L'interleukine-2 (IL-2) est nécessaire à l'homéostasie des lymphocytes T régulateurs CD4+ Foxp3+ (Tregs) et son administration à faibles doses permet d'induire une expansion spécifique et dose-dépendante de ces cellules. Nous avons précédemment démontré que l'administration d'IL-2 à faibles doses permet de restaurer la tolérance immunitaire chez la souris NOD (modèle murin de diabète autoimmun). Toutefois cette stratégie n'est efficace à long terme que chez 30% des souris traitées.Mon travail de thèse a porte? sur l'amélioration de la thérapie par faibles doses d'IL-2. Dans un premier temps, nous avons démontré que la combinaison de l'IL-2 avec la rapamycine, une drogue ciblant préférentiellement les lymphocytes T effecteurs et épargnant les Tregs, ne permet pas d'améliorer le traitement. Au contraire, la rapamycine abolit de façon transitoire la tolérance induite par l'IL-2. Dans un deuxième temps, nous avons essayé d'augmenter les doses d'IL-2, dans le but d'induire une activation plus forte des Tregs. Néanmoins, le traitement par fortes doses d'IL-2 ne prévient pas le diabète autoimmun mais accélère son développement et est associé à une très forte toxicité.Ensuite, un deuxième axe de ma thèse s'est articulé autour de notre découverte de l'existence d'autoanticorps anti-IL-2 neutralisants chez la souris NOD et les patients souffrant de diabète de type 1. Ces autoanticorps modulent négativement l'homéostasie des Tregs in vivo, suggérant un rôle potentiel dans la physiopathologie du diabète autoimmun.Dans l'ensemble, ces résultats permettent de reconsidérer l'utilisation de l'IL-2 à faibles doses, seule ou combinée, dans le contexte du diabète de type 1. / CD4+ Foxp3+ regulatory T cells (Treg cells) are essential for the maintenance of immune tolerance. Interleukin-2 (IL-2) is mandatory for the homeostasis of Treg cells and its administration at low-doses induces a specific dose-dependent boost of Treg cells. Previous work has demonstrated that a short-tem treatment with low-doses IL-2 can revert established autoimmune diabetes in the NOD mouse model. However, this strategy induces long-term reversal in only 30% of the treated mice and can be optimized. During my PHD, my work has focused on the optimization of T1D therapy with low-doses of IL-2. First, we tried to combine low-doses of IL-2 with rapamycin, an immunosuppressive drug known to mainly affect Teff cells. The combined treatment (IL-2/Rapa) did not induce diabetes reversal and even reversibly broke IL-2-induced tolerance. Then, we tried to increase the IL-2 dose in order to increase the amplitude of the Treg boost. However, despite an important Treg cell boost, high-doses IL-2 administration to pre-diabetic NOD mice was toxic and precipitated T1D onset. In a second project, we described the existence of neutralizing anti-IL-2 autoantibodies in NOD mice and T1D patients. Our data suggested that anti-IL-2 autoantibodies negatively impacted on Treg cell homeostasis in vivo, contributing to the impaired immune tolerance observed in NOD mice and T1D patients. Altogether, our results lead to the consideration of low-doses IL-2, alone or combined, for the treatment of T1D. In addition, our demonstration of the existence of anti-IL-2 autoantibodies in NOD mice and T1D patients leads to a better understanding of T1D physiopathology.

