Poly (co iso-butyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), an alternating copolymer, was synthesised. For this class of copolymers the formation of an electron-donor complex is invoked to explain their microstructure in which the two comonomers strictly alternate. Due to its polarity, this copolymer constitutes a potential additive for imparting hydrophilic properties to a hydrophobic matrix. In order to obtain narrow molecular weight polymers and study the relation between the molecular weight of this additive and its ability to migrate to the host polymer surface, chain transfer agents were introduced in the system and also the Reversible Addition-Fragmentation chain Transfer (RAFT) process was employed. Free radical polymerisation was first carried out to allow for a comparison with the RAFT process and kinetics of copolymerisation was studied by NIR-FTIR and 1H NMR spectroscopy in order to analyse the rate of reaction of each comonomer. Dibenzyl trithiobenzoate, 3-benzyl sulfanyl thiocarbonyl sulfanyl-propionic acid and dibenzyl trithiobenzoate were used as RAFT agents. Results demonstrate that only benzyl dithiobenzoate is able to control the molecular weight of this copolymer and decrease its polydispersity index; possible reasons laying behind this result are discussed. It was also found that, in particular in the presence of benzyl dithiobenzoate, poly(iso-butyl vinyl ether) forms. This is an unusual phenomenon considering that the free radical polymerisation affords alternating copolymers and that iso-butyl vinyl ether is a monomer that polymerises through the cationic process. Experiments were carried out in various solvents in an attempt to counteract this side reaction, but no appreciable correlation between the properties of the solvents and the formation of homopolymer were found. Various hypothesis are considered, however it is likely that, in the conditions adopted, the presence of the RAFT agents alters the equilibrium constant of complex formation favouring the synthesis of the homopolymer. In addition to this side???reaction also inhibition of the copolymerisation reaction was at times encountered and an investigation into this phenomenon was also conducted.

La membrane plasmique des cellules épithéliales polarisées comporte deux domaines distincts, le domaine apical et le domaine basolatéral. Chaque domaine a une composition en lipides et en protéines déterminée, leur permettant d'assurer des fonctions spécifiques. Les mécanismes moléculaires responsables du tri et de l'adressage des protéines transmembranaires vers le pôle apical sont encore mal connus. La membrane apicale est enrichie en glycosphingolipides et en cholestérol qui forment des microdomaines appelés « rafts ». Expérimentalement, les rafts peuvent être isolés sous forme de DRM (detergent-resistant membranes) définis par leur résistance à un détergent non ionique, le Triton X-100. Il a été proposé que les rafts recrutent les protéines apicales au niveau du réseau trans-golgien et servent de plateforme pour leur adressage au pôle apical. Effectivement les protéines ancrées par le glycosylphosphatidyl-inositol sont résistantes au Triton et sont localisées en général à la membrane apicale. En revanche, la plupart des protéines transmembranaires apicales sont solubles dans le Triton, bien qu'elles soient résistantes à l'action de détergents plus doux comme le Lubrol WX. L'objectif des travaux de thèse a été d'étudier le rôle des rafts dans l'adressage apical de protéines transmembranaires et de comprendre l'effet différentiel du Triton et du Lubrol sur leur solubilisation. Les nucléotides pyrophosphatases NPP1 (basolatérale) et NPP3 (apicale) exprimées de façon stable dans les cellules MDCK ont servi de modèles. NPP3 est insoluble dans le Lubrol et partiellement insoluble dans le Triton, tandis que NPP1 est essentiellement solubilisée. L'étude de la localisation et de la sensibilité aux détergents de mutants et de chimères combinant des domaines cytoplasmiques, transmembranaires et extracellulaires de NPP3 et NPP1, a montré qu'il n'existait pas de corrélation stricte entre l'adressage apical et la résistance aux détergents. La résistance de NPP3 à la solubilisation par le Lubrol est acquise précocement au cours de sa biosynthèse, indépendamment de sa destination finale. Cette résistance dépend d'acides aminés chargés positivement situés dans la queue cytoplasmique, proches de la membrane. Afin de comprendre la sélectivité du Triton et du Lubrol dans l'extraction des protéines et des lipides membranaires, la composition lipidique des DRM obtenus après extraction par le Triton et le Lubrol a été comparée. Les DRM extraits par le Triton et le Lubrol sont enrichis en cholestérol ce qui correspond à la définition des rafts. Cependant, les DRM Triton sont appauvris en lipides du feuillet interne tandis que les DRM Lubrol sont enrichis en phosphatidyléthanolamine. Les DRM Lubrol sont également enrichis en protéines associées au feuillet interne de la membrane. En conclusion, ces travaux montrent que la résistance de la protéine apicale NPP3 à l'extraction par le Lubrol, et en partie par le Triton, est une propriété intrinsèque qui correspond probablement à une adaptation de la protéine à la composition lipidique du domaine apical, mais que cette propriété ne détermine pas son adressage polarisé. De plus, ces travaux montrent que les détergents sont des outils très intéressants pour étudier les interactions entre les protéines et les lipides membranaires, mais qu'il n'existe probablement pas de détergent capable d'isoler de façon stricte des microdomaines membranaires tels que sont définis les rafts. Nos résultats suggèrent que le feuillet interne des rafts est enrichi en phosphatidyléthanolamine et en cholestérol, qu'il est en partie solubilisé par le Triton, ce qui déstabiliserait les protéines transmembranaires et entraînerait leur extraction. Mots clés: détergent, raft, , ciblage apical, cholestérol, microdomaine membranaire, feuillet interne de la membrane, phosphatidyléthanolamine.

