A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agroindustriais do Brasil. Como outras culturas de importância econômica, é também afetada por diversos patógenos como fungos, bactérias, vírus e fitoplasmas que podem limitar sua produção. A bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é o agente causal do raquitismo-da-soqueira da cana-de-açúcar (RSD). Esta doença não apresenta sintomas externos característicos de fácil reconhecimento. Dessa forma, a incidência do RSD pode não ser perceptível durante inspeções visuais de campo e, assim, ser facilmente disseminado de uma região para outra. A bactéria restrita ao xilema é transmitida mecanicamente de plantas infectadas para plantas saudáveis por meio da seiva presente em ferramentas de corte e em outros equipamentos durante o plantio, o cultivo e a colheita da cultura. Em razão da importância da cana-de-açúcar e do dano causado por Lxx, este trabalho visou avaliar a termoterapia e o cultivo in vitro em dois experimentos direcionados à obtenção de plantas de cana-de-açúcar da variedade SP80-3280 livres de Leifsonia xyli subsp. xyli e, assim, fornecer subsídio para o aprimoramento das medidas atuais de controle. O primeiro experimento combinou a termoterapia de toletes de uma gema (52 °C por 30 minutos) com o cultivo de meristemas apicais de três tamanhos (0,5 mm, 1,0 mm e 1,5 mm); o segundo combinou três tempos de termoterapia (1 hora, 2 horas e 3 horas) a 50 °C em gemas laterais imaturas isoladas do tolete com o cultivo in vitro. No primeiro experimento, os resultados de RT-PCR das amostras coletadas aos 15 dias na casa de vegetação mostraram que os três tamanhos de meristemas produziram plantas com títulos bacterianos em média 25 vezes mais baixos que suas genitoras, mas não as isentaram completamente de Lxx, com exceção de 8 plantas que não apresentaram Lxx com 90 dias de cultivo (4 plantas provenientes do cultivo de meristemas de 0,5 mm, 1 planta de meristema de 1,0 mm e 3 plantas de meristemas de 1,5 mm). Além disso, os meristemas de 0,5 mm não necessariamente regeneraram plantas com títulos mais baixos da bactéria quando comparados com os meristemas de 1,0 mm e 1,5 mm, mostrando que estes tamanhos testados não apresentaram correlação direta com o nível de infecção da planta regenerada por eles. Em relação ao segundo experimento, os resultados de RT-PCR mostraram que o incremento no tempo de termoterapia proporcionou maior redução nos títulos bacterianos, sendo os tratamentos de 2 horas e 3 horas os mais bem sucedidos com média de redução de 80,08% e 81,73%, respectivamente, mas não foi capaz de eliminar a bactéria. Portanto, estes experimentos demonstram que a termoterapia associada ao cultivo de tecidos é uma metodologia promissora, pois apresentaram redução da presença da bactéria Lxx em plantas de cana-de-açúcar, mas por não terem sido totalmente efetivos na eliminação da mesma, reforça a necessidade de estudos complementares. / Sugarcane is one of the major agro-industrial crops of Brazil. Like other crops of economic importance, it\'s also affected by several pathogens such as fungus, bacteria, viruses and phytoplasmas that may limit its production. The fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is the causal agent of ratoon stunting disease in sugarcane (RSD). This disease shows no external symptoms characteristic of easy recognition. Thus, the incidence of RSD may not be noticeable during visual inspection in the field and be easily spread from one region to another. The xylem-limited bacterium is transmitted mechanically from infected plants to healthy plants by the sap present in cutting tools and others equipments for planting, growing and harvesting the crop. Due to the importance of sugarcane and the damage caused by Lxx, this work aimed to evaluate thermotherapy and in vitro culture in two experiments in order to obtain sugarcane plants of variety SP80-3280 free from Leifsonia xyli subsp. xyli and thus provide subsidy for the improvement of current control methods. The first experiment combined thermotherapy on the individual bud (52 °C for 30 minutes) and the cultivation of apical meristems of three sizes (0,5 mm, 1,0 mm and 1,5 mm); the second combined three period of thermotherapy (1 hour, 2 hours and 3 hours) at 50 °C in immature lateral buds totally isolated from the tissue source followed by in vitro culture. In the first experiment, the results of RT-PCR samples collected at 15 days in the greenhouse showed that the three sizes of meristems produced plants with bacterial titers on average 25 times lower than their mother plants, but not completely exempted them from Lxx, except 8 plants that showed no Lxx after 90 days of cultivation (4 plants were from cultivation of meristems with 0,5 mm, 1 plant from 1,0 mm meristem and 3 plants from 1,5 mm meristems size). Furthermore, the meristems of 0,5 mm does not necessarily regenerate plants with lower title of the bacteria compared with the meristems of 1.0 mm and 1.5 mm, showing that these sizes tested did not present direct correlation with the level of infection on the plants regenerated from them. Regarding the second experiment, RT-PCR results showed that the increase in time of thermotherapy provided greater reduction in bacterial titers, and the treatments of 2 and 3 hours were the most successful with average reduction of 80,08 % and 81,73%, respectively, but was not able to eliminate the bacteria. Therefore, these experiments showed that thermotherapy associated with tissue culture is a promising methodology because it reduced titer of Lxx in sugarcane, but were not fully effective in eliminating the same, reinforcing the need for complementary studies.