Les myopathies inflammatoires sont des maladies acquises caractérisées par un déficit moteur impliquant une atteinte musculaire auto-immune. Elles sont responsables d'un handicap invalidant et peuvent s'accompagner de complications engageant le pronostic vital. Les traitements, quand ils existent, reposent sur l'utilisation de corticoïdes à fortes doses et au long cours. Cependant, 60% des patients rechutent et 20 à 30 % sont d'emblée corticorésistants. D'autres traitements immunosuppresseurs sont alors nécessaires. Les effets secondaires de ces traitements sont inévitables et parfois sévères. Afin de tester des nouvelles approches, le laboratoire a développé un modèle de Myosite Auto-immune Expérimentale dont les caractéristiques sont similaires à celles de la polymyosite. Dans ce modèle nous avons testé l'effet d'une sous population lymphocytaire T, appelée les lymphocytes T régulateurs, joue un rôle déterminant dans la tolérance périphérique aux antigènes du soi. Afin de contrôler les manifestations auto-immunes, nous avons cherché à les amplifier les Tregs in vivo, pharmacologiquement. D'abord, nous avons observé l'effet bénéfique de la rapamycine sur la sévérité de notre modèle en permettant en particulier d'augmenter le pourcentage de Tregs. Dans un second temps, nous avons montré le rôle bénéfique des immunoglobulines en intraveineux dans ce même modèle en traitement curatif. Enfin, nous nous sommes intéressés à l'effet de l'arsenic trioxyde (Trisenox) dans ce modèle animal.Ainsi, l'ensemble ces données permettent de mieux comprendre la physiopathologie des myosites et de mettre au point un essai clinique avec la rapamycine. / Inflammatory myopathies are acquired diseases characterized by motor deficit involving an autoimmune myopathy.They are responsible for impairing disability and may be associated with life-threatening complications.Treatment, when they exist, based on the use of corticosteroids in high doses and for long periods.However, 60 % of patients relapse and 20-30 % are readily corticosteroid.Other immunosuppressive treatments are then required (methotrexate , azathioprime , cyclosporine).The side effects of these treatments are inevitable and sometimes severe, which is why the development of new approaches treatment is essential. To test these new approaches, the laboratory developed a mouse model of Experimental Autoimmune Myositis with same Clinical and histological characteristics to polymyositis.In this model we tested the effect of a sub-population of T lymphocyte, nammed regulatory T cells, plays a crucial role in peripheral tolerance self-antigens. In order to control autoimmune manifestations that can replicate the mechanisms of action of Tregs , we sought to amplify in vivo, pharmacologically.At first, we observed the beneficial effect of rapamycin on our model, notably with increase of Tregs.In a second step, we have shown the beneficial role IVIg in the same model in curative.Finally, we investigated the effect of arsenic trioxide ( Trisenox ) in this animal model.Thus, all these data provide insight into the pathophysiology of myositis and to develop a clinical trial with rapamycin .

Titre de l'écran-titre (visionné le 30 octobre 2023) / L'épilepsie est une condition neurologique caractérisée par la survenue spontanée de crises résultant d'une activité neuronale synchrone et excessive. Récemment, des mutations dans les gènes du complexe GATOR1 (DEPDC5, NPRL2 et NPRL3) ont été impliquées dans les épilepsies focales familiales (EFF). Bien que les mécanismes moléculaires sous-jacents de la maladie ne soient pas encore compris, une hyperactivité de la voie de signalisation mTORC1 constitue une caractéristique bien établie des EFF reliées à GATOR1. Dans la cellule, GATOR1 est un complexe protéique essentiel dans la détection des acides aminés et il agit comme répresseur de la voie de signalisation mTORC1 lorsque les niveaux d'acides aminés intracellulaires sont bas. mTORC1 joue un rôle central dans la régulation de la croissance cellulaire et contrôle plusieurs processus cellulaires incluant la synthèse protéique et l'autophagie. Une dérégulation de la voie mTORC1 est impliquée dans plusieurs maladies, dont l'épilepsie. Malgré l'importance biologique et clinique de GATOR1, les mécanismes régulant son activité demeurent peu connus. Par l'utilisation de lignées de cellules mutantes, ce projet vise donc à identifier de nouveaux mécanismes biochimiques de régulation de GATOR1 afin de contrôler l'activité de mTORC1 et de mieux comprendre les conséquences moléculaires des mutations de GATOR1 contribuant à l'EFF. En déterminant l'impact fonctionnel de variants de NPRL2 reliés à l'EFF, j'ai montré qu'une portion de ces variants ont perdu leur capacité à réprimer mTORC1 dans des conditions nutritionnelles sous-optimales, ce qui supporte l'hyperactivité de mTORC1 comme mécanisme pathogénique sous-jacents de la maladie. Ce projet a également montré que le variant pathogénique L105P de NPRL2 est incapable de s'associer avec NPRL3 and DEPDC5, ce qui semble souligner le rôle crucial du résidu leucine 105 (Leu105) de NPRL2 dans la formation du complexe GATOR1. Par ailleurs, ce projet a montré que l'acétylation se produit sur certains résidus lysine de NPRL2 retrouvés à proximité du site Leu105. L'acétylation sur ces résidus s'est révélée plus abondante sur le mutant L105P que sur la protéine sauvage. Ces résultats proposent donc NPRL2 comme une cible potentielle sujette à la régulation par l'acétylation, laquelle pourrait avoir pour effet d'abolir les interactions protéiques entre les membres de