O raquitismo das soqueiras (RSD), causado pela bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é uma das principais doenças na cana-de-açúcar, contudo, as informações sobre a biologia do patógeno, bem como sobre sua interação com cana são limitadas. Desta forma, três estudos foram conduzidos com o objetivo de verificar a interferência de fatores do hospedeiro e do ambiente na cinética populacional da Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) in planta e in vitro. Num primeiro, foi quantificada, através de PCR em tempo real (qPCR), a colonização da bactéria de plantas de duas variedades submetidas a estresse por restrição hídrica e por injúria mecânica infligida através de corte da planta. Num segundo, o desenvolvimento in vitro da bactéria foi avaliado, por 10 dias, em resposta à adição ao meio de cultivo de fluido vascular de plantas de cana. Já o terceiro estudo avaliou o efeito do hormônio ácido abscísico (ABA) na cinética populacional de Lxx em cana. No primeiro estudo, os resultados apontaram efeito positivo tanto do estresse hídrico como da injúria no título bacteriano em plantas da variedade CB 49-260. Já na variedade RB83 5486, não houve efeito significativo destes agentes de estresse no título bacteriano. No segundo estudo, o maior desenvolvimento da população de Lxx ocorreu em meio de cultivo sem adição de fluido vascular, ao passo que o desenvolvimento da população em presença de fluido da variedade resistente não inoculada com Lxx foi maior, quando em presença de fluido de plantas da mesma variedade inoculadas com a bactéria. A adição de fluido vascular da variedade suscetível, por outro lado, inibiu substancialmente o desenvolvimento das culturas bacterianas. A análise cromatográfica do fluido vascular indicou diferenças na concentração de compostos do fluido das duas variedades, bem como entre plantas da mesma variedade inoculadas ou não com a bactéria. No terceiro estudo, apesar das variações nos títulos da Lxx detectados ao longo do tempo, tanto nas plantas testemunhas como nas plantas tratadas com ABA, não houve diferenças significativas (p>0,05) entre os tratamentos dentro de um período de avaliação de 4 meses. Em seu conjunto, os resultados, além de fornecerem informações inéditas sobre a interação entre Lxx e cana, ainda permitiram direcionar futuros estudos a fim de aprimorar o conhecimento sobre os mecanismos de colonização do hospedeiro desta bactéria. / Ratoon Stunting Disease (RSD) caused by the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is a major disease in sugarcane; however, information on the biology of this pathogen and on its interaction with sugarcane is limited. Three studies were conducted to analyze effects of the host and environment on the population kinetics of Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) in plant and in vitro. In the first treatment, we used real time PCR (qPCR) to quantify bacterial colonization in two sugarcane varieties subjected to water stress and mechanical injury. In the second treatment, we evaluated the in vitro growth of the bacteria for 10 days after the addition of 15% of sugarcane vascular fluid to the culture medium. The third treatment evaluated the effect of the application of abscisic acid (ABA) on Lxx colonization in sugarcane. In the first treatment, the results showed an increase in Lxx colonization in the variety CB 49-260 exposed to water stress and mechanical injury. For the variety RB83 5486, there was no significant effect of these stresses on the bacterial colonization. In the second treatment, the greatest development of Lxx population occurred in the culture medium without the addition of vascular fluid (control), while bacterial population in the presence of fluid from resistant variety non-inoculated with Lxx was greater, compared to the growth in the presence of plant fluids of the same variety inoculated with the bacteria. The addition of vascular fluid of the susceptible variety, on the other hand, significantly inhibited bacterial growth. The chromatographic analysis of the vascular fluid indicated differences in the compounds concentration in the fluid of the two varieties, as well as in plants of the same variety inoculated or not with the bacteria. In the third study, despite variations in Lxx colonization detected over time, the control plants and plants treated with ABA showed no significant differences (p> 0.05) among treatments during the trial period of four months. The results, in addition to providing new information about the interaction between Lxx and sugarcane, allowed to direct further studies on mechanisms of host colonization of this bacterium.