O Brasil, maior produtor mundial de cana-de-açúcar, produzirá cerca de 642 milhões de toneladas em 9 milhões de hectares plantados da cultura na safra 2014/2015. A cana-de-açúcar, assim como a maioria das culturas semi-perenes, naturalmente perde produtividade ao longo dos cortes e o setor canavieiro se preocupa com a longevidade dos canaviais, que é limitado, entre outros fatores, por doenças bióticas. O raquitismo das soqueiras (Ratoon Stunting Disease - RSD) é considerada a doença mais importante da cultura por causar significativas perdas em produtividade. O agente causal do RSD é a bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx); o gênero é cosmopolita e apresenta inúmeras espécies. No entanto, a subespécie Lxx tem como único hospedeiro natural conhecido a cana-de-açúcar. O estudo de hospedeiros alternativos deste patógeno reveste-se de importância pela possibilidade de outras espécies servirem como fonte de inóculo para a cana-de-açúcar e também pela possibilidade da descoberta de um hospedeiro experimental que permita o estudo do RSD em condições experimentais mais favoráveis do que a cana-de-açúcar. O presente trabalho realizou um levantamento de possíveis hospedeiros alternativos de Lxx cultivados a partir de sementes ou coletados em áreas de cultivo de cana-de-açúcar empregando pares de primers desenvolvidos especificamente para a bactéria. O trabalho também objetivou analisar o desenvolvimento de três genótipos de sorgo após inoculações artificiais com Lxx. A bactéria não foi detectada em todos os vinte e sete hospedeiros analisados, sendo vinte e duas espécies de gramíneas, confirmando que seu único hospedeiro é a cana-de-açúcar. Por outro lado, Lxx infectou as três espécies de sorgo e causou significativa redução tanto em altura como em diâmetro das plantas comparado a plantas não infectadas. Conclui-se, portanto, que Lxx não coloniza naturalmente várias gramíneas, no entanto diferentes genótipos de sorgo podem ser usados como hospedeiros experimentais para estudos de RSD. / Brazil is the main world producer of sugarcane, with a predicted production of 642 million tons in approximately 9 million hectares in the 2014/2015 harvest. As most semi-perennial crops, its productivity is reduced along successive cropping (ratoons). Thus, increasing the longevity of sugarcane crops, which is limited by biotic diseases, is an important goal for Brazil´s sugar industry. Ratoon stunting disease (RSD) is considered the most important disease of sugarcane because it causes significant losses in productivity. RSD is caused by the bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), a cosmopolitan genus with numerous species. However, to date sugarcane is the only known natural host of this pathogen. Identifying alternative hosts of Lxx is important not only because they might represent an additional source of inoculum but also because some might represent a better working model to the study of RSD than sugarcane. This study carried out a PCR-based screening of potential Lxx hosts with primers developed to specifically detect Lxx, using as source seeds or plant specimens collected in sugarcane fields. The effect of artificial inoculations of Lxx on the growth of three sorghum cultivars was also analyzed. Lxx was not detected in all twenty-seven alternative hosts tested, out of which twenty represented grass species, thus confirming the specificity of the Lxx-sugarcane relationship. In addition, Lxx infected the three sorghum genotypes and significantly reduced their height and diameter when compared to non-infected plants. It is concluded that Lxx does not infect other grass species; however sorghum genotypes can be used as experimental hosts in the study of RSD.

A cana-de-açúcar (Saccharum ssp.) é uma das culturas agrícolas mais importantes da história da humanidade. Foi em Nova Guiné, seu provável centro de origem, que o homem teve o primeiro contato com a planta em seu estado silvestre. Atualmente, o Brasil lidera a lista dos 80 países produtores de cana-de-açúcar. É o primeiro também em exportação de seus derivados, seguido, respectivamente, pela Austrália, Tailândia, Guatemala e África do Sul. A área plantada no Brasil está próxima dos 7 milhões de hectares. A cana-de-açúcar, assim como a grande diversidade de culturas de interesse agronômico, é hospedeira de uma série de patógenos que podem limitar sua produção, dentre os quais, destaca-se a bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli, agente causal do raquitismo-da-soqueira (RSD). O RSD é considerado uma das mais importantes doenças da cana-de-açúcar que limita a produção no mundo todo e seu controle está fundamentado na adoção de um conjunto de medidas preventivas, pois poucas são as informações sobre materiais resistentes à doença e não existe um produto químico que a controle eficientemente. Historicamente, a dificuldade do diagnóstico do RSD, na maioria dos casos, é conseqüência da ausência de sintomas externos e pela não ocorrência de sintomas internos em determinados cultivares de cana-de-açúcar e neste sentido, técnicas de imunologia, molecular e de microscopia de contraste de fases têm sido bastante empregadas. A hipótese da possível correlação entre a anatomia vascular e a resistência de plantas a patógenos, é um assunto freqüentemente discutido por pesquisadores e poderia elucidar os mecanismos envolvidos na resistência da planta ao patógeno. Assim, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar a resistência/suscetibilidade de 10 variedades comerciais de canade- açúcar RB, mais a variedade CB 49-260 incluída como padrão suscetível, correlacionando os danos apresentados por análises de componentes de produção tecnológicos e biométricos amostrados no campo, com a morfologia e quantificação de conjunto de feixes vasculares e os níveis de infecção detectados nos diagnósticos. Os resultados mostraram que as variedades RB 72 454, RB 83 5486, RB 86 7515, RB 92 8064, RB 92 5211, RB 92 5345 e RB 92 5268 comportaram-se como variedades suscetíveis. A RB 85 5156 comportou-se como variedade de resistência intermediária As variedades RB 85 5536 RB 85 5453, comportaram-se como tolerantes. Os danos apresentados tiveram relação direta com as concentrações do patógeno inoculadas no início do experimento, ou seja, quanto maior a concentração de inóculo, maiores foram os danos ocorridos nas variedades menos tolerantes. Contudo, não há correlações entre o tamanho médio do metaxilema e o número de feixes vasculares por área com a resistência da planta. / Sugarcane (Saccharum ssp.) is one of the most important cultures in the history of the humanity. The center of origin is probably New Guinea, where people had the first contact with the plant in wild state. Presently, Brazil leads the list of the 80 sugarcane producing countries. Brazil is also the first in exporting sugarcane by-products, followed by Australia, Thailand, Guatemala and South Africa, respectively. The are grown in Brazil ranges 7 million hectares. As well as a great diversity of cultures of agronomical interest, sugarcane is host of a large number of pathogens which can limit its production. Among them, one can emphasize, Leifsonia xyli subsp. xyli, causal agent of ratoon stunting disease (RSD). RSD is considered one of the most important diseases of sugarcane limiting yield worldwide and the control is based on the adoption of a set of preventative measures, since the information about resistant materials and efficient chemical products are scarce. Historically, RSD diagnosis has been difficult because there are no definitive external symptoms and internal symptoms do not develop adequately in all varieties. Serological, molecular and microscopy techniques have been widely used to diagnose RSD. The hypothesis of the possible correlation among vascular anatomy and plant resistance has been discussed by researchers and could elucidate the resistance mechanisms involved in the resistance of plants to the pathogens. Thus, the overall objective of the present study was to evaluate the resistance/susceptibility of 10 RB sugarcane commercial varieties including CB 49-260 as a susceptible standard, correlate the damages presented by the analysis of technological and biometric production components of field samples, with the morphology and quantification of set of vascular bundles and the level of infections detected on the diagnostics. The results showed that varieties RB 72 454, RB 83 5486, RB 86 7515, RB 92 8064, RB 92 5211, RB 92 5345 and RB 92 5268 were susceptible. RB 85 5156, had a intermediary resistance and varieties RB 85 5536 and RB 85 5453 both showed tolerant behavior. The injuries presented had a direct relationship with the inoculum concentration, in other words, the higher the inoculum concentration the higher the injuries with the less tolerant varieties. However, there is no correlation between the average length of the metaxilem and the number of vascular bundles per area in plant resistance.

