prior sustained ischaemia. This phenomenon has been termed “postconditioning” (postC) and is of special interest due to its clinical applicability. Although much work has been done to delineate the mechanism of protection, there is still controversy regarding the precise algorithm of postC, the importance of the reperfusion injury salvage kinases (RISK), as well as uncertainty about the possible role of p38 MAPK and the protein phosphatases in postC cardioprotection. The aims of this study were therefore: I. To develop and characterise a cardioprotective postC protocol in the ex vivo rat heart, using both the retrogradely perfused and working heart models. II. To characterise the profiles of PKB/Akt, ERK p42/p44 and p38 MAPK associated with the postC intervention. III. To investigate the possible role of the serine/threonine protein phosphatases type 1 and type 2A (PP1 and PP2A) in the mechanism of postC. Hearts from male Wistar rats were perfused in both the retrograde Langendorff (at a perfusion pressure of 100 cmH2O and diastolic pressure set between 1 and 10 mmHg) and working heart models (preload: 15 cmH20 and afterload: 100 cmH20). Several different postC protocols were tested for their cardioprotective effect, as analysed by infarct size (IFS; determined by triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining) and functional recovery. Experimental parameters tested were the number of cycles (3,4 or 6), the duration of the cycles (10, 15, 20 or 30 seconds), the method of application (regional or global) and temperature during the intervention (36.5 or 37 °C). Different sustained ischaemic insults were also utilised: 35 minutes regional (RI) or 20, 25, 30 and 35 minutes global ischaemia (GI). Hearts treated with a cardioprotective postC intervention or standard reperfusion after sustained ischaemia, were freeze-clamped at 10 and 30 minutes reperfusion in both perfusion models. Tissue samples were then analyzed using Western blotting, probing for total and phosphorylated PKB/Akt, ERK p42/p44 and p38 MAPK. The contribution of PKB/Akt and ERK p42/p44 activation to cardioprotection was also investigated by administration of inhibitors (A6730 and PD098059 respectively) in the final 5 minutes of ischaemia and the first 10 minutes of reperfusion, in the presence and absence of the postC intervention. The effect of these inhibitors were analyzed in terms of IFS and kinase profiles. The possible role of the phosphatases in postC was investigated by observing the effect of cantharidin (a PP1 and PP2A inhibitor) treatment directly before sustained ischaemia (PreCanth) or in reperfusion (PostCanth), in the presence and absence of postC, on IFS and kinase profiles. A postC protocol of 6x10 seconds global reperfusion / ischaemia, at 37°C, was found to give the best and most consistent reduction in infarct size in both the Langendorff (IFS in NonPostC: 47.99±3.31% vs postC: 27.81±2.49%; p<0.0001) and working heart (IFS in NonPostC: 35.81±3.67% vs postC: 17.74±2.73%, p<0.001) models. It could however only improve functional recovery in the Langendorff model (after 30 minutes GI: rate pressure product (RPP) recovery: NonPostC = 12.27±2.63% vs postC = 24.61±2.53%, p<0.05; and after 35 minutes GI: left ventricular developed pressure (LVDP) recovery: NonPostC = 28.40±7.02% vs postC = 48.49±3.14%, p<0.05). This protection was associated with increased PKB/Akt (NonPostC: 0.88±0.26 AU (arbitrary unit) vs postC: 1.65±0.06 AU; p<0.05) and ERK p42 (NonPostC: 2.03±0.2 AU vs postC: 3.13±0.19 AU; p<0.05) phosphorylation. Inhibition of PKB/Akt