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Brazil is the main world producer of sugarcane (Saccharum ssp.), being the activity of the Brazilian sugarcane industry in continuous expansion, which can be seen due to increasing both the production capacity as agricultural areas intended for the cultivation. However, the increase of the production costs and the expansion of cultivation to less productive areas have increasingly demanded strategies to safeguard the sector's profitability. In this sense, studies of environmental factors that limit the yield of sugarcane crops are fundamental and can cite the biotic stresses caused by pathogenic microorganisms and the weeds. Plants respond differently to various types of stress, and, in general, are firstly affected in their physiological and photosynthetic properties. Therefore, the analysis of ecophysiological parameters - being this a tool to detect small deviations from normality of the photosynthetic performance - can provide useful information about the behavior of plants under stressful conditions caused by the disease and weed competition. Thus, this study aimed to evaluate the behavior of four different sugarcane varieties submitted to the stresses caused by the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) - causal agent of Ratoon stunting disease (RSD) - and competition with the weed plant Brachiaria decumbens Stapf., correlating the production data with the ecophysiological responses resulting from the stress condition. To this finality, stem segments with just one bud were planted in plastic trays and kept in a greenhouse, being the seedlings subsequently transplanted to the field, where were measured both yield parameters (biometric and technological), the fluorescence of chlorophyll a and the gas exchange of plants subject, or not, to mentioned stressors. The experimental design used was the randomized block design with four replications, in a split-plot scheme, being the plots composed by varieties Co 997, RB867515, RB92579 and RB951541; and the subplots by the induction or not of stress factor. Regarding Lxx inoculation, RB92579 and RB951541 varieties were less sensitive to the RSD effects, since both ecophysiological and yield parameters were just a little bit affected by disease, while RB867515 and Co 997 varieties underwent changes in many parameters, highlighting the decline of photosynthetic rate and the reduction of height and diameter of the stalks. Regarding weed competition with B. decumbens, the four varieties tested were affected in all parameters, resulting in significant losses of yield, being that the RB92579 variety showed higher competitive ability than the others. Thus, the use of ecophysiological analysis tool is feasible to aid the work of selection of tolerant sugarcane genotypes to typical adverse situations of his cultivation. / O Brasil é o principal produtor mundial de cana-de-açúcar (Saccharum ssp.), entando a atividade do setor sucroenergético brasileiro em contínua expansão, o que pode ser constatado devido ao aumento crescente tanto da capacidade produtiva como das áreas agrícolas destinadas à cultura. No entanto, o aumento dos custos de produção e a expansão do cultivo para áreas menos produtivas têm exigido cada vez mais estratégias capazes de salvaguardar a rentabilidade do setor. Nesse sentido, os estudos dos fatores ambientais que limitam o rendimento dos canavias são fundamentais, podendo-se citar os estresses bióticos causados pelos microrganismos fitopatogênicos e pelas plantas infestantes. As plantas respondem de formas diferentes aos diversos tipos de estresse, sendo que, em geral, são primeiramente afetadas em suas propriedades fisiológicas e fotossintéticas. Isto posto, a análise dos parâmetros ecofisiológicos – sendo uma ferramenta capaz de detectar pequenos desvios da normalidade do desempenho fotossintético – pode fornecer informações úteis acerca do comportamento das plantas sob as condições estressantes causadas por doenças e pela matocompetição. Assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar o comportamento de quatro diferentes variedades de cana-de-açúcar submetidas aos estresses causados pela bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) – agente causal da doença Raquitismo da soqueira (RSD) – e pela competição com a planta infestante Brachiaria decumbens Stapf., correlacionando os dados de produção com as respostas ecofisiológicas decorrentes da condição de estresse. Para tal, segmentos de colmo com apenas uma gema foram plantados em bandejas plásticas e mantidos em casa de vegetação, sendo as mudas posteriormente transplantadas para o campo, onde foram mensurados os parâmetros de produção (biométricos e tecnológicos), a fluorescência da clorofila a e as trocas gasosas de plantas sujeitas ou não aos fatores de estresse mencionados. Foi utilizado o delineamento experimental em blocos casualizados, com quatro repetições, em esquema de parcelas subdivididas, sendo as parcelas compostas pelas variedades Co 997, RB867515, RB92579 e RB951541; e as subparcelas pela imposição ou não do fator de estresse. Em relação à inoculação de Lxx, as variedades RB92579 e RB951541 foram menos sensíveis aos efeitos do RSD, uma vez que, tanto parâmetros ecofisiológicos como de produção foram pouco influenciados pela doença, ao passo que as variedades RB867515 e Co 997 sofreram alterações em diversos parâmetros, com destaque para o declínio da taxa fotossintética e redução da estatura e diâmetro dos colmos. Em relação à matocompetição com B. decumbens, as quatro variedades testadas foram afetadas em todos os parâmetros, acarretando em perdas expressivas de produtividade, sendo a variedade RB92579 a que demonstrou maior habilidade competitiva. Assim, uso da ferramenta de análise ecofisiológica é viável no auxílio aos trabalhos de seleção de genótipos de cana-de-açúcar tolerantes às situações adversas própria do seu cultivo.

