No description available.

<p dir="ltr">Papilledema is the swelling of the optic disc resulting from increased cranial pressure. The diagnosis of papilledema is important not only to treat pathologies of the eye, but it also can be an important indicator for underlying brain pathology since the subarachnoid space surrounding the optic nerve is contiguous with the brain. Therefore increased pressure from the brain from pathologies such as hydrocephalus can be transmitted to the posterior eye. To study papilledema, a reproducible post hemorrhagic hydrocephalic rat model was used to study the changes of the retina, optic disc and optic nerve when exposed to high intracranial pressure. Multiple changes were noted in the post hemorrhagic hydrocephalic model including decreased thickness of the ganglion cell complex, decreased retinal thickness in the periphery in females, increased retinal thickness close to the optic nerve in males, increased optic disc width and diameter along with a decrease number of retinal ganglion cells. These findings were similar to findings in human patients with papilledema. Therefore, future studies are indicated using the post hemorrhagic hydrocephalic rat model to further understand the mechanism of papilledema progression and the use of possible therapeutics.</p>

Neurodegenerative Augenerkrankungen wie die diabetische Retinopathie und das Glaukom zählen in der westlichen Welt zu den häufigsten Erblindungsursachen. Unter dem Einfluss hypoxischer/ischämischer Bedingungen oder auch neuro-inflammatorischer Zytokine kommt es zum Untergang von retinalen Ganglienzellen (RGC) und deren Axone sowie von amakrinen Zellen und folglich zum irreversiblen Sehverlust. Die neuronalen Zellen der Netzhaut, insbesondere RGC, gelten aufgrund ihres hohen Bedarfs an Metaboliten gegenüber hypoxischen/ischämischen Episoden als besonders vulnerabel. Retinale Müllerzellen (RMC) sezernieren signifikante Mengen an neuroprotektiven Faktoren, zu denen PEDF, VEGF, IL-6 und BDNF gehören. Es gibt Hinweise, dass RMC das progredient verlaufende Absterben von RGC unter apoptosefördernden Bedingungen zu bremsen vermögen bzw. die axonale Regeneration beschädigter RGC fördern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression neuroprotektiver Mediatoren in RMC und retinalen neuronalen Zellen in Kokulturen sowie vergleichend unter Normoxie und Hypoxie analysiert. Unter diesen Bedingungen wurden auch Überleben und Apoptose neuronaler Zellen untersucht. Mit der Zielstellung, den Stellenwert der PEDF-vermittelten Förderung des Überlebens von RGC zu erkunden, erfolgten Untersuchungen zu PEDF und PEDFRezeptoren, insbesondere zu deren Expressionsregulation in Gegenwart neuroprotektiver Mediatoren sowie normoxischer bzw. hypoxischer Müllerzell-konditionierter Medien (NCM bzw. HCM). In den Zellkultur-Versuchen kam es unter Hypoxie zu einer signifikant gesteigerten Anzahl apoptotischer R28-Zellen. Aus der Gegenwart von RMC in Kokulturen, jedoch nicht durch Zugabe von NCM bzw. HCM, resultierte ein signifikant vermindertes Apoptoseniveau im Vergleich zu homotypischen Kulturen. Die Anwesenheit der RMC führte unter Normoxie zu einer erhöhten Proteinkinase B-/Akt-Aktivität in kokultivierten R28-Zellen. Die neuroprotektiven Effekte der glialen Mediatoren sind somit möglicherweise an modulatorische Aktivitäten gleichzeitig präsenter neuronalen Zellen gebunden. Mögliche gliale Mediatoren sind PEDF, VEGF und IL-6, die die Expression Apoptose-relevanter Gene in R28-Zellen modulierten: Die Expression von proapoptotischen Genen (Bad) zeigte sich nach Stimulation mit PEDF und VEGF, besonders in Kombination mit IL-6 unter Hypoxie, vermindert, diejenige von antiapoptotischen Genen (Bcl-2, Bcl-xL) wurde nach Stimulation mit VEGF und IL-6 hochreguliert. Retinale Neuronen selbst (RGC und R28-Zellen) exprimieren PEDF, VEGF, IL-6 und BDNF, wie auch die PEDF-Rezeptoren PEDF-R undLmR; ein erhöhtes PEDF-, VEGF-, PEDF-R- und LmR-Niveau zeigte sich dabei unter Hypoxie. In RMC war unter Hypoxie die mRNA-Expression der neuroprotektiv wirkenden Mediatoren (PEDF, VEGF, IL-6 und BDNF) und der PEDF-Rezeptoren signifikant gesteigert. Es wurde gemutmaßt, dass die Expression dieser Moleküle weiterhin unter der Kontrolle sezernierter Faktoren retinaler Neuronen steht. In der Tat zeigten RMC, welche in Gegenwart von RGC oder R28-Zellen kultiviert wurden, eine gesteigerte PEDF-, VEGF- und IL-6-Expression. Die hypoxieinduzierte PEDF-Rezeptor-Expression in R28-Zellen erfuhr durch PEDF-, VEGF und IL-6-Stimulation eine Steigerung. Die Kultivierung von RGC in Gegenwart von NCM sowie HCM bedingte eine verminderte LmR-Expression und diejenige in Gegenwart von NCM eine verminderte PEDF-R-Expression. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Hypoxie bzw. die folglich hochregulierten Mediatoren (wie VEGF und IL-6) die Expression dieser Rezeptoren und möglicherweise das Überleben neuronaler Zellen in Gegenwart von RMC beeinflussen. Insgesamt legen die Ergebnisse nahe, dass RMC und retinale neuronale Zellen über sezernierte Mediatoren (PEDF, VEGF, IL-6 und BDNF) interagieren und dass die Expression neuroprotektiver Faktoren in beiden Zellpopulationen einer gegenseitigen bidirektionalen Einflussnahme unterliegt. Um einer therapeutischen Neuroprotektion, die den Verlust von RGC verhindert oder eine Regeneration geschädigter Zellen anstrebt, näher zu kommen, sollten eine Modulation des mediatorgesteuerten Überlebens retinaler neuronaler Zellen und der zugrundeliegenden intrazellulären Signalübertragungswege in Betracht gezogen werden.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Einführung in die Thematik 1.2 Glia- und neuronale Zellen der Retina 1.2.1 Gliale Müllerzellen (RMC) 1.2.2 Retinale Ganglienzellen (RGC) 1.3 Diabetische Retinopathie 1.3.1 Formen und Behandlungsoptionen der diabetischen Retinopathie 1.3.2 Pathogenese und Ätiologie der diabetischen Retinopathie 1.4 Glaukom 1.4.1 Formen und Behandlungsoptionen des Glaukoms 1.4.2 Pathogenese und Ätiologie des Glaukoms 1.5 Neuromodulatorische Faktoren der Retina 1.5.1 Pigment epithelium-derived factor (PEDF) 1.5.2 Vascular endothelial growth factor (VEGF) 1.5.3 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 1.5.4 Interleukin-6 (IL-6) 2. Zielstellung 3. Material und Methoden 3.1 Chemikalien und Lösungen 3.2 Geräte und Verbrauchsmaterial 3.3 Software 3.4 Methoden 3.4.1 Präparation und Kultur von retinalen Ganglienzellen (RGC) 3.4.2 Präparation und Kultur von retinalen Müllerzellen (RMC) 3.4.3 Kultur von R28-Zellen 3.5 Zellkultivierung 3.5.1 Trypsinierung 3.5.2 Zellzahlbestimmung 3.5.3 Kryokonservierung 3.6 Zellkulturansätze mit retinalen Zellen 3.6.1 Zytokinstimulation 3.6.2 Neutralisierende Antikörper 3.6.3 Weitere Additive 3.6.4 Gewinnung konditionierter RMC-Medien und deren Einfluss auf retinale Zellen 3.7 Transfektion von RMC mit siRNA 3.8 Kokultur von RMC mit neuronalen Zellen 3.9 RNA-Isolation 3.10 Reverse Transkription 3.11 Polymerase-Kettenreaktion nach Reverser Transkription (RT-PCR) 3.11.1 Quantitative Real-Time-PCR (qPCR) 3.11.2 Effizienz der qPCR 3.12 Agarose-Gel-Elektrophorese 3.13 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) 3.14 Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA 3.15 Cell Death Detection ELISA 3.16 Proteinbestimmung 3.17 Statistik 4. Ergebnisse 4.1 Einfluss von glialen Mediatoren und Hypoxie auf überlebensrelevante Ereignisse in retinalen neuronalen Zellen 4.1.1 Beeinflussung der Apoptose von R28-Zellen 4.1.2 Beeinflussung der Proteinkinase B-/Akt-Aktivierung in R28-Zellen 4.2 Einfluss glialer Mediatoren auf die Expression von Neuroprotektinen und PEDFRezeptoren in retinalen neuronalen Zellen 4.2.1 Expression und Regulation von Neuroprotektinen in retinalen neuronalen Zellen 4.2.1.1 VEGF-, PEDF- und BDNF-Expression unter Einfluss von glialen Mediatoren und Hypoxie 4.2.1.2 Regulation von VEGF, PEDF und BDNF durch neuroprotektive Faktoren 4.2.2 Expression und Regulation der Rezeptoren PEDF-R und LmR in retinalen neuronalen Zellen 4.2.2.1 Expression von PEDF-R und LmR unter Einfluss von glialen Mediatoren und Hypoxie 4.2.2.2 Untersuchungen zu Mechanismen der hypoxieinduzierten PEDF-R- und LmR Hochregulation unter Normoxie und Hypoxie 4.3 Expression und Regulation von glialen Neuroprotektinen und PEDF-Rezeptoren in Müllerzellen 4.3.1 Regulation der VEGF-, PEDF-, IL-6- und BDNF-Expression in Müllerzellen durch neuronale Faktoren 4.3.1.1 VEGF-, PEDF-, IL-6- und BDNF-Expression in Müllerzellen unter Einfluss der Gesamtheit sezernierter neuronaler Faktoren und Hypoxie 4.3.1.2 PEDF-regulierte VEGF- und BDNF-Expression 4.3.2 Expression und Regulation der Rezeptoren PEDF-R und LmR in Müllerzellen 4.4 Regulation der Expression Apoptose-relevanter Moleküle in R28-Zellen durch neuroprotektive Faktoren 5. Diskussion 6. Zusammenfassung 7. Abbildungsverzeichnis 8. Tabellenverzeichnis 9. Literaturverzeichnis 10. Anlagen 10.1 Selbstständigkeitserklärung 10.2 Curriculum Vitae 10.3 Publikationen 10.4 Danksagung

