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L’oncogène K-ras est une petite GTPase de la super famille RAS, fréquemment impliquée dans les cancers, en particulier celui du pancréas, l’un des plus mortels dans les pays occidentaux. Les mutations de l’oncogène K-ras sont considérées comme l’un des événements initiateurs de la cancérogenèse pancréatique et son activité oncogénique est un élément indispensable à la progression tumorale. Cependant, le ciblage thérapeutique de K-ras reste inefficace, à ce jour. Se focaliser sur les cibles précoces de son activité oncogénique semble ainsi être une stratégie alternative intéressante. La mucine membranaire MUC4 est une glycoprotéine de haut poids moléculaire fréquemment dérégulée dans les cancers. Dans le cancer du pancréas, MUC4 est néo-exprimée dès les stades prénéoplasiques et est impliquée dans les propriétés biologiques permettant la progression tumorale et la chimiorésistance. La régulation de MUC4 par K-ras dans la cancérogenèse pancréatique reste à décrypter. En utilisant le modèle murin de cancérogenèse pancréatique Pdx1-Cre; LStopL-K-rasG12D, nous avons mis en évidence que la néo-expression précoce de la mucine Muc4, dans les lésions pancréatiques prénéoplasiques intraépithéliales (PanINs) formées suite à la présence du K-ras muté, est corrélée avec l’activation des voies de signalisation ERK, JNK and NF-κB. In vitro, la transfection de mutants constitutivement activés de K-rasG12V dans les cellules tumorales humaines induit une augmentation de l’expression de MUC4. Cette activation intervient au niveau transcriptionel par le recrutement des facteurs de transcription AP-1 et NF-κB via les voies MAPK, JNK and NF-κB et au niveau post-transcriptionel par un mécanisme impliquant la RalB GTPase. Ensemble, ces résultats démontre que MUC4 est une cible transcriptionelle et post-transcriptionelle de l’activité oncogénique de K-ras dans le cancer du pancréas. Ces résultats ouvrent de nouvelles pistes pour développer des stratégies ciblant les étapes précoces de ce cancer. / K-ras oncogene is a small GTPase of the RAS superfamily, highly implicated in cancer, mainly in pancreatic cancer, one of the most deadly cancers in occidental countries. K-ras mutations are considered as an initiating event of pancreatic carcinogenesis and K-ras oncogenic activities are necessary components of cancer progression. However, K-ras clinical targeting remains ineffective until now. Focus on early downstream K-ras signalling may thus appear as an interesting strategy target in this cancer. The membrane-bound mucin MUC4 is a high molecular weight glycoprotein frequently deregulated in cancer. In pancreatic cancer, MUC4 is neo-expressed in the preneoplastic stages and thereafter is involved in cancer cell properties leading to cancer progression and chemoresistance. MUC4 regulation by K-ras in pancreatic carcinogenesis remains unknown. Using the Pdx1-Cre; LStopL-K-rasG12D mouse model of pancreatic carcinogenesis, we show that the in vivo early neo-expression of the mucin Muc4 in pancreatic intraepithelial neoplastic lesions (PanINs) induced by mutated K-ras is correlated with the activation of ERK, JNK and NF-ΚB signalling pathways. In vitro, transfection of constitutively activated K-rasG12V in human pancreatic cancer cells led to the transcriptional upregulation of MUC4. This activation was shown to be mediated at the transcriptional level by AP-1 and NF-ΚB transcription factors via MAPK, JNK and NF-ΚB pathways and at the post-transcriptional level by a mechanism involving the RalB GTPase. Altogether, these results identifies MUC4 as a transcriptional and post-transcriptional target of K-ras in pancreatic cancer. This opens avenues in developing new approaches to target the early steps of this deadly cancer.