activation with A6730 (2.5 μM) abrogated the infarct sparing effect of postC. Administration of cantharidin, either before of after ischaemia, in the absence of postC, conferred an infarct sparing effect (IFS in PreCanth: 15.42±1.80%, PostCanth: 21.60±2.79%; p<0.05) associated with an increase in the phosphorylation of MAPK p38 (administration before ischaemia: NonCanth: 1.52±0.26 AU vs PreCanth: 2.49±0.17 AU, p<0.05; and administration after ischaemia: NonCanth: 5.64±1.17 AU vs PostCanth: 10.69±1.29 AU, p<0.05) and ERK p42 (when administered in reperfusion; NonCanth: 2.24±0.21 AU vs PostCanth: 3.34±0.37 AU; p<0.05). Cantharidin treatment combined with the postC intervention did not elicit an additive infarct sparing effect (postC: 17.74±2.72%, PreCanth-postC: 13.30±3.46% and PostCanth-postC: 15.39±2.67%). In conclusion: a postC protocol of 6x10 seconds global ischaemia / reperfusion, at 37°C, confers the best infarct sparing effect in both the Langendorff and working rat heart models. This protection is associated with ERK p42 and PKB/Akt phosphorylation, although only PKB/Akt is necessary for cardioprotection. We could not find evidence for PP1 and PP2A involvement in postC, although inhibition of these phosphatases per se does elicit an infarct sparing effect. The latter observation suggests that phosphatase activation during ischaemia / reperfusion is potentially harmful. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Dit is onlangs waargeneem dat toediening van meervoudige siklusse herperfusie / iskemie, met die aanvang van herperfusie, die hart teen iskemie / herperfusie beskadiging beskerm. Hierdie verskynsel, bekend as postkondisionering (postC), geniet tans baie aandag vanweë die kliniese toepaslikheid van die ingreep. Ten spyte van intensiewe navorsing om die betrokke meganisme van beskerming vas te stel, is daar steeds kontroversie oor die presiese algoritme van die ingreep, asook die betrokkenheid van die sogenaamde iskemie herperfusie oorlewings kinases (RISK). Daar bestaan ook onsekerheid oor die rol van die stres-kinase, p38 MAPK, asook die proteïen fosfatases in die meganisme van beskerming teen iskemiese besering. Hierdie studie het dus drie doelstellings gehad: I. Ontwikkeling van ‘n postC protokol wat beskerming ontlok in die rothart ex vivo, deur gebruik te maak van beide die retrograad geperfuseerde ballon model, asook die werkhart model. II. Analiese van die profiele van die kinases PKB/Akt, ERK p42/p44 en p38 MAPK tydens herperfusie van postC en kontrole (NonPostC) harte. III. Ondersoek na die moontlike rol van die serien / treonien proteïen fosfatases tipe 1 en tipe 2A (PP1 en PP2A) in die meganisme van postC beskerming. Harte van manlike Wistar rotte is geperfuseer in beide die retrograad geperfuseerde ballon (d.i. die Langendorff) model (teen ‘n konstante perfusie druk van 100 cmH20 en ‘n diastoliese druk gestel tussen 1 en 10 mmHg), asook die werkhart model (teen ‘n voorbelading van 15 cmH20 en ‘n nabelading van 100 cmH20). Verskeie moontlike postC protokolle is getoets vir hul vermoë om kardiobeskerming te ontlok, in terme van funksionele herstel en infarktgrootte (IFS), soos bepaal deur trifenieltetrazolium chloried (TTC) kleuring. Die eksperimentele veranderlikes tydens die postC protokol wat ondersoek is, sluit in: die aantal siklusse (3, 4 of 6), die duur van die siklusse (10, 15, 20 of 30 sekondes), die wyse van postC toediening (streeks of globaal) en laastens die temperatuur tydens die ingreep (36.5 of 37 °C). Daar is ook gebruik gemaak van verskillende periodes iskemie: 35 minute streeks iskemie (RI), asook 20, 25, 30 en 35 minute globale iskemie (GI). Na 10 of 30 minute herperfusie is harte wat blootgestel is aan ‘n kardiobeskermende postC ingreep of gewone standaard herperfusie na iskemie, in beide perfusie modelle, gevriesklamp. Die weefsel proteïen-inhoud is verder geanaliseer deur van die Western blot tegniek gebruik te maak vir bepaling van die totale en fosforileerde vlakke van PKB/Akt, ERK p42/p44 en p38 MAPK. Die funksionele belang van PKB/Akt en ERK p42/p44 is verder ondersoek deur die effek van ‘n geskikte inhibitor (onderskeidelik A6730 en PD098059, toegedien tydens die laaste 5 minute van iskemie en die eerste 10 minute van herperfusie), in die teenwoordigheid en afwesigheid van die postC ingreep, op infarktgrootte en kinase aktiwiteit te monitor. Die moontlike rol van proteïen fosfatases in postC is ondersoek deur die effek van cantharidin (‘n PP1 en PP2A inhibitor) op infarktgrootte en kinase profiele te ondersoek. Cantharidin is óf onmiddelik voor iskemie óf tydens herperfusie toegedien, in die aan – en afwesigheid van die postC ingreep. Daar is bevind dat ‘n postC protokol van 6x10 sekondes globale iskemie / herperfusie, teen 37°C, die mees effektiewe en konstante verlaging in infarktgrootte teweeg gebring het in beide die ballon model (IFS in NonPostC: 47.99±3.31% vs postC: 27.81±2.49%; p<0.0001), asook die werkhart (IFS in NonPostC: 35.81±3.67% vs postC: 17.74±2.73%, p<0.001). Funksionele herstel kon egter slegs ontlok word in die ballon model (na 30 minute GI: tempo druk produk (RPP) herstel: NonPostC = 12.27±2.63% vs postC = 24.61±2.53%, p<0.05; en na 35 minute GI: linker ventrikulêre ontwikkelde druk (LVDP) herstel: NonPostC = 28.40±7.02% vs postC = 48.49±3.14%, p<0.05). Die infarkt-besparende effek van postC was geassosieer met ‘n toename in die fosforilasie van beide PKB/Akt (NonPostC: 0.88±0.26 AU (arbitrêre eenhede) vs postC: 1.65±0.06 AU; p<0.05) en ERK p42 (NonPostC: 2.03±0.2 AU vs postC: 3.13±0.19 AU; p<0.05). Inhibisie van PKB/Akt met A6730 (2.5 μM) het die infarkt-besparende effek van postC opgehef. Inhibisie van PP1 en PP2A opsigself, deur toediening van cantharidin óf voor óf na iskemie (in die afwesigheid van postC), het ‘n infarkt-besparende effek ontlok (IFS in PreCanth: 15.42±1.80%, PostCanth: 21.60±2.79%; p<0.05). Hierdie kardiobeskerming was geassosieer met ‘n toename in die fosforilasie van beide p38 MAPK (met toediening voor iskemie: NonCanth: 1.52±0.26 AU vs PreCanth: 2.49±0.17 AU, p<0.05; en toediening na iskemie: NonCanth: 5.64±1.17 AU vs PostCanth: 10.69±1.29 AU, p<0.05), asook ERK p42, indien cantharidin toegedien is tydens herperfusie (NonCanth: 2.24±0.21 AU vs PostCanth: 3.34±0.37 AU; p<0.05). Kombinasie van cantharidin behandeling met postC toediening kon egter nie ‘n kumulatiewe infarkt-besparende effek uitlok nie (postC: 17.74±2.72%, PreCanth-postC: 13.30±3.46% en PostCanth-postC: 15.39±2.67%). In samevatting: ‘n PostC protokol van 6x10 sekondes globale iskemie / herperfusie, teen 37°C, ontlok die mees effektiewe infarkt-besparende effek in beide die ballon, sowel as die werkhart modelle. Alhoewel hierdie beskerming geassosieer is met ‘n toename in die fosforilasie van beide PKB/Akt en ERK p42/p44 tydens herperfusie, is dit slegs PKB/Akt wat van funksionele belang is in die meganisme van kardiobeskerming. Ons kon geen bewyse vind vir die betrokkenheid van PP1 en PP2A in postC beskerming nie, alhoewel inhibisie van hierdie fosfatases opsigself infarkt-besparend is. Laasgenoemde waarneming toon dat fosfatase aktivering tydens iskemie / herperfusie skadelike gevolge mag hê.