No description available.

Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de disfunción visual en el mundo desarrollado. En ellas se produce la degeneración y muerte de las neuronas fotorreceptoras, originando una disminución o pérdida total de la visión, en los casos más severos. Las células gliales de Müller (CGM), el principal tipo de células gliales en la retina, y las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) desempeñan un papel clave tanto en la prevención como en el progreso de estas enfermedades. En condiciones fisiológicas las CGM y las células del EPR son las encargadas del mantenimiento estructural, fisiológico y funcional de la retina. Ante alteraciones fisiológicas o frente a daños de diferentes tipos, las CGM y las células del EPR modifican levemente sus funciones a fin de restablecer las condiciones normales o reparar los daños existentes. La proliferación y la migración se activan como parte de una respuesta inespecífica, pero cuando el daño persiste por mecanismos aún desconocidos estos procesos se descontrolan y exacerban, tornándose contraproducentes. A su vez, la localización de estas células en lugares inadecuados distorsiona severamente la estructura y función de la retina, contribuyendo al desarrollo de la disfunción visual, particularmente en las patologías retinoproliferativas. Dilucidar los mecanismos de regulación de la proliferación y la migración, como así también las moléculas que intervienen, es clave para lograr un tratamiento integral de estas enfermedades. Los esfingolípidos bioactivos son moléculas señal que regulan una gran cantidad de procesos biológicos como la supervivencia, proliferación, migración e inflamación. Entre éstos, la ceramida-1-fosfato (C1P) es un esfingolípido que regula numerosas funciones biológicas en diferentes tipos de células. La C1P es generada por la acción de la ceramida quinasa (CerK), enzima encargada de sintetizar C1P a través de la fosforilación de la ceramida (Cer). La actividad de CerK es clave para la señalización celular mediada por C1P y está regulada por niveles bajos de Ca+2, fosforilación y diversos estímulos. La C1P promueve la proliferación través de la activación de diferentes vías de señalización intracelular y la inflamación mediante la unión y activación de la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2), que interviene en la síntesis de prostaglandinas. Para promover la migración, se ha propuesto que la C1P activa un receptor extracelular específico (parcialmente identificado). Trabajos previos de nuestro laboratorio demuestran que la esfingosina-1-fosfato (S1P), un esfingolípido bioactivo muy relacionado a la C1P, promueve la migración de las CGM (Simón et al. 2015). Dada la estrecha interacción metabólica y funcional entre los esfingolípidos, es de gran interés establecer si la C1P, cuyas funciones son semejantes a las de S1P, interviene en la regulación de los procesos que contribuyen a las patologías retinoproliferativas. El objetivo de esta Tesis es investigar si la C1P y la CerK participan en la migración y en la proliferación de las CGM y las células del EPR. Mediante el ensayo de la herida y utilizando cultivos gliales puros de retina de rata y la línea celular humana de EPR, ARPE-19 investigamos los posibles efectos de C1P/CerK en la migración de estos dos tipos celulares. En estos ensayos de motilidad celular, consideramos la reducción del ancho de la herida como un indicador de la migración. Al evaluar el efecto de C1P sobre la migración de las CGM, determinamos que la C1P aumentó la migración a través de la reorganización del citoesqueleto de actina y la formación de filopodios y lamelipodios. Mediante ensayos de incorporación del nucleótido Bromo-deoxiuridina (BrdU) establecimos que la migración no contribuyó al cierre de la herida. Luego investigamos las vías de señalización involucradas en el efecto de C1P. La inhibición de las vías PI3K/Akt y JNK con LY294002 y SP600125, respectivamente, disminuyó la migración glial, tanto en los controles como en los cultivos tratados con C1P. Mediante ensayos de Western blot comprobamos que el agregado de C1P aumentó los niveles de p-Akt, forma