GATOR1. / Epilepsy is a complex neurological disorder characterized by spontaneous seizures due to excessive neuronal activity. Mutations in the GATOR1 genes (DEPDC5, NPRL2 and NPRL3) have recently been linked to familial focal epilepsy (FFE). The molecular mechanisms underlying the disease are currently unknown, yet hyperactive mTORC1 signaling is an established feature of GATOR1-related epilepsies. The GATOR1 complex is an essential amino acids sensor that acts to repress the mTORC1 signaling pathway when intracellular amino acids levels are low. mTORC1 is a master regulator of cell growth that controls multiple cellular processes such as protein synthesis and autophagy. Dysregulation of mTORC1 contributes to many diseases including epilepsy. Despite the clinical and biological importance of GATOR1, little is known about its regulation. Through the use of mutant cell lines, this project aims to investigate novel biochemical regulatory mechanisms of GATOR1 that control mTORC1 activity, and to understand the molecular mechanisms underlying GATOR1-dependent epilepsies. Functional assessments of FFE-related NPRL2 variants in NPRL2-null cells revealed that some variants completely prevent the ability of GATOR1 to repress mTORC1 under starvation conditions. This further supports the dysregulation of mTORC1 as the main pathogenic mechanism underlying the disease. Additionally, I demonstrated that the pathogenic NPRL2 variant L105P is unable to associate with NPRL3 and DEPDC5, suggesting the critical role of NPRL2 Leu105 residue in organizing the assembly of GATOR1 complex. Finally, I showed that NPRL2 is acetylated on conserved lysine residues that are adjacent to the Leu105 site. Acetylation on Lys103 and Lys104 residues was more abundant in the mutant L105P compared to the wild-type NPRL2. These results suggest NPRL2 as a potential novel target of regulation by lysine acetylation, which may act as an impediment to protein interactions within the GATOR1 complex. Future work aimed at determining the functional consequences of lysine acetylation in NPRL2 will be necessary.

La rapamycine est un immunosuppresseur utilisé pour traiter plusieurs types de maladies dont le cancer du rein. Son fonctionnement par l’inhibition de la voie de Tor mène à des changements dans des processus physiologiques, incluant le cycle cellulaire. Chez Saccharomyces cerevisiae, la rapamycine conduit à une altération rapide et globale de l’expression génique, déclenchant un remodelage de la chromatine. Nous proposons que les modifications des histones peuvent jouer un rôle crucial dans le remodelage de la chromatine en réponse à la rapamycine. Notre objectif principal est d’identifier d’une banque de mutants d’histone les variantes qui vont échouer à répondre à la rapamycine dans une tentative de réaliser une caractérisation des modifications d’histone critiques pour la réponse à cette drogue. Ainsi, nous avons réalisé un criblage d’une banque de mutants d’histone et identifié plusieurs mutants d‘histone dont la résistance à la rapamycine a été altérée. Nous avons caractérisé une de ces variantes d’histone, à savoir H2B, qui porte une substitution de l’alanine en arginine en position 95 (H2B-R95A) et démontré que ce mutant est extrêmement résistant à la rapamycine, et non à d’autres drogues. Des immunoprécipitations ont démontré que H2B-R95A est défectueux pour former un complexe avec Spt16, un facteur essentiel pour la dissociation de H2A et H2B de la chromatine, permetant la réplication et la transcription par les ADN et ARN polymérases, respectivement. Des expériences de ChIP-Chip et de micropuce ont démontré que l’arginine 95 de H2B est requise pour recruter Spt16 afin de permettre l’expression d’une multitude de gènes, dont certains font partie de la voie des phéromones. Des évidences seront présentées pour la première fois démontrant que la rapamycine peut activer la voie des phéromones et qu’une défectuosité dans cette voie cause la résistante à cette drogue. / Rapamycin is an immunosuppressant used for treating many types of diseases such as kidney carcinomas. It works by inhibiting the Tor signaling pathway leading to changes in physiological processes, including cell cycle arrest. In Saccharomyces cerevisiae, rapamycin leads to a rapid and global alteration in gene expression, prompting chromatin remodeling. We propose that histone modification(s) might play a crucial role in remodeling of the chromatin in response to rapamycin. Our main objective is to identify from a histone mutant collection variants that fail to respond to rapamycin in an attempt to characterize histone modifications critical for this drug response. As such, we conducted a screen of the histone mutant collection and identified several hits that showed resistance to rapamycin. We characterized one of the histone variants, namely H2B, carrying alanine substitution at arginine 95 (H2B-R95A) and show that it is extremely resistant to rapamycin, but not to other drugs. Pull downs demonstrated that H2B-R95A was defective in forming a complex with Spt16, an essential factor that is required to disassociate H2A and H2B from the chromatin in order to allow replication and transcription by DNA and RNA polymerases, respectively. ChIP-Chip and microarray experiments showed that arginine 95 of H2B is required to recruit Spt16 to allow expression of several genes, a subset of which are involved in the pheromone signaling pathway. Evidence will be presented to show for the first time that rapamycin can activate the pheromone pathway and that defects in this pathway cause resistance to the drug.