La sénescence cellulaire et l'apoptose ont évolué comme des puissantes barrières protectrices contre la transformation néoplasique. La sénescence est un état d'arrêt permanent de la prolifération dans lequel les cellules restent métaboliquement actives. La sénescence cellulaire est déclenchée par différentes sources de stress, notamment les oncogènes activés, le dysfonctionnement des télomères, les dommages à l'ADN et des défauts dans la réplication provoqués par des agents génotoxiques, des espèces réactives de l'oxygène, etc. Ce processus complexe engage deux voies différentes de suppresseurs de tumeurs, les voies p53/p21 et p16INK4a/pRb, et les deux voies doivent être compromises dans les cellules humaines afin de contourner la sénescence. Par conséquent, décrire la relation entre l'activation des oncogènes, l'arrêt de la prolifération induite par la sénescence et l'échappement à l'état de sénescence est essentiel pour comprendre le processus de tumorigenèse. KDM4A est un membre de la sous-famille KDM4 des Jumonji lysine déméthylases ciblant les variantes di- et triméthylées de l'histone H3 lysine 9 (H3K9) et l'histone H3 lysine 36 (H3K36). Les trois premiers membres de la sous-famille KDM4A, KDM4B et KDM4C sont également capables de lier l'histone 4 lysine 20 di-méthyl/tri-méthyl (H4K20me2/3) et l'histone 3 lysine 4 tri-méthyl (H3K4me3), via leurs domaines Tudor consécutifs. KDM4A module négativement l'activité de la voie p53, en ciblant directement le suppresseur de tumeur CHD5, et est également un régulateur négatif de la réponse aux dommages de l'ADN. Les niveaux d'expression de KDM4A sont souvent élevés dans les cellules cancéreuses et diminués pendant la sénescence cellulaire. La motivation principale de cette thèse est d'élargir nos connaissances actuelles sur la façon dont la réorganisation de la chromatine influence la stabilité du phénotype de sénescence. Dans la première partie de ce travail, nous abordons la fonction de méthylation de H4K20 et H3K9, dans le contexte des foyers d'hétérochromatine associés à la sénescence (SAHF: senescence-associated heterochromatin foci). Nous démontrons que l'intégration de H4K20me3 dans les SAHF dépend de l'incorporation précédente de H3K9me3 et révélons les méthyltransférases H4K20 impliquées dans ce processus. Nous proposons un mécanisme moléculaire par lequel H4K20me3 et H3K9me3 coopèrent avec p53 dans la répression stable des gènes cibles de E2F au cours de la sénescence induite par l'oncogène Ras. Dans la deuxième partie de la thèse, nous présentons une voie de dégradation lysosomale (c'est-à-dire l'autophagie médiée par des chaperons) en tant que nouveau mécanisme potentiel par lequel les cellules modulent les niveaux de KDM4A pendant la sénescence. Nos résultats suggèrent que la méthylation dans les lysines des histones régule la stabilité de sénescence en réponse à l'oncogène Ras et révèlent le potentiel d'induction de la sénescence par inhibition ciblée de KDM4A dans le traitement du cancer. / Cellular senescence and apoptosis have evolved as potent protective barriers against neoplastic transformation. Senescence is a state of stable arrest of proliferation in which cells remain metabolically active. Cellular senescence is triggered by different sources of stress, including activated oncogenes, telomere dysfunction, DNA damage and replication defects elicited by genotoxic agents, reactive oxygen species, etc. This complex process engages two different tumor suppressor pathways, the p53/p21 and p16INK4a/pRb pathways that need to be compromised in human cells in order to circumvent the senescence-associated growth halt. Hence, describing the relationship between oncogene activation, senescence-induced proliferation arrest and escape from the senescence state remains essential to understand tumorigenesis. KDM4A is a member of the KDM4 sub-family of Jumonji lysine demethylases targeting di- and tri-methylated histone H3 lysine 9 (H3K9) and histone H3 lysine 36 (H3K36). The first three sub-family members KDM4A, KDM4B and KDM4C are also able to bind histone 4 lysine 20 di-methyl/tri-methyl (H4K20me2/3) and histone 3 lysine 4 tri-methyl (H3K4me3), via their tandem Tudor domain. KDM4A negatively modulates the activity of the p53 pathway, by directly targeting the tumor suppressor CHD5, and is also a negative regulator of the DNA damage response. KDM4A expression levels are often elevated in cancer cells and decreased during cellular senescence. The principal motivation for this thesis is to expand our current knowledge on how chromatin reorganization influences the stability of the senescence phenotype. In the first part of this work we address the function of H4K20 and H3K9 methylation, in the context of the senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). We demonstrate that integration of H4K20me3 into the SAHF depends on the previous incorporation of H3K9me3 and reveal the H4K20 methyltransferases involved in this process. We propose a molecular mechanism by which H4K20me3 and H3K9me3 cooperate with p53 in the stable repression of E2F target genes during oncogenic Ras-induced senescence. In the second part of the thesis we present a lysosomal-degradation pathway (i.e. chaperone-mediated autophagy) as a novel potential mechanism by which cells modulate KDM4A protein levels during senescence. Our results strongly suggest that histone lysine methylation contributes to the stability of the senescence response to the Ras oncogene and reveal the potential of senescence induction by targeted inhibition of KDM4A in the treatment of cancer.