activa de la Akt, respecto a los controles, confirmando la activación de la vía de la PI3K. Al inhibir la vía de ERK / MAPK con el inhibidor U0126 disminuyó la migración promovida por la C1P, pero no se alteró la migración en los controles. A continuación, evaluamos el papel de la cPLA2, mediador de C1P en la inflamación, que es activada por su unión a C1P. El tratamiento con ATK, un inhibidor de cPLA2, redujo notablemente la migración glial en cultivos tratados con C1P, mientras que en los cultivos controles la migración no fue alterada. Demostramos así que la C1P promueve la migración de las CGM mediante la activación de cPLA2 y JNK, PI3K y ERK / MAPK. Además, el agregado conjunto de C1P y S1P, evidenció que estos esfingolípidos tuvieron juntos el mismo efecto promotor de la migración glial que cuando fueron suplementados por separado, evidenciando una interrelación entre ellos en la regulación de los mecanismos que activan río abajo. Como la realización de la herida activó la migración celular, decidimos evaluar si la síntesis endógena de C1P estaba involucrada en dicha migración. Para ello, establecimos en primer término, mediante RT-PCR que las CGM expresaban CerK. Incubando los cultivos gliales con NVP231, un inhibidor de la CerK, demostramos que la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración glial en los controles y para la estimulación de la migración por C1P. Para descartar que la inhibición de la motilidad reflejara una pérdida de viabilidad celular, evaluamos dicha viabilidad por ensayo de MTT. Determinamos que el tratamiento de los cultivos gliales con NVP231 no alteró la viabilidad celular. En las células del EPR el tratamiento con C1P aumentó la migración, mediante la reorganización del citoesqueleto de actina y el desarrollo de extensos lamelipodios. Al evaluar el rol de la síntesis endógena en la migración del EPR, comprobamos que el tratamiento de los cultivos con NVP231 inhibió la formación de lamelipodios y bloqueó la migración de las células epiteliales. Determinamos, mediante el ensayo de MTT, que el tratamiento con NVP231 no alteró la viabilidad de las células del EPR. La C1P y la S1P promovieron la migración de las células del EPR, pero cuando los cultivos fueron tratados con NVP231 antes del agregado de estos esfingolípidos, el aumento de la migración que promovían fue bloqueado. Estos resultados demuestran que la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración promovida por C1P y S1P, evidenciando que la síntesis de C1P es clave en la estimulación de la migración por estos dos esfingolípidos. A continuación evaluamos el rol de C1P en la proliferación. Ensayos de incorporación del nucleótido BrdU en cultivos no confluentes demostraron que el agregado de C1P no alteró la proliferación ni en los cultivos gliales ni en los epiteliales. La inhibición de la síntesis de C1P redujo la proliferación en las CGM, mientras que no alteró la tasa de proliferación de los cultivos epiteliales, lo que sugiere que la C1P sería un mediador necesario para la proliferación glial en el período activo de mitogénesis de estas células. En conclusión, en este trabajo evidenciamos por primera vez que la C1P agregada exógenamente como así también aquella sintetizada por CerK en el interior celular, potenciaron la migración de las CGM y de las células del EPR. Demostramos también que la síntesis de C1P fue necesaria para la proliferación glial. Considerando la importancia del proceso de migración y proliferación en los dos tipos celulares de la retina decisivos en la mayoría de las enfermedades retinianas, proponemos a C1P/CerK como clave en el desarrollo y avance de las retinopatías proliferativas. / Retinal neurodegenerative diseases are the main cause of visual dysfunction in the developed world. Their common feature is the degeneration and eventual death of photoreceptors, which leads to visual impairment and eventual blindness in the most severe cases. Müller Glial Cells (MGC) are the main type of retinal glia and along with the Retinal Pigmented Epithelium (RPE) these cell types are two key factors in both the prevention and progression of these diseases. Under physiological conditions, MGCs and the RPE are in charge of the structural, physiological and functional maintenance of the retina. When faced with physiological changes or different damages, they alter their regular functions in order