A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) é uma das mais importantes culturas agrícolas. Cultivada em mais de 127 países, a cultura se apresenta como um dos alicerces para a socioeconomia e cultura de muitas regiões do Brasil e do mundo. Sua produtividade depende de diversos fatores, sendo esses atendidos pela intensa hibridação interespecífica visando principalmente à obtenção de cultivares mais produtivas, precoces e resistentes a diversos tipos de estresses. Entre os estresses, os causados por microorganismos são os mais relevantes e, dentre estes, destaca-se o agente causal da doença raquitismo da soqueira da cana-de-açúcar, a bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx). O estudo mais aprofundado sobre esta relação patógenohospedeiro é difícil, visto que Lxx é uma bactéria fastidiosa de difícil cultivo. O sequenciamento completo de seu genoma abriu a oportunidade de se entender às causas fisiológicas da dificuldade do seu cultivo. Assim, os objetivos deste trabalho foram otimizar um meio de cultura para Lxx com base em análise de vias metabólicas importantes e estudar a expressão diferencial de seus genes quando esta é cultivada na presença e ausência de metionina. Análises bioinformáticas do genoma de Lxx indicaram que esta está apta a utilizar diversas fontes de carbono, de vitaminas, de ferro e aminoácidos. De fato, dentre as fontes de carbono testadas verificou-se o crescimento de Lxx utilizando manose, frutose e galactose, embora em menor eficiência do que glicose. Observou-se também a utilização das vitaminas cobalamina, tiamina, biotina e complexo vitamínico de Nitsch, sendo que o acréscimo destes elementos resultou numa maior taxa de crescimento de Lxx. Verificou-se também que Lxx está apta a utilizar citrato, sulfato e cloreto de ferro como fontes deste metal, mas em menor eficiência que quando comparada a hemina bovina. Com estes resultados, verificamos que a adição do aminoácido metionina (1 g/L) e das vitaminas D-biotina (0,01 g/L) e cloreto de tiamina (0,01 g/L) obtém-se um desenvolvimento mais acelerado, em média 30%. Na análise da expressão gênica na presença da metionina, verificou-se uma regulação diferencial de 114 genes, sendo que destes 95 foram regulados positivamente e 19 negativamente. Os resultados indicam que Lxx necessita de metionina e que ela utiliza esse aminoácido como uma possível fonte de nitrogênio. Indicaram também que maior crescimento na presença de metionina está relacionado a uma regulação gênica positiva de genes do metabolismo central. / Sugarcane (Saccharum officinarum L.) is one of the most important tropical crops. Cultivated in more than 127 countries, it is of importance both for the social economy and culture of many regions of Brazil and of the world. Its productivity depends on diverse factors that are dealt with the intense interspecific hybridization aiming for more productive cultivars, that are resistant to diverse types of stress. Of these, stresses caused by microorganisms are the most relevant and among these the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), the causal agent of the ratoon stunting disease is one of the most important. The study of this patosystem, however, is very difficult, since Lxx is a fastidious bacterium. The availability of the complete genome sequence of Lxx made possible the understanding of the physiological causes of its fastidious behavior. Thus, the objectives of this work were to optimize the culture medium of Lxx by analyzing important pathways and to study gene expression when Lxx is cultivated in the presence and absence of methionine. Bioinformatic analyzes of the Lxx genome indicated that it is capable to use diverse sources of carbon, vitamins, metals, iron and amino acids. In fact Lxx was able to grow in the presence of mannose, fructose and galactose as the main sugar components of the medium, but not so efficiently as in glucose. It was also observed that the addition of the vitamins cobalamin, thiamin, biotin and the Nitsch´s vitamin complex resulted in a better Lxx growth. It was also verified that Lxx is capable to use iron citrate, iron sulphate and iron chloride as the main sources of iron, but less efficiently than when compared to hemin bovine chloride. With these results, it was verified that the addition of methionine (1 g/L) and of the vitamins D-biotin (0.01 g/L) and thiamine chloride (0.01 g/L) resulted in a faster growth of Lxx in vitro by as much as 30% on average compared to the standard medium. Gene expression analyses showed that the addition of methionine to the medium resulted in an alteration of expression levels of 114 genes, 95 of which were up regulated and 19 otherwise. This result indicated that Lxx needs an outside source of methionine and that it uses this amino acid a source of nitrogen. Also, it indicated that the improved growth in the presence of methionine is highly correlated with up regulation of genes of the central metabolism pathways.