Die Entstehung und Progression maligner Tumoren ist ein mehrstufiger Prozeß, der auf einer Vielzahl genetischer Alterationen beruht. Essentielle Schritte sind die Aktivierung von Proto-Onkogenen und die Inaktivierung von Tumor-Suppressorgenen. Infolge dessen können die Zellen unabhängig von externen Wachstumssignalen ungebremst proliferieren, die Apoptose wird gehemmt, die Angiogenese wird aktiviert, und es kommt schließlich zur Metastasierung. Zu den bekanntesten Proto-Onkogenen, die in humanen Tumoren aktiviert werden, gehören die RAS Gene. Sie sind in einer Vielzahl von Tumoren mutiert und führen zu einer Stimulation der Proliferation. Um den Einfluß aktivierter RAS Onkogene auf die Regulation der Genexpression zu untersuchen wurden Genexpressionsprofile in Zellkultur-Modellen und humanen Tumoren erstellt. In einem Fibroblasten- und einem Epithelzell-basierten System konnten mehrere hundert, RAS-abhängig differenziell exprimierte Genen identifiziert werden. Aufgrund der bekannten Funktionen ihrer Genprodukte spielen sie eine wichtige Rolle im Verlust der Zellzyklus-Kontrolle, der Kontrolle der Signalübertragung, in der Angiogenese-Induktion sowie in der Invasion und damit Metastasierung. Die Zusammenhänge zwischen der Aktivierung bestimmter Signalkaskaden wie z.B. Raf-Mek-Erk oder PI-3K und der Expression von definierten Genmustern wurden hergestellt. Weiterhin konnte mit Hilfe von Microarray Analysen eine Vielzahl potentieller Tumormarker und Zielgene für therapeutische Intervention im Ovarialkarzinom identifiziert werden. Die Rolle der KlasseII Tumorsuppressor Gene Caveolin-1 und H-REV107-1 in humanen Ovarialkarzinomen wurde detailliert untersucht und ihre Rolle in der Regulation des Zellüberlebens nachgewiesen. Caveolin-1, ein negativer Regulator der RAS-abhängigen Signalübertragung, wird in über 80% der untersuchten humanen Ovarialkarzinome gehemmt. Hierbei spielen epigenetische Mechanismen eine Rolle, die jedoch nicht Caveolin-1 selbst, sondern einen unbekannten Regulator des Caveolin-1 Gens betreffen. Das H-REV107-1 Gen, ein Wachstumsregulator mit unbekannter Funktion wird in ca. 50% der untersuchten Ovarialkarzinome nicht mehr exprimiert. Ähnlich wie bei Caveolin-1, führt eine gezielte Expression des Gens in Tumorzellen zur Apoptose. Die Suche nach Interaktionspartnern des H-REV107-1 Gens führte zur Identifizierung der ubiquitär exprimierten Phosphatase2A (PP2A). Die Bindung zwischen H-REV107-1 und PP2A wurde weiter charakterisiert und ihre Rolle in der H-REV107-1 vermittelten Apoptose analysiert. / Development and progression of human tumours is a multistep process depending on numerous genetic alterations. Essentiell steps herein are the mutational activation of oncogenes and the inactivation of tumour suppressor genes. As a result of these alterations, the cells acquire the potential of unlimited growth independent of external growth factor signals, apoptosis is diminished, angiogenesis is stimulated and finally metastasis can occur. Among the best known proto-oncogenes, mutated in a number of human tumours, are the RAS genes. To investigate the role of RAS oncogenes in transformation-related transcriptional alterations, expressionsprofiling was performed from cell culture models and human tumours. Several hundred genes were identified to be de-regulated in a RAS-dependent manner in a fibroblast and an epithelial cell-based model. The protein products encoded by these genes play important roles in the loss of cell cycle control, control of signal transduction, angiogenesis induction as well as invasion and metastasis. Groups of de-regulated genes could be assigned to distinct signaling pathways such as the Raf-Mek-Erk or the PI-3 kinase dependent pathways. In addition, a number of potential tumour markers and potential target structures for therapeutic intervention were identified in ovarian carcinomas with the help of microarray studies. The role of the class II tumor suppressor genes Caveolin-1 and H-REV107-1 in human ovarian carcinomas was further investigated and their role in the regulation of cell survival was demonstrated. Caveolin-1, a negative regulator of RAS-dependent signal transduction, is supressed in more than 80% of the ovarian carcinomas analysed. This suppression is mediated by epigenetic mechanisms which due not target Caveolin-1 itself but an unknown regulator of the Caveolin-1 gene. The H-Rev107-1 gene, a growth regulator with unknown function, is no longer expressed in nearly 50% of the ovarian carcinomas analysed. Similar to Caveolin-1, also re-expression of H-REV107-1 results in apoptosis in the tumour cells. The search for proteins interacting with H-REV107-1 led to the identification of the ubiquitously expressed phosphatase 2A (PP2A). The interaction between H-REV107-1 and PP2A was further characterised and its role in the H-REV107-1 mediated apoptosis investigated.