to either reestablish a proper environment or repair the existing damages; however, if the damage persists, the long-term changes of their aforementioned functions can be counterproductive and contribute to the development of retinal neurodegenerative pathologies. Proliferation and migration are activated as an unspecific response upon different damages in order to repair them but, due to unknown mechanisms, these processes finally provoke retina structural and functional loss, thus contributing to the progression of the visual dysfunction. The elucidation of the regulatory mechanisms involved in controlling migration and proliferation, including the molecules involved, is crucial for developing an integral treatment of these diseases. Bioactive sphingolipids are signaling molecules that regulate a wide array of biological processes, such as survival, proliferation, migration and inflammation. Among them, ceramide-1-phospate (C1P) is a sphingolipid generated by ceramide kinase (CerK), the enzyme responsible of phosphorylating ceramide (Cer) molecules. CerK activity has a central role in C1P-mediated cellular signaling, and is regulated by low levels of Ca2+, phosphorylation and many other stimuli. C1P promotes proliferation by activating several intracellular signaling pathways, as well as promoting inflammation by coupling with and activating the cytosolic phospholipase A2 (cPLA2), which participates in prostaglandin synthesis. Both for proliferation and migration, it has been proposed that C1P activates a (partially identified) specific extracellular receptor. Previous work from our group has shown that sphingosine-1-phospate (S1P), which is metabolically closely related to C1P, promotes MGC migration (Simón et al. 2015). Due to the close interconversions and functions of sphingolipids, uncovering the role of C1P in the processes involved in proliferative retinopathies is highly relevant. The purpose of this thesis is to investigate whether C1P and CerK participate in the regulation of migration and proliferation of MGC and RPE. By using the scratch wound assay in pure rat glial cultures and the RPE cell line ARPE-19, we assessed the effects of C1P/CerK in the migration of these two cell types. In these cellular motility assays we considered the reduction on the wound width as a positive indicator of cell migration. When evaluating the effect of C1P on migration, we determined that C1P enhanced migration by reorganizing the actin cytoskeleton and the formation of filopodia and lamellipodia. By quantifying the uptake of Bromide-deoxyuridine (BrdU) by MGC we determined that proliferation did not contribute to the reduction in the scratch width. We also investigated the signaling pathways involved in this process. Inhibition of PI3K/Akt and JNK pathways with the selective inhibitors LY294002 and SP600125, respectively, showed a decrease in glial migration in both control and C1Ptreated cultures. Western Blot assays showed that the addition of C1P increased the levels of p-Akt (the active form of Akt) when compared to controls, therefore confirming the activation of this pathway. Selective inhibition of the ERK/MAPK pathway with U0126 showed a decrease in C1P-induced migration, but did not alter it in control conditions. We also evaluated the role of cPLA2, a mediator of C1P in inflammation, which is activated by C1P binding. Treatment with ATK, a selective inhibitor of cPLA2, showed a substantial decrease in migration on C1P-treated cultures, while there was no alteration of the migrating capabilities in control conditions. We therefore showed that C1P is a promotor of MGC migration by activating cPLA2 as well as the JNK, PI3K and ERK/MAPK pathways. In addition, the combined addition of C1P and S1P showed that these sphingolipids had the same effect together than when they were added separately, suggesting either a direct relation between them or with the downstream mechanisms they trigger. Since we determined a basal reduction in the scratch width in control conditions, we evaluated whether the endogenous synthesis of C1P was involved in this migration. Initially, we established by RT-PCR assays that CGM expressed CerK. By incubating glial cultures with NVP231, a selective inhibitor of CerK, we showed that endogenous C1P synthesis was necessary for glial migration under control conditions, and that when this synthesis