Este estudo avaliou os efeitos de extratos de culturas líquidas de Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) cultivada sob condições de estresse osmótico e na presença de inibidores da rota não-mevalonato (MEP/DOXP) de síntese de pigmentos isoprenóides, na germinação de sementes de alface. Também avaliou a relação entre o efeito tóxico dos extratos e a produção de pigmentos pela bactéria. Os extratos foram obtidos do sobrenadante de culturas de Lxx usando acetato de etila como solvente. Ensaios com sementes de alface embebidas nos extratos indicaram uma ação inibitória na germinação das sementes e no alongamento das radículas quando a bactéria foi cultivada na presença de 7% de PEG 6000 ou 100 mM de NaCl. O extrato foi submetido a vários tratamentos térmicos (temperatura ambiente; 30, 60 e 90oC em banho-maria e 121oC por autoclavagem) e sua ação inibitória em sementes mostrou-se termoestável. A presença de pigmentos isoprenóides de células cultivadas com PEG ou NaCl e de células incubadas sem estes agentes estressantes foi avaliada por espectrofotometria após extração dos pigmentos com metanol. Em células cultivadas na ausência de estresse, notou-se um pico de absorbância bem definido no comprimento de onda de 400 nm, ao passo que este pico foi sensivelmente reduzido em células cultivadas sob estresse. Esse efeito foi mais pronunciado na presença de PEG. Para confirmar a natureza isoprenóide do composto, Lxx foi cultivada na presença de fosmidomicina ou difenilamina, que são inibidores da rota metabólica não-mevalonato destes compostos em Microbacteriaceae. Ambas as substâncias reduziram o pico de absorbância no espectro em relação a células cultivadas sem adição destes antibióticos, confirmando a natureza do composto e sua via de síntese. No entanto, a redução foi mais acentuada no caso da fosmidomicina. Por fim, a fosmidomicina foi utilizada com a finalidade de verificar seu efeito na toxidez dos extratos. Foi observado que o efeito tóxico do extrato foi reduzido quando Lxx foi cultivada na presença do inibidor. Ao se avaliar o conteúdo das células, notou-se também redução expressiva no conteúdo relativo de compostos isoprenóides, como esperado. Os resultados indicaram que a bactéria secreta um produto cuja ação é similar à do ABA e que há uma correlação entre a produção do mesmo e a síntese de pigmentos isoprenóides. Em conjunto, o estudo dá suporte à hipótese levantada anteriormente por Monteiro- Vitorello et al. (2004) com base em análise in silico do genoma de Lxx, segundo a qual a bactéria estaria apta a secretar um composto análogo ao ácido abscísico (ABA). / This study evaluated the effects of extracts of liquid cultures of Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) grown under osmotic stress and in the presence of inhibitors of the non-mevalonate pathway (MEP/DOXP) of synthesis of isoprenoid pigments on the germination of lettuce seeds. The relationship between the extracts toxic effect and the production of pigments was evaluated as well. The extracts were obtained from the supernatant of Lxx cultures using ethyl acetate as a solvent. Essays with lettuce seeds soaked in the extracts indicated an inhibitory action on germination and on the elongation of the radicles when the bacterium was cultivated in the presence of 7% PEG 6000 or 100 mM NaCl. The extract was submitted to different thermal treatments (room temperature; 30, 60 and 90oC water bath and 121oC autoclaving) and its inhibitory action was shown to be thermostable. The presence of isoprenoid pigments in cells cultivated with PEG, NaCl or in the absence of these stressing agents was evaluated by spectrophotometry after extracting the pigments with methanol. In cells incubated in the absence of stress, a well-defined absorbance peak at 400 nm wavelength was noted, whereas this peak was sensibly reduced in cells cultivated under stress. This effect was more pronounced in the presence of PEG. To confirm the isoprenoid nature of the compound, Lxx was incubated in the presence of fosmidomycin and diphenylamine, which are inhibitors of the nonmevalonate metabolic pathway of these compounds in Microbacteriaceae. Both substances reduced the absorbance peak in the spectrum compared to cells cultivated in the absence of these antibiotics, confirming the nature of the compound and its synthesis pathway. Moreover, the peak reduction was more accentuated in the presence of fosmidomycin. Lastly, fosmidomycin was used to evaluate its effect on the toxicity of the extracts. It was observed that the toxic effect of the extract was reduced when Lxx was cultivated in the presence of this inhibitor. When the cell content was evaluated, an expressive reduction on the relative content of carotenoid compounds has also been noticed, as expected. The results indicated that the bacterium secretes a compound whose action is similar to ABA and that there is a correlation between the production of this compound and the synthesis of isoprenoid pigments. The results support the hypothesis proposed earlier by Monteiro-Vitorello et al. (2004) based upon an in silico analysis of the genome of Lxx, according to which the bacterium would be able to secrete a compound analogous to abscisic acid (ABA)

Este estudo avaliou os efeitos de extratos de culturas líquidas de Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) cultivada sob condições de estresse osmótico e na presença de inibidores da rota não-mevalonato (MEP/DOXP) de síntese de pigmentos isoprenóides, na germinação de sementes de alface. Também avaliou a relação entre o efeito tóxico dos extratos e a produção de pigmentos pela bactéria. Os extratos foram obtidos do sobrenadante de culturas de Lxx usando acetato de etila como solvente. Ensaios com sementes de alface embebidas nos extratos indicaram uma ação inibitória na germinação das sementes e no alongamento das radículas quando a bactéria foi cultivada na presença de 7% de PEG 6000 ou 100 mM de NaCl. O extrato foi submetido a vários tratamentos térmicos (temperatura ambiente; 30, 60 e 90oC em banho-maria e 121oC por autoclavagem) e sua ação inibitória em sementes mostrou-se termoestável. A presença de pigmentos isoprenóides de células cultivadas com PEG ou NaCl e de células incubadas sem estes agentes estressantes foi avaliada por