L'apoptose lymphocytaire joue un rôle essentiel dans le contrôle de la réponse immunitaire et de la prolifération cellulaire. De nombreuses voies interviennent dans sa régulation, dont certaines dépendantes de l’oncogène RAS. Un défaut d'apoptose lymphocytaire induit l'apparition de maladies auto-immunes et lympho-prolifératives comme l'Autoimmune LymphoProliferative Syndrome (ALPS). L'ALPS fait suite à des anomalies du principal récepteur membranaire de mort FAS, pivot de l'apoptose lymphocytaire. Le RAS-Associated Lymphoproliferative Disease (RALD) est une entité décrite récemment, se rapprochant de l'ALPS par la symptomatologie et la physiopathologie sous-jacente. Cependant, dans le RALD, le défaut d'apoptose lymphocytaire n’est pas lié à des mutations de FAS mais à une hyperactivation de la voie RAS, mettant ainsi en lumière le rôle essentiel de cette voie dans la régulation du processus en question. Dans les Leucémies Myélo-Monocytaires Juvéniles Chroniques (JMML), les mêmes mutations que celles observées dans les RALD sont trouvées, sur les mêmes populations cellulaires. Il existe une hétérogénéité clinique et biologique au sein des JMML, certaines étant indolentes (LS-JMML) et d'autres sévères (S-JMML). A cette hétérogénéité au sein même des JMML s'ajoute celle observée entre JMML et RALD. L'objectif de ce travail a été de comprendre les tenants des différences phénotypiques observées, au travers du scope de l'apoptose des lymphocytes T activés, en comparant les trois entités résultant de mutations activatrices de RAS dans des cellules pluripotentes hématopoïétiques : RALD, LS-JMML et S-JMML. Nous rapportons des conséquences distinctes pour des mutations identiques ou équivalentes, avec différentes voies de l'apoptose touchées, différenciant les phénotypes induits. Ce travail a permis de démontrer que l’hyperactivation de la voie RAS seule n’entraîne pas nécessairement une dérégulation de la réponse immunitaire T. Des événements additionnels aux mutations présentes sont nécessaires au développement des symptômes. Ces événements ont bien des conséquences sur l'apoptose lymphocytaire, au niveau post-traductionnel, qu’ils concernent la voie RAS ou non. Les différences observées entre les trois phénotypes sur le plan expérimental pourraient être une aide au pronostic. De plus, ce travail ouvre la voie à l'identification en détails des facteurs additionnels et voies défaillantes et permettrait ainsi d'obtenir des thérapeutiques spécifiques actuellement inexistantes. / Lymphocytes apoptosis is essential in maintaining homeostasis and avoiding abnormal proliferation. When defective, autoimmune diseases as the Autoimmune LymphoProliferative Syndrome (ALPS), due to mutations of the death receptor FAS, can occur. Several pathways are important actors influencing the apoptosis cascade, including the RAS proto-oncogene signaling. The RAS Associated Lymphoproliferative Disease (RALD) is a newly described entity, similar to ALPS but with RAS mutations instead of FAS mutations, enlightening the primary role of RAS in apoptosis regulation. Interestingly, the same RAS mutations as observed in RALD are also the cause of a malignant proliferation, the Juvenile Myelo Monocytic Leukemia (JMML). In the case of JMML, RAS mutations can lead either to a mild (LS-JMML) or a severe (S-JMML) phenotype. Thus, three different phenotypes can be caused by the same oncogenic RAS mutations. In order to better understand and characterize the influence of oncogenic RAS mutations in lymphocytes’ apoptosis we studied it in patients presenting with RALD, LS-JMML and JMML. We showed that isolated RAS hyperactivity is not sufficient to induce an immune deregulation. Additional factors are required to do so. These factors influence both mitochondrial and extrinsic apoptosis pathways at a post-transcriptional level. They are due to probable genetic events, and their identification can lead to new therapeutic strategies. Furthermore, activated lymphocytes’ in vitro apoptosis assessment can help differentiating the three phenotypes and thus facilitate prognosis prediction.