was inhibited addition of C1P did not restore cell migration. In order to verify that NVP231 did not affect cell viability, we evaluated viability by the MTT assay. We determined that treatment of glial cultures with NVP231 did not alter cell viability. On RPE cells, treatment with C1P increased cell migration by inducing actin cytoskeleton reorganization and extensive development of lamellipodia. When evaluating the role of the endogenous synthesis on RPE migration, we concluded that treating cultures with NVP231 inhibited lamellipodia formation and blocked RPE migration. We also determined that the viability of NVP231-treated RPE cells was not altered. Both C1P and S1P promoted RPE cell migration, but treating the cultures with NVP231 beforehand, abolished the migratory stimulus. These results show that endogenous C1P synthesis is essential for C1P and S1P-promoted migration, establishing that C1P synthesis is crucial to promote the migration of these two sphingolipids. Furthermore, we evaluated the possible role of C1P on cell proliferation. BrdU uptake assays on non-confluent cultures showed that the addition of C1P did not alter the proliferating capabilities on either MGC or RPE cultures. The inhibition of C1P synthesis impaired proliferation of MGCs, but did not affect that of RPE cells, suggesting that C1P might be a necessary mediator for glial proliferation in the active mitogenic stage of these cells. In this work we showed for the first time that both addition of C1P as well as the endogenous C1P produced by CerK promote migration of MGC and RPE cells. We also demonstrated that C1P synthesis is required for glial proliferation. Taking into consideration the relevance of migration and proliferation of both cell types in the development of most retinal diseases, we propose that C1P/CerK is instrumental in the development and progression of proliferative retinopathies.

Yes / Fundus-controlled perimetry (FCP, also called 'microperimetry') allows for spatially-resolved mapping of visual sensitivity and measurement of fixation stability, both in clinical practice as well as research. The accurate spatial characterization of visual function enabled by FCP can provide insightful information about disease severity and progression not reflected by best-corrected visual acuity in a large range of disorders. This is especially important for monitoring of retinal diseases that initially spare the central retina in earlier disease stages. Improved intra- and inter-session retest-variability through fundus-tracking and precise point-wise follow-up examinations even in patients with unstable fixation represent key advantages of these technique. The design of disease-specific test patterns and protocols reduces the burden of extensive and time-consuming FCP testing, permitting a more meaningful and focused application. Recent developments also allow for photoreceptor-specific testing through implementation of dark-adapted chromatic and photopic testing. A detailed understanding of the variety of available devices and test settings is a key prerequisite for the design and optimization of FCP protocols in future natural history studies and clinical trials. Accordingly, this review describes the theoretical and technical background of FCP, its prior application in clinical and research settings, data that qualify the application of FCP as an outcome measure in clinical trials as well as ongoing and future developments.

No / When a drop of liquid is placed on the surface of a soft material, the surface deformation and the rate of spreading of the triple contact point is dependent on the mechanical properties of the substrate. This study seeks to use drop spreading behavior to infer the mechanical properties of soft biological materials. As an illustration of the value of this technique we have compared the spreading behavior of a liquid droplet on two viscoelastic, soft materials, namely, an elastomer and a low concentration agar gel. The ratio of the mechanical properties of these soft materials obtained in this way is confirmed by atomic force microscopy (AFM) nanoindentation. By comparing the spreading behavior of a liquid on the retina with that of the same liquid on each of two viscoelastic materials, we can then estimate the elastic moduli of the retina: an estimate that is extremely difficult to carry out using AFM.