Les tumeurs épithéliales thymiques (TET) humaines sont rares (250 - 300 cas/an en France). On distingue les thymomes de type A, AB ou B d'évolution lente avec une survie actuarielle > 95% à 5 ans pour les stades précoces et les carcinomes thymiques d'évolution plus sévère avec une survie actuarielle à 5 ans < 20% pour les stades IV. La pierre angulaire du traitement des TET est l'exérèse chirurgicale complète, facteur pronostique le plus significatif identifié à ce jour. Les récidives des TET, essentiellement pleurales pour les thymomes et générales pour les carcinomes thymiques, sont de prise en charge complexe. Les avancées thérapeutiques sont limitées notamment par l'absence de modèles d'étude de la cellule épithéliale thymique tumorale. Dans le cadre d'une prise en charge multidisciplinaire des récidives pleurales métastatiques, nous avons développé la pleurectomie de cytoréduction associée à une chimio hyperthermie (cisplatine/ mitomycine ; 42°C) intra thoracique (CHIT) pour la prise en charge des métastases pleurales de thymome. Chez des patients sélectionnés (n=19), la médiane de survie sans récidive était de 53 mois et les survies actuarielles à 1 an et 5 ans étaient respectivement de 93% et 86%. Cette technique chirurgicale innovante a permis de développer une alternative à la morbide pleuro pneumonectomie. L'efficacité de la CHIT pose des questions sur le rôle de l'hyperthermie et sur le type de chimiothérapie à associer. Avec pour objectif d'améliorer la prise en charge des patients, la connaissance de la biologie tumorale thymique et l'identification de potentielles cibles thérapeutiques sont des voies de recherche importantes pour améliorer la survie des patients. Nous avons développé des cultures de cellules épithéliales thymiques dérivées in vitro de 12 TET (11 thymomes A, AB ou B et un carcinome thymique), caractérisées par leur potentiel prolifératif et leur expression de cytokératine. La voie PI3K / Akt / mTOR joue un rôle clé dans de nombreux cancers ; plusieurs études de phases I / II ont rapporté un effet positif des inhibiteurs de mTOR pour le contrôle de l'évolution du thymome chez les patients. Nous avons mis en évidence l'expression et l'activation des effecteurs mTOR, Akt et P70S6K dans les thymomes et dans les cellules épithéliales thymiques dérivées in vitro. Nous avons montré l'efficacité de la rapamycine, inhibiteur de mTOR, à réduire la prolifération cellulaire (30%) sans induire de mort cellulaire. Nos résultats suggèrent que l'activation de la voie Akt / mTOR participe à la prolifération cellulaire associée à la croissance tumorale. Nous avons établi un nouvel outil permettant l'étude de la dérégulation cellulaire au cours des thymomes. Dans un contexte de tumeurs rares, ces cellules permettront d'aborder des études mécanistiques in vitro et de tester l'efficacité de drogues anti tumorales / Human thymic epithelial tumors (TETs) are rare (250 – 300 cases/ year in France). We distinguish thymomas (A, AB and B subtypes) with indolent evolution (5 years actuarial survival in early stages >95%) and more aggressive thymic carcinomas (5 years actuarial survival <20% in stage IV). Surgical complete resection when feasible is the corner stone of a multimodal therapy and the most significant factor on survival. Relapse of TETs principally in pleura for thymomas (75%) and general for thymic carcinomas are difficult to treat. Therapeutics advances are limited given the lack of studies models of tumoral thymic epithelial cell. In a multidisciplinary approach for the treatment of metastatic pleural relapse of thymomas we developed an innovative surgical technique: cytoreductive pleurectomy associated with hyper thermic intra pleural chemotherapy (Cysplatin/ Mitomycin; 42°C) (ITCH). In selected patient (n=19), ITCH provides an efficient alternative to the morbid pleuro pneumonectomy. The median of free disease survival was 53 months, one year and five years actuarial survival were respectively 93% and 86%. However, the effectiveness of ITCH procedure questions on the played role ok hyperthermia, on the choice of chemotherapy association. With the aim to improve TETs therapies, the knowledge of TETs biology to identify potential target therapies is currently challenging. We developed an in vitro study model of tumoral thymic epithelial cells derived from 12 TETs (11 A, AB and B thymomas and one thymic carcinoma) characterized by their proliferative abilities and the cytokeratin expression. The PIK3 / Akt / mTOR pathway is implicated in numerous cancers. Several phase I, II studies advocate the potential role of mTOR inhibitors in the control of the metastatic disease. We highlighted the expression and the activation of mTOR, Akt and P70S6K effectors in TETs and in thymic epithelial cells in vitro derived. We showed the efficacy of rapamycin (mTOR inhibitor) in the inhibition (-30%) of in vitro cell proliferation without cell death induction. Our results suggest the implication of the PIK3 / Akt / mTOR pathway in the tumoral cell growth. We established a new tool to study cell dysregulation in TETs. In the context of rare tumors, these cells could allow in vitro mechanistic studies and test the efficacy of new anti tumoral therapies