espectrofotometria após extração dos pigmentos com metanol. Em células cultivadas na ausência de estresse, notou-se um pico de absorbância bem definido no comprimento de onda de 400 nm, ao passo que este pico foi sensivelmente reduzido em células cultivadas sob estresse. Esse efeito foi mais pronunciado na presença de PEG. Para confirmar a natureza isoprenóide do composto, Lxx foi cultivada na presença de fosmidomicina ou difenilamina, que são inibidores da rota metabólica não-mevalonato destes compostos em Microbacteriaceae. Ambas as substâncias reduziram o pico de absorbância no espectro em relação a células cultivadas sem adição destes antibióticos, confirmando a natureza do composto e sua via de síntese. No entanto, a redução foi mais acentuada no caso da fosmidomicina. Por fim, a fosmidomicina foi utilizada com a finalidade de verificar seu efeito na toxidez dos extratos. Foi observado que o efeito tóxico do extrato foi reduzido quando Lxx foi cultivada na presença do inibidor. Ao se avaliar o conteúdo das células, notou-se também redução expressiva no conteúdo relativo de compostos isoprenóides, como esperado. Os resultados indicaram que a bactéria secreta um produto cuja ação é similar à do ABA e que há uma correlação entre a produção do mesmo e a síntese de pigmentos isoprenóides. Em conjunto, o estudo dá suporte à hipótese levantada anteriormente por Monteiro- Vitorello et al. (2004) com base em análise in silico do genoma de Lxx, segundo a qual a bactéria estaria apta a secretar um composto análogo ao ácido abscísico (ABA). / This study evaluated the effects of extracts of liquid cultures of Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) grown under osmotic stress and in the presence of inhibitors of the non-mevalonate pathway (MEP/DOXP) of synthesis of isoprenoid pigments on the germination of lettuce seeds. The relationship between the extracts toxic effect and the production of pigments was evaluated as well. The extracts were obtained from the supernatant of Lxx cultures using ethyl acetate as a solvent. Essays with lettuce seeds soaked in the extracts indicated an inhibitory action on germination and on the elongation of the radicles when the bacterium was cultivated in the presence of 7% PEG 6000 or 100 mM NaCl. The extract was submitted to different thermal treatments (room temperature; 30, 60 and 90oC water bath and 121oC autoclaving) and its inhibitory action was shown to be thermostable. The presence of isoprenoid pigments in cells cultivated with PEG, NaCl or in the absence of these stressing agents was evaluated by spectrophotometry after extracting the pigments with methanol. In cells incubated in the absence of stress, a well-defined absorbance peak at 400 nm wavelength was noted, whereas this peak was sensibly reduced in cells cultivated under stress. This effect was more pronounced in the presence of PEG. To confirm the isoprenoid nature of the compound, Lxx was incubated in the presence of fosmidomycin and diphenylamine, which are inhibitors of the nonmevalonate metabolic pathway of these compounds in Microbacteriaceae. Both substances reduced the absorbance peak in the spectrum compared to cells cultivated in the absence of these antibiotics, confirming the nature of the compound and its synthesis pathway. Moreover, the peak reduction was more accentuated in the presence of fosmidomycin. Lastly, fosmidomycin was used to evaluate its effect on the toxicity of the extracts. It was observed that the toxic effect of the extract was reduced when Lxx was cultivated in the presence of this inhibitor. When the cell content was evaluated, an expressive reduction on the relative content of carotenoid compounds has also been noticed, as expected. The results indicated that the bacterium secretes a compound whose action is similar to ABA and that there is a correlation between the production of this compound and the synthesis of isoprenoid pigments. The results support the hypothesis proposed earlier by Monteiro-Vitorello et al. (2004) based upon an in silico analysis of the genome of Lxx, according to which the bacterium would be able to secrete a compound analogous to abscisic acid (ABA)

A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) é uma das mais importantes culturas agrícolas. Cultivada em mais de 127 países, a cultura se apresenta como um dos alicerces para a socioeconomia e cultura de muitas regiões do Brasil e do mundo. Sua produtividade depende de diversos fatores, sendo esses atendidos pela intensa hibridação interespecífica visando principalmente à obtenção de cultivares mais produtivas, precoces e resistentes a diversos tipos de estresses. Entre os estresses, os causados por microorganismos são os mais relevantes e, dentre estes, destaca-se o agente causal da doença raquitismo da soqueira da cana-de-açúcar, a bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx). O estudo mais aprofundado sobre esta relação patógenohospedeiro é difícil, visto que Lxx é uma bactéria fastidiosa de difícil cultivo. O sequenciamento completo de seu genoma abriu a oportunidade de se entender às causas fisiológicas da dificuldade do seu cultivo. Assim, os objetivos deste trabalho foram otimizar um meio de cultura para Lxx com base em análise de vias metabólicas importantes e estudar a expressão diferencial de seus genes quando esta é cultivada na presença e ausência de metionina. Análises bioinformáticas do genoma de Lxx indicaram que esta está apta a utilizar diversas fontes de carbono, de vitaminas, de ferro e aminoácidos. De fato, dentre as fontes de carbono testadas verificou-se o crescimento de Lxx utilizando manose, frutose e galactose, embora em menor eficiência do que glicose. Observou-se também a utilização das vitaminas cobalamina, tiamina, biotina e complexo vitamínico de Nitsch, sendo que o acréscimo destes elementos resultou numa maior taxa de crescimento de Lxx. Verificou-se também que Lxx está apta a utilizar citrato, sulfato e cloreto de ferro como fontes deste metal, mas em menor eficiência que quando comparada a hemina bovina. Com estes resultados, verificamos que a adição do aminoácido metionina (1 g/L) e das vitaminas D-biotina (0,01 g/L) e cloreto de tiamina (0,01 g/L) obtém-se um desenvolvimento mais acelerado, em média 30%. Na análise da expressão gênica na presença da