Le ciblage de la néoangiogenèse tumorale est une voie actuelle de recherche pour le diagnostic et pour le traitement des tumeurs solides. Les cellules endothéliales des néovaisseaux tumoraux surexpriment certains marqueurs spécifiques tels que l'intégrine ΑvΒ3, qui reconnaît spécifiquement les peptides possédant le motif « RGD » (-Arg-Gly-Asp-). Nous avons étudié le potentiel d'un nouveau radiotraceur - le RAFT-RGD - en vue d'imagerie moléculaire nucléaire des néovaisseaux. <br />In vitro, le couplage de 4 c(RGDfK) au RAFT augmente la captation du traceur par les cellules avb3 positives, par rapport au c(RGDfK). De plus, le RAFT-RGD possède une meilleure affinité que le c(RGDfK) et des propriétés d'inhibition de l'angiogenèse similaires. <br />In vivo, l'ensemble des tumeurs, ΑvΒ3 positives et négatives, est visible par imagerie planaire non invasive corps entier, comme en SPECT, dès 30 min post-injection et au-delà de 24 h, grâce à une gamma caméra dédiée au petit animal.<br />Le RAFT-RGD, malgré l'absence d'amélioration du contraste par rapport au cRGD, semble être un traceur prometteur de l'angiogenèse tumorale : il pourrait renseigner sur l'évolution de la pathologie et le suivi de l'efficacité des traitements des tumeurs dans les services de Médecine Nucléaire. De plus, par sa structure chimique, le RAFT-RGD apporte de multiples possibilités de marquage (émetteurs γ et β-), ce qui permet d'envisager des applications intéressantes notamment dans le domaine thérapeutique (radiothérapie interne vectorisée).

<p>Liquid chromatography is an important separation technique for a vast number of analytes. This thesis mainly focuses on the development of stationary phases for liquid chromatography based on zwitterionic sulfobetaine polymers.</p><p>In the thesis, various ways to prepare zwitterionic polymers in an aqueous environment using reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization are described. Both telomers, i.e. short soluble polymer chains containing a functional terminal group, as well as graft polymers on various supports have been synthesized. The RAFT polymerization technique provides an increased degree of control of the final polymers, which may aid in the preparation of more specifically tailored separation materials.</p><p>Sulfobetaine polymers carry both a positive and a negative charge within a single entity, which results in interesting solution properties as well as highly biocompatible features. These unique features make them especially suited for separation of highly polar and/or charged compounds. An example of the successful separation of short peptides using a stationary phase synthesized with the RAFT technique is given.</p><p>The unusual properties of sulfobetaine-type polymers are believed to be associated with the structure of water close to the polymer. A study of water structure in some silica based stationary phase grafted with zwitterionic sulfobetaine polymers was conducted. The impact of water structure on retention characteristics was investigated.</p>

New ABC triblock copolymers were synthesized by controlled free-radical polymerization via Reversible Addition-Fragmentation chain Transfer (RAFT). Compared to amphiphilic diblock copolymers, the prepared materials formed more complex self-assembled structures in water due to three different functional units. Two strategies were followed: The first approach relied on double-thermoresponsive triblock copolymers exhibiting Lower Critical Solution Temperature (LCST) behavior in water. While the first phase transition triggers the self-assembly of triblock copolymers upon heating, the second one allows to modify the self-assembled state. The stepwise self-assembly was followed by turbidimetry, dynamic light scattering (DLS) and 1H NMR spectroscopy as these methods reflect the behavior on the macroscopic, mesoscopic and molecular scale. Although the first phase transition could be easily monitored due to the onset of self-assembly, it was difficult to identify the second phase transition unambiguously as the changes are either marginal or coincide with the slow response of the self-assembled