L'activation dérégulée de lymphocytes T conduit à une réponse immune délétère envers les antigènes du soi. Malgré une utilisation croissante de doses élevées d'IVIg pour traiter les maladies auto-immunes, la compréhension des mécanismes sous-jacents aux bénéfices thérapeutiques demeure un enjeu majeur. En effet, les effets des IVIg restent inexplorés dans le cadre des maladies auto-immunes associées aux lymphocytes T. J'ai recherché les effets de doses élevées d'IVIg dans la polarisation des lymphocytes T en utilisant le modèle de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), une maladie auto-immune associée aux lymphocytes T. Les IVIg inhibent la différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en sous-populations effectrices (lymphocytes Th1 et Th17) et induisent, de manière concomitante, une prolifération des lymphocytes T Foxp3+. Les IVIg diminuent les effets délétères des lymphocytes T sur les tissus en diminuant l'expression du GM-CSF et de la podoplanine. En outre, les IVIg empêchent la dégénérescence neuronale en inhibant l'infiltrat en lymphocytes T CD4+ dans le système nerveux central (SNC). Ce mécanisme passe par une séquestration de ces lymphocytes dans les ganglions lymphatiques drainants à travers la voie de signalisation S1P-S1P1-mTor. De manière intéressante, et contrairement aux données actuelles, le récepteur inhibiteur FcγRIIB et la sialylation des IVIg ne sont pas indispensables pour la modulation des sous-populations de lymphocytes T CD4+ effecteurs et régulateurs induite par les IVIg. Ainsi, le bénéfice thérapeutique des IVIg dans le modèle de l'EAE implique un déséquilibre de la balance entre les lymphocytes Th17/Th1 et les lymphocytes Trég, au profit des lymphocytes Trég. Ces cellules diminuent l'expression de médiateurs favorisant l'apparition de l'encéphalomyélite et inhibent la migration des lymphocytes T vers l'organe cible.

Les gliomes malins de l’enfant (GME), de pronostic sombre, se distinguent des gliomes malins de l’adulte (GMA) sur le plan biologique mais aussi clinique, avec des taux de réponse au témozolomide (chimiothérapie alkylante de référence chez l’adulte) moindres. L’efficacité du temozolomide est réduite par l’action de l’enzyme de réparation de l’ADN, l’O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT), dont l’expression est fréquemment inhibée par méthylation du promoteur de son gène dans les GMA. En première partie, la mise au point d’une nouvelle technique de PCR spécifique de méthylation a montré une fréquence plus faible dans les GME (15%) vs les GMA (45%, p<0,001). En deuxième partie, l’hypoxie intra-tumorale et la dérégulation en amont de l’axe mTOR-HIF-1α, connus pour être impliqués dans la chimio-résistance, ont été étudiés dans les GME et ciblés par l’association rapamycin-irinotecan dans une étude in vitro, pour laquelle des lignées dérivées de GME ont été développées. / Pediatric malignant glioma (PMGs), are associated with a very dismal prognosis. They are distinct from their adult counterparts (AMGs), biologically but also clinically, with a lower response to temozolomide (the current reference alkylating chemotherapy) compared to AMGs. Temozolomide efficacy is reduced by the activity of the DNA repair enzyme, O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT), whose expression is frequently silenced by promoter methylation. First, the development of a new methylation-specific PCR showed a lower frequency of MGMT methylation in PMGs (15%) vs AMGs (45%, p<0,001). Secondly, intra-tumor hypoxia and the upstream deregulation of mTOR-HIF-1α axis, well-known to be involved in chemo-resistance and the up-regulation of MGMT expression, were studied in a PMG cohort. The targeting of this axis was then studied in vitro using a therapy combining rapamycin and irinotecan. For this, pediatric patient-derived malignant glioma cell lines were developed.