O raquitismo das soqueiras (RSD), causado pela bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é uma das principais doenças na cana-de-açúcar, contudo, as informações sobre a biologia do patógeno, bem como sobre sua interação com cana são limitadas. Desta forma, três estudos foram conduzidos com o objetivo de verificar a interferência de fatores do hospedeiro e do ambiente na cinética populacional da Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) in planta e in vitro. Num primeiro, foi quantificada, através de PCR em tempo real (qPCR), a colonização da bactéria de plantas de duas variedades submetidas a estresse por restrição hídrica e por injúria mecânica infligida através de corte da planta. Num segundo, o desenvolvimento in vitro da bactéria foi avaliado, por 10 dias, em resposta à adição ao meio de cultivo de fluido vascular de plantas de cana. Já o terceiro estudo avaliou o efeito do hormônio ácido abscísico (ABA) na cinética populacional de Lxx em cana. No primeiro estudo, os resultados apontaram efeito positivo tanto do estresse hídrico como da injúria no título bacteriano em plantas da variedade CB 49-260. Já na variedade RB83 5486, não houve efeito significativo destes agentes de estresse no título bacteriano. No segundo estudo, o maior desenvolvimento da população de Lxx ocorreu em meio de cultivo sem adição de fluido vascular, ao passo que o desenvolvimento da população em presença de fluido da variedade resistente não inoculada com Lxx foi maior, quando em presença de fluido de plantas da mesma variedade inoculadas com a bactéria. A adição de fluido vascular da variedade suscetível, por outro lado, inibiu substancialmente o desenvolvimento das culturas bacterianas. A análise cromatográfica do fluido vascular indicou diferenças na concentração de compostos do fluido das duas variedades, bem como entre plantas da mesma variedade inoculadas ou não com a bactéria. No terceiro estudo, apesar das variações nos títulos da Lxx detectados ao longo do tempo, tanto nas plantas testemunhas como nas plantas tratadas com ABA, não houve diferenças significativas (p>0,05) entre os tratamentos dentro de um período de avaliação de 4 meses. Em seu conjunto, os resultados, além de fornecerem informações inéditas sobre a interação entre Lxx e cana, ainda permitiram direcionar futuros estudos a fim de aprimorar o conhecimento sobre os mecanismos de colonização do hospedeiro desta bactéria. / Ratoon Stunting Disease (RSD) caused by the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is a major disease in sugarcane; however, information on the biology of this pathogen and on its interaction with sugarcane is limited. Three studies were conducted to analyze effects of the host and environment on the population kinetics of Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) in plant and in vitro. In the first treatment, we used real time PCR (qPCR) to quantify bacterial colonization in two sugarcane varieties subjected to water stress and mechanical injury. In the second treatment, we evaluated the in vitro growth of the bacteria for 10 days after the addition of 15% of sugarcane vascular fluid to the culture medium. The third treatment evaluated the effect of the application of abscisic acid (ABA) on Lxx colonization in sugarcane. In the first treatment, the results showed an increase in Lxx colonization in the variety CB 49-260 exposed to water stress and mechanical injury. For the variety RB83 5486, there was no significant effect of these stresses on the bacterial colonization. In the second treatment, the greatest development of Lxx population occurred in the culture medium without the addition of vascular fluid (control), while bacterial population in the presence of fluid from resistant variety non-inoculated with Lxx was greater, compared to the growth in the presence of plant fluids of the same variety inoculated with the bacteria. The addition of vascular fluid of the susceptible variety, on the other hand, significantly inhibited bacterial growth. The chromatographic analysis of the vascular fluid indicated differences in the compounds concentration in the fluid of the two varieties, as well as in plants of the same variety inoculated or not with the bacteria. In the third study, despite variations in Lxx colonization detected over time, the control plants and plants treated with ABA showed no significant differences (p> 0.05) among treatments during the trial period of four months. The results, in addition to providing new information about the interaction between Lxx and sugarcane, allowed to direct further studies on mechanisms of host colonization of this bacterium.

Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al.; 1984; Evtushenko et al.; 2000) é agente causal de uma das mais importantes doenças da cana-de-açúcar: o raquitismo-da-soqueira (Gillaspie Jr. & Davis, 1992; Davis et al.; 1994). O presente trabalho teve como objetivo principal usar métodos de análise cromossômica para corroborar o mapa genômico da estirpe CTC B07 de L. xyli subsp. xyli obtido através do seqüenciamento por “shotgun”, realizado pelo grupo de seqüenciamento de Genomas Agronômicos e do Meio-ambiente (AEG) da rede ONSA-FAPESP. A identidade do isolado foi confirmada com a amplificação e seqüenciamento da região 23S do rRNA bem como por meio de testes sorológicos de microaglutinação com antissoro específico. Além destes, foram realizados testes de microscopia eletrônica de varredura da bactéria cultivada em meio líquido para confirmar a pureza do isolado. O tamanho do genoma de L. xyli subsp. xyli foi estimado com base na análise de fragmentos de restrição gerados por digestões com as enzimas de restrição XbaI e SpeI e eletroforese de campo pulsado (PFGE). As estimativas de 2.540 kb e 2.530 kb com XbaI e SpeI respectivamente ficaram próximas ao valor obtido pelo seqüenciamento genômico (2.596.959 pb). Em adição, o número de seqüências repetidas e de genes ribossomais identificados pelo projeto genoma foram confirmados por meio de hibridizações com sondas apropriadas. Comparações genômicas de L. xyli subsp. xyli, L. xyli subsp. cynodontis e duas espécies de Clavibacter também foram objetivos deste trabalho. As comparações foram baseadas em análise de RFLPs após a hibridização do DNA genômico utilizando como sondas elementos genéticos móveis presentes no genoma de L. xyli subsp. xyli. As estimativas dos números estimado de cópias destes elementos no genoma de L. xyli subsp. xyli obtidas por hibridizações concordam com aquelas obtidas pelo seqüenciamento, considerando fragmentos RFLPs menores que 9 kb. Informações referentes à fragmentos maiores não foram obtidas uma vez que estes não foram adequadamente resolvidos na corrida eletroforética. Finalmente, comparações através de análise de RFLP e rep-PCR mostraram diferenças entre L. xyli subsp. xyli e L. xyli subsp. cynodontis bem como entre estas e espécies de Clavibacter. Não foram verificadas diferenças entre a estirpe CTC B07 de L. xyli subsp. xyli e a estirpe australiana. / Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al.; 1984; Evtushenko et al.; 2000) is the causal agent of one of the most economically important disease of sugarcane worldwide, i.e, ratoon stunting disease (Gillaspie Jr. & Davis, 1992; Davis et al.; 1994). The main objective of this study was to confirm the assembly of the genome of L. xyli subsp. xyli obtained after shotgun sequencing by the Agronomic and Enviromental Genomes group of the ONSA/FAPESP network. The identity of the strain was confirmed by amplification and sequencing of the 23S rRNA region as well as by microaglutination serological tests with specific antiserum. Besides this, scanning electron microscopic analysis was used to assess the purity of the strain culture. The size of the genome of L. xyli subsp. xyli was estimated based on restriction analysis after digestion of genomic DNA with SpeI and XbaI followed by pulsed-field gel electrophoresis. The estimates of 2,530 kb and 2,540 kb, respectively for SpeI and XbaI, are in agreement with the one obtained by whole genome sequencing (2,596 kb). In addition, the number of repeated sequences and ribossomal genes predicted by thesequencing project was confirmed by hybridization experiments with the appropriate probes. Genomic comparisons of L. xyli subsp. xyli, L. xyli subsp. cynodontis and two Clavibacter species comprised a second objective of this study. Comparisons were based on RFLP analysis after hybridization of digested genomic DNA using mobile genetic elements present in the genome of L. xyli subsp. xyli as probes. The estimates of number of copies of these elements in the genome of L. xyli subsp. xyli obtained by this approach agreed with the ones obtained by sequencing if RFLP fragments smaller than 9 kb are considered. Data from larger fragments were not obtained since they were not adequately resolved by electrophoresis. Finally, RFLP and rep-PCR comparisons unveiled differences between L. xyli subsp. xyli and L. xyli subsp. cynodontis as well as between these and Clavibacter. No differences were found between strain CTC B07 of L. xyli subsp. xyli and an Australian strain.