system to relatively fast changes of temperature. The second approach towards advanced polymeric micelles exploited the thermodynamic incompatibility of “triphilic” block copolymers – namely polymers bearing a hydrophilic, a lipophilic and a fluorophilic block – as the driving force for self-assembly in water. The self-assembly of these polymers in water produced polymeric micelles comprising a hydrophilic corona and a microphase-separated micellar core with lipophilic and fluorophilic domains – so called multi-compartment micelles. The association of triblock copolymers in water was studied by 1H NMR spectroscopy, DLS and cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM). Direct imaging of the polymeric micelles in solution by cryo-TEM revealed different morphologies depending on the block sequence and the preparation conditions. While polymers with the sequence hydrophilic-lipophilic-fluorophilic built core-shell-corona micelles with the core being the fluorinated compartment, block copolymers with the hydrophilic block in the middle formed spherical micelles where single or multiple fluorinated domains “float” as disks on the surface of the lipophilic core. Increasing the temperature during micelle preparation or annealing of the aqueous solutions after preparation at higher temperatures induced occasionally a change of the micelle morphology or the particle size distribution. By RAFT polymerization not only the desired polymeric architectures could be realized, but the technique provided in addition a precious tool for molar mass characterization. The thiocarbonylthio moieties, which are present at the chain ends of polymers prepared by RAFT, absorb light in the UV and visible range and were employed for end-group analysis by UV-vis spectroscopy. A variety of dithiobenzoate and trithiocarbonate RAFT agents with differently substituted initiating R groups were synthesized. The investigation of their absorption characteristics showed that the intensity of the absorptions depends sensitively on the substitution pattern next to the thiocarbonylthio moiety and on the solvent polarity. According to these results, the conditions for a reliable and convenient end-group analysis by UV-vis spectroscopy were optimized. As end-group analysis by UV-vis spectroscopy is insensitive to the potential association of polymers in solution, it was advantageously exploited for the molar mass characterization of the prepared amphiphilic block copolymers. / Die Arbeit widmet sich der Synthese von neuen amphiphilen ternären "ABC" Block-Copolymeren und der Untersuchung ihrer Selbstorganisation zu mizellaren Überstrukturen in wässriger Lösung. Die Block-Copolymere wurden durch kontrollierte radikalische Polymerisation mittels des sogenannten „RAFT“ Prozesses (radical addition fragmentation chain transfer) hergestellt. Neben der Realisierung der gewünschten Polymerarchitekturen erlaubte es die Methode, die Molmassen der Polymere durch Endgruppenanalyse zu bestimmen. Die Kettenenden der Polymere tragen infolge des Polymerisationsmechanismus’ definierte Funktionalitäten, welche UV- und sichtbares Licht absorbieren und somit durch UV-vis-Spektroskopie quantifizierbar sind. Das Absorptionsverhalten der Endgruppen wurde untersucht und die UV-vis-Endgruppenanalyse optimiert. Es zeigte sich, dass die Vorteile der Methode ihre generelle Anwendbarkeit und ihre Unempfindlichkeit gegenüber der Assoziation von Polymeren in Lösung sind. Aufgrund ihrer drei unterschiedlichen Blöcke bilden die synthetisierten ABC Triblockcopolymere komplexere selbstorganisierte Strukturen als die bisher üblichen Diblockcopolymere. Die Triebkraft für ihre Selbstorganisation in wässriger Lösung ist im wesentlichen der hydrophobe Effekt. Es wurden zwei unterschiedliche Ansätze verfolgt: Zum einen wurden doppelt-schaltbare Triblockcopolymere hergestellt, von denen ein Block permanent wasserlöslich ist, während die anderen Blöcke jeweils eine untere Entmischungstemperatur in wässriger Lösung aufweisen. Diese Blöcke „schalten“ beim Erwärmen von hydrophil auf hydrophob. Oberhalb des ersten Phasenübergangs - bei der niedrigeren