Les traitements des cancers des VADS reposent sur la chirurgie, la radiothérapie, et la chimiothérapie. Malgré ces traitements, la survie globale des patients à 5 ans est de l’ordre de 50%. Les causes d’échec thérapeutique sont dues au profil de résistance des tumeurs. Le ciblage de l’axe EGFR/mTOR/HIF-1 par une combinaison de rapalogues et d’anti-EGFR a montré son efficacité sur certaines tumeurs solides. L’objet de ce travail de thèse a été de caractériser l’impact d’une combinaison de drogues à faibles doses sur des lignées cellulaires des VADS au moyen d’une approche pharmacologique et moléculaires. Nos résultats montrent que la combinaison de la rapamycine (5nM) au cetuximab (2,5μg/ml) diminue la survie clonogénique des cellules et permet une inhibition du facteur de transcription HIF-1α. Cette combinaison de drogue améliore l’efficacité de la radiothérapie. En revanche, l’induction de HIF-2a induite par le traitement provoque la résistance des cellules aux traitements par, et une rechute rapide des tumeurs in vivo. L’inhibition de HIF-2 permet une inhibition de la survie cellulaire d’environ 100% dans un modèle résistant. / Management of HNSCC relies on surgery, radiotherapy, and chemotherapy. Despite these treatments, the 5 years overall survival of patient is lower than 50%. Main causes of therapeutic failure are due to the profile of resistance of tumors. The efficacy of a combination rapalogues and anti-EGFR therapies in targeting the EGFR/mTOR/HIF-1 axis in solid tumors was shown previously. In this PhD work, we have evaluated the impact of a low-dose drug combination on head and neck cancer cells lines with a pharmacological and molecular approach. We show that the combination of rapamycine (5nM) and cetuximab (2,5μg/ml) efficiently inhibits the HIF-1 transcription factor and impairs cell clonogenic survival. The efficacy of radiation therapy is improved by this drug combination. However, cell resistance to the treatment is acquired via the induction of HIF-2 in our resistant model cell line. This induction is associated with more tumor relapse in tumors mice xenograft. The inhibition of HIF-2 achieves a dramatic drop of cell clonogenic survival to < 1%.