No / The parallel processing of information forms an important organisational principle of the primate visual system. Here we describe experiments which use a novel chromatic-achromatic temporal compound stimulus to simultaneously identify colour and luminance specific signals in the human electroretinogram (ERG). Luminance and chromatic components are separated in the stimulus; the luminance modulation has twice the temporal frequency of the chromatic modulation. ERGs were recorded from four trichromatic and two dichromatic subjects (1 deuteranope and 1 protanope). At isoluminance, the fundamental (first harmonic) response was elicited by the chromatic component in the stimulus. The trichromatic ERGs possessed low-pass temporal tuning characteristics, reflecting the activity of parvocellular post-receptoral mechanisms. There was very little first harmonic response in the dichromats' ERGs. The second harmonic response was elicited by the luminance modulation in the compound stimulus and showed, in all subjects, band-pass temporal tuning characteristic of magnocellular activity. Thus it is possible to concurrently elicit ERG responses from the human retina which reflect processing in both chromatic and luminance pathways. As well as providing a clear demonstration of the parallel nature of chromatic and luminance processing in the human retina, the differences that exist between ERGs from trichromatic and dichromatic subjects point to the existence of interactions between afferent post-receptoral pathways that are in operation from the earliest stages of visual processing.

El distroglicano (DG) es una proteína constituyente del complejo distrofina-glicoproteína que se expresa en una amplia variedad de tejidos de mamíferos y está compuesta por dos polipéptidos que permanecen unidos de forma no covalente en la membrana plasmática: el α-DG, que es extracelular y altamente O manosilglicosilado, y el β-DG, una subunidad transmembranal. El DG participa en la epitelialización, la miogénesis y la neurogénesis durante el desarrollo, así como en el mantenimiento de la integridad y función de los tejidos en el adulto. En este contexto, el α-DG proporciona un nexo fundamental dependiente de su O-glicosilación para el anclaje de las células a la matriz extracelular, mientras que el β-DG se asocia al citoesqueleto a través de la distrofina y además participa en una variedad de rutas que transmiten señales extracelulares al núcleo. Deficiencias en el proceso de glicosilación del α-DG provocan un conjunto de distrofias neuromusculares congénitas recesivas denominadas distroglicanopatías (DGPs). En este proceso actúan, directa o indirectamente, los productos proteicos de un total de 22 genes, comúnmente denominados genes asociados a DGPs, de forma secuencial a lo largo de una ruta biosintética compleja y ramificada. Adicionalmente, existen evidencias crecientes de que el DG ejerce un papel fundamental en la modulación de la proliferación celular y la prevención de la migración anómala y la invasividad celulares. Alteraciones en la expresión del α- y β-DG y/o la glicosilación del α-DG, así como en la expresión o actividad de las proteínas asociadas a DGPs, pueden dar lugar al origen y progresión de tumores humanos, por mecanismos moleculares y celulares que se empiezan a dilucidar. En la presente Tesis Doctoral se ha tratado de mejorar la comprensión acerca de la función de genes y proteínas asociados a DGPs en la retina de mamíferos, tejido frecuentemente afectado en estas enfermedades, así como en el cáncer, mediante el abordaje de su expresión y localización en células retinianas de mamíferos y líneas celulares derivadas de glioblastomas humanos. Mediante Western blotting se ha demostrado que el gen POMGNT2 se expresa a nivel de proteína en todas las retinas de mamíferos estudiadas (mono, vaca, rata y ratón), así como en la línea celular de fotorreceptores 661W. Adicionalmente, mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia se ha determinado que en las retinas neurales de mono y ratón, y en células 661W, la proteína POMGNT2 se encuentra generalmente en el retículo endoplásmico (ER) y B4GAT1 se localiza indistintamente en el ER y complejo de Golgi (GC), mientras que POMGNT1 y LARGE1 lo hacen únicamente en el GC. Asimismo, cabe señalar que todas estas proteínas se ubican adicionalmente en el núcleo de las células 661W. Por otro lado, se ha recopilado toda la información existente en la literatura sobre las alteraciones en la expresión en el α-DG y β-DG, así como las deficiencias en la glicosilación