metionina, verificou-se uma regulação diferencial de 114 genes, sendo que destes 95 foram regulados positivamente e 19 negativamente. Os resultados indicam que Lxx necessita de metionina e que ela utiliza esse aminoácido como uma possível fonte de nitrogênio. Indicaram também que maior crescimento na presença de metionina está relacionado a uma regulação gênica positiva de genes do metabolismo central. / Sugarcane (Saccharum officinarum L.) is one of the most important tropical crops. Cultivated in more than 127 countries, it is of importance both for the social economy and culture of many regions of Brazil and of the world. Its productivity depends on diverse factors that are dealt with the intense interspecific hybridization aiming for more productive cultivars, that are resistant to diverse types of stress. Of these, stresses caused by microorganisms are the most relevant and among these the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), the causal agent of the ratoon stunting disease is one of the most important. The study of this patosystem, however, is very difficult, since Lxx is a fastidious bacterium. The availability of the complete genome sequence of Lxx made possible the understanding of the physiological causes of its fastidious behavior. Thus, the objectives of this work were to optimize the culture medium of Lxx by analyzing important pathways and to study gene expression when Lxx is cultivated in the presence and absence of methionine. Bioinformatic analyzes of the Lxx genome indicated that it is capable to use diverse sources of carbon, vitamins, metals, iron and amino acids. In fact Lxx was able to grow in the presence of mannose, fructose and galactose as the main sugar components of the medium, but not so efficiently as in glucose. It was also observed that the addition of the vitamins cobalamin, thiamin, biotin and the Nitsch´s vitamin complex resulted in a better Lxx growth. It was also verified that Lxx is capable to use iron citrate, iron sulphate and iron chloride as the main sources of iron, but less efficiently than when compared to hemin bovine chloride. With these results, it was verified that the addition of methionine (1 g/L) and of the vitamins D-biotin (0.01 g/L) and thiamine chloride (0.01 g/L) resulted in a faster growth of Lxx in vitro by as much as 30% on average compared to the standard medium. Gene expression analyses showed that the addition of methionine to the medium resulted in an alteration of expression levels of 114 genes, 95 of which were up regulated and 19 otherwise. This result indicated that Lxx needs an outside source of methionine and that it uses this amino acid a source of nitrogen. Also, it indicated that the improved growth in the presence of methionine is highly correlated with up regulation of genes of the central metabolism pathways.

A cana-de-açúcar (Saccharum ssp.) é uma das culturas agrícolas mais importantes da história da humanidade. Foi em Nova Guiné, seu provável centro de origem, que o homem teve o primeiro contato com a planta em seu estado silvestre. Atualmente, o Brasil lidera a lista dos 80 países produtores de cana-de-açúcar. É o primeiro também em exportação de seus derivados, seguido, respectivamente, pela Austrália, Tailândia, Guatemala e África do Sul. A área plantada no Brasil está próxima dos 7 milhões de hectares. A cana-de-açúcar, assim como a grande diversidade de culturas de interesse agronômico, é hospedeira de uma série de patógenos que podem limitar sua produção, dentre os quais, destaca-se a bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli, agente causal do raquitismo-da-soqueira (RSD). O RSD é considerado uma das mais importantes doenças da cana-de-açúcar que limita a produção no mundo todo e seu controle está fundamentado na adoção de um conjunto de medidas preventivas, pois poucas são as informações sobre materiais resistentes à doença e não existe um produto químico que a controle eficientemente. Historicamente, a dificuldade do diagnóstico do RSD, na maioria dos casos, é conseqüência da ausência de sintomas externos e pela não ocorrência de sintomas internos em determinados cultivares de cana-de-açúcar e neste sentido, técnicas de imunologia, molecular e de microscopia de contraste de fases têm sido bastante empregadas. A hipótese da possível correlação entre a anatomia vascular e a resistência de plantas a patógenos, é um assunto freqüentemente discutido por pesquisadores e poderia elucidar os mecanismos envolvidos na resistência da planta ao patógeno. Assim, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar a resistência/suscetibilidade de 10 variedades comerciais de canade- açúcar RB, mais a variedade CB 49-260 incluída como padrão suscetível, correlacionando os danos apresentados por análises de componentes de produção tecnológicos e biométricos amostrados no campo, com a morfologia e quantificação de conjunto de feixes vasculares e os níveis de infecção detectados nos diagnósticos. Os resultados mostraram que as variedades RB 72 454, RB 83 5486, RB 86 7515, RB 92 8064, RB 92 5211, RB 92 5345 e RB 92 5268 comportaram-se como variedades suscetíveis. A RB 85 5156 comportou-se como variedade de resistência intermediária As variedades RB 85 5536 RB 85 5453, comportaram-se como tolerantes. Os danos apresentados tiveram relação direta com as concentrações do patógeno inoculadas no início do experimento, ou seja, quanto maior a concentração de inóculo, maiores foram os danos ocorridos nas variedades menos tolerantes. Contudo, não há correlações entre o tamanho médio do metaxilema e o número de feixes vasculares por área com a resistência da planta. / Sugarcane (Saccharum ssp.) is one of the most important cultures in the history of the humanity. The center of origin is probably New Guinea, where people had the first contact with the plant in wild state. Presently, Brazil leads the list of the 80 sugarcane producing countries. Brazil is also the first in exporting sugarcane by-products, followed by Australia, Thailand, Guatemala and South Africa, respectively. The are grown in Brazil ranges 7 million hectares. As well as a great diversity of cultures of agronomical interest, sugarcane is host of a large number of pathogens which can limit its production. Among them, one can emphasize, Leifsonia xyli