Une restriction alimentaire améliore la qualité du vieillissement et augmente la durée de vie chez de nombreuses espèces, y compris certains primates. Cependant, cette intervention s'accompagne souvent d'une baisse significative des capacités reproductives. Il est donc légitime de se demander si des signaux provenant du système reproductif contribuent aux effets positifs de la restriction alimentaire sur la longévité. Durant ma thèse, j'ai montré que l'expression de DAF-9/CYP27A1 et la production de l'hormone stéroïdienne D7- acide dafachronique (DA) sont augmentées chez C. elegans lorsque les vers sont soumis à une restriction alimentaire. De plus, la signalisation à l'acide dafachronique via le récepteur hormonal nucléaire NHR-8/NHR et la kinase let-363/mTOR est essentielle à l'augmentation de la durée de vie par restriction alimentaire. La signalisation stéroïde affecte également la plasticité de la lignée germinale en condition de jeûne. De plus, nous montrons que cette plasticité est nécessaire à l'augmentation de la longévité dans ce context de restriction. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que la signalisation des hormones stéroïdes est activée par le manque de nutriments et est requise pour l'augmentation de la longévité par la voie mTOR. En effet, chez un animal sauvage, le niveau d’expression de let-363/mTOR diminue en condition de jeûne. Ceci n’est pas observé lorsque les hormones stéroïdes sont absentes. De plus, le nombre de cellules de la lignée germinale au sein de la zone proliférative n'est plus affecté par le jeûne chez des animaux pour lesquels la synthèse d'hormones stéroïdes est inhibée. Une réduction artificielle du nombre de cellules germinales suffit à rétablir une réponse normale à la restriction alimentaire. Ceci suggère donc qu'il existe un lien étroit entre la lignée germinale et la longévité induite par une restriction alimentaire, et que ce lien repose en partie sur la signalisation des hormones stéroïdes. La kinase let-363/mTOR joue également un rôle central dans l'intégration de signaux nutritionnels et reproductifs. Nos données suggèrent également l'existence d'un signal entre lignée germinale et soma produit en condition de restriction alimentaire. L'augmentation de la durée de vie par restriction alimentaire implique donc une réponse systémique coordonnée qui implique l'appareil reproducteur. / Dietary restriction (DR) increases healthspan and longevity in many species, including primates, but it is often accompanied by impaired reproductive function. Whether signals associated with the reproductive system contribute to or are required for DR effects on lifespan has not been established. In my doctoral thesis presented here, we show that expression of DAF-9/CYP27A1 and production of the steroid hormone ∆7-dafachronic acid (DA) are increased in C. elegans subjected to DR. DA signaling through the non-canonical nuclear hormone receptor NHR-8/NHR and the nutrient-responsive kinase let-363/mTOR is essential for DR-mediated longevity. Steroid signaling also affects germline plasticity in response to nutrient deprivation and this is required to achieve lifespan extension. Results presented in my thesis demonstrate that steroid signaling is activated by nutrient scarcity and is required for DR effects on lifespan extension through TOR signaling. In the absence of proper steroid signaling, let-363/mTOR levels remain high during starvation and the number of germ cells within the proliferative zone of the germ line is no longer affected by nutrient availability. Interestingly, genetic reduction of germ cells alleviates the requirement for steroid signaling for DR-mediated lifespan extension. Genetically lowering the germ cell count mimics the response of the germ line to DR. These data demonstrate that steroid signaling links germline physiology to lifespan when nutrients are limited, and establish a central role for let-363/mTOR in integrating signals derived from nutrients and steroid hormones. We speculate that this induces a signal that is usually emitted when nutrients are scarce and the germ line becomes less active. Taken together, this thesis work suggests that, diet-induced lifespan extension is part of a coordinated response that involves reproductive phenotypes.

Il a été suggéré que l’autophagie pouvait participer au processus fibrotique en favorisant la différenciation du fibroblaste en myofibroblaste. La sénescence cellulaire a aussi été montrée comme impliquée dans la réparation tissulaire et la fibrose. Des liens ont été établis entre autophagie et sénescence. Cette étude a pour but d’investiguer les liens possibles entre autophagie, sénescence et différenciation myofibroblastique afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant la réparation tissulaire et la fibrose. Les fibroblastes carencés en sérum pendant quatre jours montrent des ratios LC3B-II/-I élevés et des niveaux de SQSTM1/p62 diminués. L’augmentation de l’autophagie est accompagnée d’une augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation myofibroblastique ACTA2/αSMA et collagènes de type 1 et 3 et de la formation de fibres de stress. Les fibroblastes autophagiques expriment les marqueurs de sénescence CDKN1A (p21) et p16INK4a (p16) et montrent une augmentation de l’activité beta-galactosidase associée à la sénescence. L’inhibition de