Entmischungstemperatur - assoziieren die Makromoleküle und bilden Polymermizellen im Nanometerbereich. Beim weiteren Erwärmen „schaltet“ auch der zweite Block und modifiziert den selbstorganisierten Zustand, während der permanent wasserlösliche Block für die Stabilisierung der Aggregate sorgt. Die Assoziation der Block-Copolymere ist nach Abkühlen der wässrigen Lösung vollständig reversibel. Die stufenweise Selbstorganisation wurde mit Hilfe von Turbidimetrie, Dynamischer Lichtstreuung (DLS) und 1H-NMR-Spektroskopie untersucht, da diese Methoden das Verhalten auf der makroskopischen, mesoskopischen und molekularen Skala widerspiegeln. Obwohl der einsetzende Selbstorganisationsprozess problemlos zu detektieren war, konnten die Veränderungen infolge des zweiten Phasenübergang nicht immer eindeutig identifiziert werden, da sie zum Teil mit der langsamen Reaktion des Systems auf relativ schnelle Temperaturänderungen zusammenfielen. Außerdem hängt die Aggregatbildung nicht nur sensibel von der detaillierten Polymerarchitektur ab, sondern unterliegt auch teilweise einer kinetischen Kontrolle. Der zweite Ansatz zu komplexeren Polymermizellen basierte auf der Inkompatibilität „triphiler“ Blockcopolymere als Triebkraft für die Selbstorganisation. Das heißt, die Block-Copolymere bestehen aus einem hydrophilen, einen lipophilen und einen fluorophilen (Fluorkohlenwasserstoff-liebenden) Teil, die jeweils miteinander unverträglich sind. Die Polymere assoziierten in Wasser zu Polymermizellen mit einer hydrophilen Korona und einem unterstrukturierten Mizellkern mit separaten Kohlenwasserstoff- und Fluorkohlenwasserstoff-Domänen – sogenannten Multi-Kompartiment-Mizellen. Die Assoziation der Triblock-Copolymere wurde mit 1H-NMR-Spektroskopie, DLS und cryogener Transmissionselektronenmikroskopie (cryo-TEM) untersucht. Die unmittelbare Abbildung der Polymermizellen in Lösung mittels cryo-TEM enthüllte unterschiedliche Morphologien in Abhängigkeit von der Blocksequenz und den Präparationsbedingungen. Während Polymere mit der Blocksequenz hydrophil-lipophil-fluorophil Kern-Schale-Korona-Mizellen mit der Fluor-Domäne als Kern bildeten, wurde eine neue, unerwartete Mizellmorphologie für die Polymere mit dem hydrophilen Block in der Mitte gefunden: Einzelne oder mehrere Fluordomänen “schwimmen” als Scheiben auf dem lipophilen Kern. Die beobachteten Morphologien sind weitgehend stabil, unterliegen aber ebenfalls - zumindest teilweise - einer kinetischen Kontrolle. So führten erhöhte Temperaturen während der Mizellpräparation gelegentlich zu einer Veränderung der Mizellmorphologie oder Partikelgröße.

Un système de polymérisation radicalaire contrôlée par RAFT en dispersion huileuse sans stabilisant a été développé : l'acrylate de méthyle a ainsi été polymérisé dans l'isododécane (solvant du monomère, mais non solvant du polymère correspondant) en présence d'un macro(agent RAFT) soluble (le poly(acrylate de 2-éthylhexyle)) porteur soit d'une fonction dithiobenzoate, soit d'une fonction trithiocarbonate. Les conditions pour mener à une croissance contrôlée des chaînes ainsi qu'à la formation de particules bien définies et auto-stabilisées ont été étudiées. Par ce procédé, la formation in situ de copolymères à blocs à caractère solvophile/solvophobe mène par auto-assemblage à la formation de micelles. Ce procédé se révèle simple, met en jeu un nombre limité de réactifs et permet d'atteindre des taux de solide compris entre 20 et 40%. La comparaison des deux systèmes étudiés, ainsi que des caractérisations détaillées par chromatographie 2D des copolymères ont permis de proposer un mécanisme. Celui-ci permet d'expliquer les comportements très différents des deux systèmes (bon contrôle dans le cas du trithiocarbonate, pas de contrôle et effet retard dans le cas du dithiobenzoate), et se révèle cohérent avec des résultats issus de la littérature concernant également l'utilisation de macro(agent RAFT) lors d'une polymérisation en dispersion. Il apparaît finalement que la qualité du contrôle dépend de la réactivité de la nature du macro(agent RAFT) d'une part, et de son caractère solvophile/solvophobe d'autre part.