subsp. xyli, causal agent of ratoon stunting disease (RSD). RSD is considered one of the most important diseases of sugarcane limiting yield worldwide and the control is based on the adoption of a set of preventative measures, since the information about resistant materials and efficient chemical products are scarce. Historically, RSD diagnosis has been difficult because there are no definitive external symptoms and internal symptoms do not develop adequately in all varieties. Serological, molecular and microscopy techniques have been widely used to diagnose RSD. The hypothesis of the possible correlation among vascular anatomy and plant resistance has been discussed by researchers and could elucidate the resistance mechanisms involved in the resistance of plants to the pathogens. Thus, the overall objective of the present study was to evaluate the resistance/susceptibility of 10 RB sugarcane commercial varieties including CB 49-260 as a susceptible standard, correlate the damages presented by the analysis of technological and biometric production components of field samples, with the morphology and quantification of set of vascular bundles and the level of infections detected on the diagnostics. The results showed that varieties RB 72 454, RB 83 5486, RB 86 7515, RB 92 8064, RB 92 5211, RB 92 5345 and RB 92 5268 were susceptible. RB 85 5156, had a intermediary resistance and varieties RB 85 5536 and RB 85 5453 both showed tolerant behavior. The injuries presented had a direct relationship with the inoculum concentration, in other words, the higher the inoculum concentration the higher the injuries with the less tolerant varieties. However, there is no correlation between the average length of the metaxilem and the number of vascular bundles per area in plant resistance.

Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al.; 1984; Evtushenko et al.; 2000) é agente causal de uma das mais importantes doenças da cana-de-açúcar: o raquitismo-da-soqueira (Gillaspie Jr. & Davis, 1992; Davis et al.; 1994). O presente trabalho teve como objetivo principal usar métodos de análise cromossômica para corroborar o mapa genômico da estirpe CTC B07 de L. xyli subsp. xyli obtido através do seqüenciamento por "shotgun", realizado pelo grupo de seqüenciamento de Genomas Agronômicos e do Meio-ambiente (AEG) da rede ONSA-FAPESP. A identidade do isolado foi confirmada com a amplificação e seqüenciamento da região 23S do rRNA bem como por meio de testes sorológicos de microaglutinação com antissoro específico. Além destes, foram realizados testes de microscopia eletrônica de varredura da bactéria cultivada em meio líquido para confirmar a pureza do isolado. O tamanho do genoma de L. xyli subsp. xyli foi estimado com base na análise de fragmentos de restrição gerados por digestões com as enzimas de restrição XbaI e SpeI e eletroforese de campo pulsado (PFGE). As estimativas de 2.540 kb e 2.530 kb com XbaI e SpeI respectivamente ficaram próximas ao valor obtido pelo seqüenciamento genômico (2.596.959 pb). Em adição, o número de seqüências repetidas e de genes ribossomais identificados pelo projeto genoma foram confirmados por meio de hibridizações com sondas apropriadas. Comparações genômicas de L. xyli subsp. xyli, L. xyli subsp. cynodontis e duas espécies de Clavibacter também foram objetivos deste trabalho. As comparações foram baseadas em análise de RFLPs após a hibridização do DNA genômico utilizando como sondas elementos genéticos móveis presentes no genoma de L. xyli subsp. xyli. As estimativas dos números estimado de cópias destes elementos no genoma de L. xyli subsp. xyli obtidas por hibridizações concordam com aquelas obtidas pelo seqüenciamento, considerando fragmentos RFLPs menores que 9 kb. Informações referentes à fragmentos maiores não foram obtidas uma vez que estes não foram adequadamente resolvidos na corrida eletroforética. Finalmente, comparações através de análise de RFLP e rep-PCR mostraram diferenças entre L. xyli subsp. xyli e L. xyli subsp. cynodontis bem como entre estas e espécies de Clavibacter. Não foram verificadas diferenças entre a estirpe CTC B07 de L. xyli subsp. xyli e a estirpe australiana. / Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al.; 1984; Evtushenko et al.; 2000) is the causal agent of one of the most economically important disease of sugarcane worldwide, i.e, ratoon stunting disease (Gillaspie Jr. & Davis, 1992; Davis et al.; 1994). The main objective of this study was to confirm the assembly of the genome of L. xyli subsp. xyli obtained after shotgun sequencing by the Agronomic and Enviromental Genomes group of the ONSA/FAPESP network. The identity of the strain was confirmed by amplification and sequencing of the 23S rRNA region as well as by microaglutination serological tests with specific antiserum. Besides this, scanning electron microscopic analysis was used to assess the purity of the strain culture. The size of the genome of L. xyli subsp. xyli was estimated based on restriction analysis after digestion of genomic DNA with SpeI and XbaI followed by pulsed-field gel electrophoresis. The estimates of 2,530 kb and 2,540 kb, respectively for SpeI and XbaI, are in agreement with the one obtained by whole genome sequencing (2,596 kb). In addition, the number of repeated sequences and ribossomal genes predicted by thesequencing project was confirmed by hybridization experiments with the appropriate probes. Genomic comparisons of L. xyli subsp. xyli, L. xyli subsp. cynodontis and two Clavibacter species comprised a second objective of this study. Comparisons were based on RFLP analysis after hybridization of digested genomic DNA using mobile genetic elements present in the genome of L. xyli subsp. xyli as probes. The estimates of number of copies of these elements in the genome of L. xyli subsp. xyli obtained by this approach agreed with the ones obtained by sequencing if RFLP fragments smaller than 9 kb are considered. Data from larger fragments were not obtained since they were not adequately resolved by electrophoresis. Finally, RFLP and rep-PCR comparisons unveiled differences between L. xyli subsp. xyli and L. xyli subsp. cynodontis as well as between these and Clavibacter. No differences were found between strain CTC B07 of L. xyli subsp. xyli and an Australian strain.