A cana-de-açúcar, é atualmente a cultura mais plantada no estado de São Paulo, apresentando grande importância no setor agrícola. Assim como qualquer outra cultura, é hospedeira de uma série de patógenos que podem limitar sua produção. A bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é o agente causal do raquistismo-das-soqueiras (RSD) em canade- açúcar cujo o principal sintoma é a redução acentuada do crescimento observada em plantas adultas. Essa doença é de difícil diagnose pois a evolução dos sintomas é lenta devido à natureza fastidiosa da bactéria. Lxx pode ser considerada como um endófíto obrigatório que cresce a níveis patogênicos nos tecidos da planta dependendo de estímulos bióticos e abióticos. Devido à importância da cultura e aos danosoCasionados pela Lxx, este trabalho apresentou dois enfoques principais: o primeiro foi o desenvolvimento de um protocolo para quantificação de Lxx em tecido de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real; o segundo foi o estudo da interação entre cana-de-açúcar e Lxx, em busca de uma melhor compreensão da evolução desse processo através da identificação de proteínas que apresentaram alteração em abundância ao longo do tempo em função da colonização pela bactéria em duas variedades de cana (RB835486 e SP80-3280) e em seguida enfatizando o sistema antioxidante nesta relação. Para isso, foram desenvolvidos primers específicos para detecção de Lxx que permitiram quantificar baixos níveis bacterianos em tecido foliar, revelando diferenças entre variedades segundo a cinética do crescimento bacteriano. Plantas com diferentes títulos bacterianos obtidas mediante inoculação artificial ou não foram submetidas à análise proteômica por meio da técnica de 2D-DIGE, uma vez que para o RSD, os danos estão relacionados à alta colonização de Lxx em seus tecidos. Os resultados alcançados com o sequenciamento de proteínas que apresentaram alteração em abundância revelaram que, em plantas da variedade RB835486 observou-se repressão de proteínas da via de estresse oxidativo e metabolismo primário, em contraste com a variedade SP80-3280, que apresentou aumento da abundância de proteínas relacionadas à via de estresse oxidativo, ambas para o mesmo tratamento, em plantas não inoculadas artificialmente. Já em plantas inoculadas com Lxx foram identificadas alteração na abundância de proteínas relacionadas ao crescimento da planta, ciclo celular, vias de sinalização celular e hormonal, esses resultados são consistentes com o principal sintoma da doença, o raquitismo, pois indica que as alterações temporais observadas na expressão de proteínas relacionadas com o aumento do título de Lxx in planta podem resultar em alterações do equilíbrio hormonal e menor crescimento da planta. Alguns resultados observados com a análise bioquímica corroboram com os dados acima descritos, pois a variedade RB835486 apresentou uma resposta precoce ao estresse oxidativo e mostrou maior controle do crescimento bacteriano, o que pode estar relacionado ao balanço de ERO\'s (espécies reativas de oxigênio) utilizadas pelo metabolismo como sinalizador celular na interação planta-patógeno. Em contraste, a variedade SP80-3280, em sua maioria, apresentou indução da atividade de enzimas antioxidantes mais tardiamente, momento em que a bactéria Lxx apresentou os maiores títulos de crescimento. / Sugarcane is currently the most grown crop in the state of São Paulo, with great importance in the agricultural sector. Like every crop, sugarcane is host to a number of pathogens that may limit its production. The fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is the causal agent of ratoon stunting in sugarcane (RSD), which the main symptom is a sharp reduction in growth observed in adult plants, this disease is difficult to diagnose because the evolution is slow due to nature of fastidious bacteria. Lxx can be considered as an obligatory endophyte that grows at pathogen levels in plant tissues depending on biotic and abiotic stimuli. Due to the importance of culture and the damage caused by the Lxx, this work presents two main approaches: the first one was the development of a protocol for the quantification of Lxx in sugarcane tissue by quantitative real time PCR; the second one was to study the interaction between sugarcane and Leifsonia xyli subsp. xyli aiming to a better understanding of the evolution of this process, identifying alterations in abundance of proteins over time depending on the bacterial colonization in the two varieties of sugarcane (RB835486 and SP80-3280) and then, emphasizing the antioxidant system in this relationship. Thus, we developed specific primers that enabled Lxx quantification at low bacterial levels in leaf tissue. The assay showed differences among sugarcane varieties according to the kinetics of bacterial growth. Plants that presented different titers of bacteria were obtained by artificial inoculum or not were selected to proteomic analysis by 2D-DIGE technique, since for RSD, the damage is related to high colonization in plant tissues. The identification of sugarcane proteins revealed that for variety RB835486 were observed a repression of stress proteins and proteins related to primary metabolism, in contrast with SP80-3280 variety, which it was identified high abundance of proteins of oxidative stress pathway, in not inoculated plants, for both varieties. However in inoculated plants it was identified a change in the abundance of proteins related to plant growth, cell cycle, cell signaling and hormonal pathways. These results corroborate with the main symptom of the disease, ratton, and suggest that temporal changes in expression of sugarcane cited proteins by increasing title of Lxx can result in hormonal imbalance and the decrease of plant growth. The major part of biochemistry analyzes corroborate with previous data obtained in proteomic approach. The RB835486 variety showed an early response to oxidative stress and suggests a greater control of bacterial growth in its tissues, which may be related to the balance of ERO\'s in signaling metabolism in plant pathogen interaction. While the SP80-3280, showed a later induction of antioxidant enzymes, when the bacterium Lxx had the highest titer of bacteria.