Owing to atomic force microscopy’s (AFM) high-resolution in both imaging and force spectroscopy, it is very successful in probing not only structures, but also nanomechanics of biological samples in solution. In this thesis, the nanomechanical properties of lipid bilayers of biological relevance and proteins of the barnacle adhesive were examined using AFM indentation, AFM-based force mapping, and single-molecule pulling experiments. Through high-resolution AFM-based force mapping, the self-organized structures exhibited in phase-segregated supported lipid bilayers consisting of dioleoylphosphatidylcholine / egg sphingomyelin / cholesterol (DEC) in the absence and presence of ceramide (DEC-Ceramide) were directly correlated with their breakthrough forces, elastic moduli, adhesion, and bilayer thickness. Results were presented as two-dimensional visual maps. The highly stable ceramide-enriched domains in DEC-Ceramide bilayers and the effect of different levels of cholesterol as well as of diblock copolymers, on the nanomechanical stability of the model systems studied were further examined. For the proteins of the barnacle adhesive, scanning electron microscopy (SEM), Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, and chemical staining with amyloid-selective dyes, in addition to AFM imaging, indentation, and pulling experiments were performed to study the structure and nanomechanics of the polymerized barnacle glue. Nanoscale structures exhibiting rod-shaped, globular, and irregularly shaped morphologies were observed in the bulk barnacle cement by AFM. SEM coupled with energy dispersive x-ray (EDX) makes evident the organic nature of the rod-shaped nanoscale structures while FTIR spectroscopy on the bulk cement gave signatures of β-sheet and random coil conformations. Indentation data yielded higher elastic moduli for the rod-shaped structures as compared to the other structures in the bulk cement. Single molecule AFM force-extension curves on the matrix of the bulk cement often exhibited a periodic sawtooth-like profile, observed in both extend and retract portions of the force curve. Rod-shaped structures stained with amyloid protein-selective dyes (Congo Red and Thioflavin-T) revealed that about 5% of the bulk cement are amyloids.

Owing to atomic force microscopy’s (AFM) high-resolution in both imaging and force spectroscopy, it is very successful in probing not only structures, but also nanomechanics of biological samples in solution. In this thesis, the nanomechanical properties of lipid bilayers of biological relevance and proteins of the barnacle adhesive were examined using AFM indentation, AFM-based force mapping, and single-molecule pulling experiments. Through high-resolution AFM-based force mapping, the self-organized structures exhibited in phase-segregated supported lipid bilayers consisting of dioleoylphosphatidylcholine / egg sphingomyelin / cholesterol (DEC) in the absence and presence of ceramide (DEC-Ceramide) were directly correlated with their breakthrough forces, elastic moduli, adhesion, and bilayer thickness. Results were presented as two-dimensional visual maps. The highly stable ceramide-enriched domains in DEC-Ceramide bilayers and the effect of different levels of cholesterol as well as of diblock copolymers, on the nanomechanical stability of the model systems studied were further examined. For the proteins of the barnacle adhesive, scanning electron microscopy (SEM), Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, and chemical staining with amyloid-selective dyes, in addition to AFM imaging, indentation, and pulling experiments were performed to study the structure and nanomechanics of the polymerized barnacle glue. Nanoscale structures exhibiting rod-shaped, globular, and irregularly shaped morphologies were observed in the bulk barnacle cement by AFM. SEM coupled with energy dispersive x-ray (EDX) makes evident the organic nature of the rod-shaped nanoscale structures while FTIR spectroscopy on the bulk cement gave signatures of β-sheet and random coil conformations. Indentation data yielded higher elastic moduli for the rod-shaped structures as compared to the other structures in the bulk cement. Single molecule AFM force-extension curves on the matrix of the bulk cement often exhibited a periodic sawtooth-like profile, observed in both extend and retract portions of the force curve. Rod-shaped structures stained with amyloid protein-selective dyes (Congo Red and Thioflavin-T) revealed that about 5% of the bulk cement are amyloids.

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Supported lipid bilayers (SLBs) are unique model systems for biological membranes. SLBs can be formed by fusing liposomes on solid substrates, which can be characterized by a variety of surface analytical techniques, such as Atomic Force Microscopy (AFM), X-ray diffraction, Quartz Crystal Microbalance (QCM), etc. In this study we used AFM to investigate the dynamic process of the formation of SLBs from liposomes in solutions containing metal ions and phase separation between different lipids as a function of temperature. Divalent cations, Ni2+ in particular, was found to be critical to the deposition of bilayers. Lipid rafts are plasma membrane microdomains rich in sphingolipid and cholesterol forming a liquid ordered phase surrounded by a liquid disordered phase. Lipid rafts are insoluble in cold non-ionic detergents, also called Detergent Resistant Membranes (DRMs). The interaction behaviors between detergent (Triton X-100) and mixed bilayers (DOPC/DPPC and DOPC/SpM) were studied by AFM. The way lipid bilayers were solubilized by Triton X-100 was quite different below and above its critical micelle concentration (CMC), and the SpM domains were found to be resistant to detergent extraction in the cold.