del α-DG, en tumores humanos y en líneas celulares derivadas. Adicionalmente, se han analizado las alteraciones en la expresión de los genes asociados a DGPs en cáncer, determinando que en tumores sólidos los genes POMT1, POMT2, POMGNT2, CRPPA, B4GAT1, LARGE1 y LARGE2 se encuentran generalmente infraexpresados, mientras que DOLK, DPM1, DPM2, DPM3, POMGNT1, B3GALNT2, POMK y FKTN están sobreexpresados. También se ha demostrado mediante RT-PCR cuantitativa que, en líneas celulares derivadas de glioblastomas humanos, los genes DAG1 y POMGNT2 se encuentran indistintamente infraexpresados o sobreexpresados a nivel de mRNA, según la línea, POMGNT1 y B4GAT1 tienden a sobreexpresarse, y LARGE1 está drásticamente infraexpresado. Además, se ha determinado que las proteínas POMGNT1, POMGNT2 y LARGE1 se localizan tanto en el ER como en el GC, adicionalmente al núcleo de todas las líneas celulares derivadas de glioblastoma estudiadas. En el núcleo hemos detectado la presencia de POMGNT1, POMGNT2, B4GAT1 y LARGE1 en la eucromatina, heterocromatina, cuerpos nucleares PML y de Cajal, y en los madurosomas de células 661W y las líneas derivadas de glioblastomas humanos. LARGE1 adicionalmente se concentraba en los nucleolos de todas estas líneas celulares. Estos resultados sugieren que estas proteínas podrían desempeñar una función en la regulación de la expresión génica a nivel de mRNA, tanto pre- como post-transcripcional, así como en la regulación traduccional (síntesis de ribosomas), el ciclo celular y la respuesta celular a estrés en células tumorales.

Age-related macular degeneration (AMD) is a retinal disease affecting over 200 million people that progresses to vision loss when left untreated. The neovascular form can be treated by bimonthly intravitreal injections of biologics that target vascular endothelial growth factor (VEGF) to inhibit dysregulated angiogenesis. Injection risks and logistics lower patient compliance, however even patients receiving optimal treatment can deteriorate. RNA interference (RNAi) via the delivery of small interfering RNA (siRNA) is under investigation as a therapeutic alternative. RNAi induces post-transcriptional gene silencing, providing more potent and longer-lasting effects. It has shown great therapeutic potential but is often limited by instability, reducing efficacy. In the current work, a cationic block co-polymer was developed and investigated as a delivery system for anti-VEGF siRNA to the posterior segment of the eye. This thesis details the synthesis, characterization, in vitro, and ex vivo testing of the polymer and the subsequent polyplexes formed between the polymer and an antisense oligonucleotide (ASO). pH-dependent polyplexes were formed which fully complexed the ASO at 1:1 and 10:1 ratios of polymer amine groups to ASO phosphate groups (N/P ratio). Although an increased N/P ratio is often found to cause cytotoxicity, neither formulation displayed a reduction in cell viability (p > 0.05). The polyplexes were under 150 nm in diameter, with a slightly negative zeta potential. In comparison to the naked ASO, the 10:1 polyplexes achieved superior transfection (p < 0.0001) into a human retinal pigment epithelial cell line (ARPE-19). After 24 hours, 0.6 μg of the ASO delivered by the 10:1 polyplexes displayed knockdown of the target protein (p < 0.05). Intravitreally administered polyplexes were well distributed throughout the vitreous humour, retina, and choroid within 4 hours of administration in an ex vivo porcine eye. These materials show potential for gene delivery in the treatment of AMD. / Thesis / Master of Applied Science (MASc) / Age-related macular degeneration (AMD) is a disease that causes central vision loss. AMD occurs in different stages but can only be treated when blood vessels begin to grow in the retina due to overexpression of a specific protein. Current treatments require patients to receive injections to the eye every 2 months and work by binding the overexpressed protein to stop vessel growth. An alternative is RNA interference which halts protein production and is thus more effective and long-lasting. This approach has not yet been implemented because RNA is easily degraded by enzymes before reaching the retina. The current work focused on developing a polymer to bind small interfering RNA (siRNA) and deliver it to cells in the retina. Although much more testing is required, the results show promise; the formulation was able to diffuse through the eye and successfully delivered the gene into retinal cells without causing cell death.