A cana-de-açúcar, é atualmente a cultura mais plantada no estado de São Paulo, apresentando grande importância no setor agrícola. Assim como qualquer outra cultura, é hospedeira de uma série de patógenos que podem limitar sua produção. A bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é o agente causal do raquistismo-das-soqueiras (RSD) em canade- açúcar cujo o principal sintoma é a redução acentuada do crescimento observada em plantas adultas. Essa doença é de difícil diagnose pois a evolução dos sintomas é lenta devido à natureza fastidiosa da bactéria. Lxx pode ser considerada como um endófíto obrigatório que cresce a níveis patogênicos nos tecidos da planta dependendo de estímulos bióticos e abióticos. Devido à importância da cultura e aos danosoCasionados pela Lxx, este trabalho apresentou dois enfoques principais: o primeiro foi o desenvolvimento de um protocolo para quantificação de Lxx em tecido de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real; o segundo foi o estudo da interação entre cana-de-açúcar e Lxx, em busca de uma melhor compreensão da evolução desse processo através da identificação de proteínas que apresentaram alteração em abundância ao longo do tempo em função da colonização pela bactéria em duas variedades de cana (RB835486 e SP80-3280) e em seguida enfatizando o sistema antioxidante nesta relação. Para isso, foram desenvolvidos primers específicos para detecção de Lxx que permitiram quantificar baixos níveis bacterianos em tecido foliar, revelando diferenças entre variedades segundo a cinética do crescimento bacteriano. Plantas com diferentes títulos bacterianos obtidas mediante inoculação artificial ou não foram submetidas à análise proteômica por meio da técnica de 2D-DIGE, uma vez que para o RSD, os danos estão relacionados à alta colonização de Lxx em seus tecidos. Os resultados alcançados com o sequenciamento de proteínas que apresentaram alteração em abundância revelaram que, em plantas da variedade RB835486 observou-se repressão de proteínas da via de estresse oxidativo e metabolismo primário, em contraste com a variedade SP80-3280, que apresentou aumento da abundância de proteínas relacionadas à via de estresse oxidativo, ambas para o mesmo tratamento, em plantas não inoculadas artificialmente. Já em plantas inoculadas com Lxx foram identificadas alteração na abundância de proteínas relacionadas ao crescimento da planta, ciclo celular, vias de sinalização celular e hormonal, esses resultados são consistentes com o principal sintoma da doença, o raquitismo, pois indica que as alterações temporais observadas na expressão de proteínas relacionadas com o aumento do título de Lxx in planta podem resultar em alterações do equilíbrio hormonal e menor crescimento da planta. Alguns resultados observados com a análise bioquímica corroboram com os dados acima descritos, pois a variedade RB835486 apresentou uma resposta precoce ao estresse oxidativo e mostrou maior controle do crescimento bacteriano, o que pode estar relacionado ao balanço de ERO\'s (espécies reativas de oxigênio) utilizadas pelo metabolismo como sinalizador celular na interação planta-patógeno. Em contraste, a variedade SP80-3280, em sua maioria, apresentou indução da atividade de enzimas antioxidantes mais tardiamente, momento em que a bactéria Lxx apresentou os maiores títulos de crescimento. / Sugarcane is currently the most grown crop in the state of São Paulo, with great importance in the agricultural sector. Like every crop, sugarcane is host to a number of pathogens that may limit its production. The fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is the causal agent of ratoon stunting in sugarcane (RSD), which the main symptom is a sharp reduction in growth observed in adult plants, this disease is difficult to diagnose because the evolution is slow due to nature of fastidious bacteria. Lxx can be considered as an obligatory endophyte that grows at pathogen levels in plant tissues depending on biotic and abiotic stimuli. Due to the importance of culture and the damage caused by the Lxx, this work presents two main approaches: the first one was the development of a protocol for the quantification of Lxx in sugarcane tissue by quantitative real time PCR; the second one was to study the interaction between sugarcane and Leifsonia xyli subsp. xyli aiming to a better understanding of the evolution of this process, identifying alterations in abundance of proteins over time depending on the bacterial colonization in the two varieties of sugarcane (RB835486 and SP80-3280) and then, emphasizing the antioxidant system in this relationship. Thus, we developed specific primers that enabled Lxx quantification at low bacterial levels in leaf tissue. The assay showed differences among sugarcane varieties according to the kinetics of bacterial growth. Plants that presented different titers of bacteria were obtained by artificial inoculum or not were selected to proteomic analysis by 2D-DIGE technique, since for RSD, the damage is related to high colonization in plant tissues. The identification of sugarcane proteins revealed that for variety RB835486 were observed a repression of stress proteins and proteins related to primary metabolism, in contrast with SP80-3280 variety, which it was identified high abundance of proteins of oxidative stress pathway, in not inoculated plants, for both varieties. However in inoculated plants it was identified a change in the abundance of proteins related to plant growth, cell cycle, cell signaling and hormonal pathways. These results corroborate with the main symptom of the disease, ratton, and suggest that temporal changes in expression of sugarcane cited proteins by increasing title of Lxx can result in hormonal imbalance and the decrease of plant growth. The major part of biochemistry analyzes corroborate with previous data obtained in proteomic approach. The RB835486 variety showed an early response to oxidative stress and suggests a greater control of bacterial growth in its tissues, which may be related to the balance of ERO\'s in signaling metabolism in plant pathogen interaction. While the SP80-3280, showed a later induction of antioxidant enzymes, when the bacterium Lxx had the highest titer of bacteria.