l’autophagie à l’aide de différents inhibiteurs de phosphoinositide 3-kinase de classe I et de phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PtdIns3K) ou par inhibition génique à l’aide d’ARN interférant ATG7 bloquent l’expression des marqueurs de différenciation et de sénescence. L’expression et la sécrétion de CTGF (connective tissue growth factor) sont augmentées chez les fibroblastes autophagiques. L’inhibition de l’expression du CTGF par interférence génique prévient la différenciation myofibroblastique, démontrant l’importance de ce facteur pro-fibrotique pour la différenciation induite par l’autophagie. La phosphorylation de la kinase RPS6KB1/p70S6K, cible du complexe MTORC1, est abolie dans les fibroblastes autophagiques. La phosphorylation d’AKT à la Ser473, une cible du complexe MTORC2, diminue lors de la carence en sérum des fibroblastes mais est suivie d’une rephosphorylation après 2 jours. Ce résultat suggère la réactivation de MTORC2 lors d’une autophagie prolongée. Ceci a été vérifié par inhibition de l’autophagie dans les fibroblastes carencés en sérum. Les inhibiteurs de PtdIns3K et le siRNA ATG7 bloquent la rephosphorylation d’AKT. L’inhibition de la réactivation de MTORC2, et donc de la rephosphorylation d’AKT, est aussi obtenue par exposition des fibroblastes à la rapamycine, le Torin 1 ou par inhibition génique de RICTOR. Ces traitements inhibent l’augmentation de l’expression du CTGF ainsi que des marqueurs de différenciation et de sénescence, démontrant le rôle central joué par MTORC2 dans ces processus. Le stress oxydant peut induire la sénescence et la carence en sérum est connue pour augmenter la quantité de ROS (reactive oxygen species) dans les cellules. Afin d’investiguer le rôle des ROS dans la différenciation et la sénescence induites par l’autophagie, nous avons incubés les fibroblastes carencés en sérum en présence de N-acetyl-L-cysteine (NAC). Le NAC diminue la production de ROS, diminue les marqueurs d’autophagie, de sénescence et de différenciation myofibroblastique. Le NAC inhibe aussi la phosphorylation d’AKT Ser473. L’ensemble de ces résultats identifient les ROS en association avec une autophagie prolongée comme des nouveaux activateurs du complexe MTORC2. MTORC2 est central pour l’activation subséquente de la sénescence et de la différenciation myofibroblastique. / Recent evidence suggests that autophagy may favor fibrosis through enhanced differentiation of fibroblasts in myofibroblasts. Cellular senescence is also involved in tissue repair and fibrosis. Autophagy has been linked with senescence. This study focuses on understanding the molecular mechanisms linking autophagy, senescence and myofibroblast differentiation and the roles they could play in wound healing and fibrosis. Fibroblasts, serum starved for up to 4 days, showed increased LC3B-II/-I ratios and decreased SQSTM1/p62 levels. Autophagy was associated with acquisition of markers of myofibroblast differentiation including increased protein levels of ACTA2/αSMA (actin, α 2, smooth muscle, aorta), enhanced gene and protein levels of COL1A1 (collagen, type I, α 1) and COL3A1, and the formation of stress fibers. Autophagic fibroblasts showed expression of the senescence markers CDKN1A (p21) and p16INK4a (p16) and also exhibit increase in Senescence Associated-beta-galactosidase activity. Inhibiting autophagy with different class I phosphoinositide 3-kinase and class III phosphatidylinositol 3-kinase (PtdIns3K) inhibitors or through ATG7 silencing prevented myofibroblast differentiation and senescence markers expression. Autophagic fibroblasts showed increased expression and secretion of CTGF (connective tissue growth factor), and CTGF silencing prevented myofibroblast differentiation. Phosphorylation of the MTORC1 target RPS6KB1/p70S6K kinase was abolished in starved fibroblasts. Phosphorylation of AKT at Ser473, a MTORC2 target, was reduced after initiation of starvation but was followed by spontaneous rephosphorylation after 2 d of starvation, suggesting the reactivation of MTORC2 with sustained autophagy. Importantly, inhibition of autophagy with PtdIns3K inhibitors or ATG7 silencing blocked AKT rephosphorylation. Inhibiting MTORC2 activation with long-term exposure to rapamycin, Torin 1 or by silencing RICTOR, a central component of the MTORC2 complex, abolished AKT rephosphorylation. RICTOR silencing, Torin 1 and rapamycin treatments prevented CTGF and ACTA2 upregulation and induction of senescence markers demonstrating the central role of MTORC2 activation in CTGF and senescence induction for myofibroblast differentiation. Since oxidative stress is a known inducer of senescence, we investigated the role of reactive oxygen species (ROS) in autophagy-induced myofibroblast differentiation and senescence markers induction. Exposing fibroblasts to N-acetyl-L-cysteine (NAC) decreased production of ROS during serum starvation, inhibited autophagy and significantly decreased the expression of senescence and myofibroblast differentiation markers. NAC also inhibited the phosphorylation of AKT Ser473, establishing the importance of ROS in fuelling MTORC2 activation. Collectively, these results identify ROS production in association with sustained autophagy as novel inducers of MTORC2 signaling which in turn concomitantly activate senescence and myofibroblast differentiation.