Orientador: José Moacir Marin / Banca: Ruben Pablo Schocken-Iturrino / Banca: Maria Cristina Monteiro de / Resumo: Um total de 109 cepas de Staphylococcus coagulase-negativa foi isolado de mastite bovina clinica e subclinica em 35 fazendas de leite situadas em 9 estados brasileiros no período de fevereiro a maio de 2005, elas foram investigadas em relação a sua susceptibilidade in vitro a diversos agentes antimicrobianos. Entre as cepas obtidas, a resistência a penicilina foi a mais freqüente (93,5%), seguida pela resistência a sulfonamida (88,9%), novobiocina (88,6%) e ampicilina (85,3%). Todas as cepas examinadas mostraram resistência a pelo menos 1 das drogas antimicrobianas testadas. Cepas apresentando resistência múltipla foram extremamente comuns, com 10,0% dos isolados apresentando resistência a todas as drogas antimicrobianas. Os resultados obtidos indicaram que as cepas de Staphylococcus coagulase-negativas isoladas no Brasil apresentaram um alto grau de resistência a antimicrobianos. Estes resultados são provavelmente uma conseqüência da pressão devido ao uso intensivo de drogas antimicrobianas e eles são um motivo de preocupação em relação a saúde pública. / Abstract: A total of 109 strains of coagulase-negative Staphy/ococci were isolated from bovine clinical and subdinical mastitic cattle in 35 dairy farms, in 9 states of Brazil from february to may 2005, and investigated for in vitro susceptibility to several antimicrobial agents. Among the isolates, resistance to penicillin was most frequent (93.5%), followed by resistance to sulphonamide (88.9%), novobiocin (88.6%) and ampicillin (85.3%). Ali isolates exhibited resistance to at least 1 of the antimicrobial drugs tested. Multidrug resistant isolates were quite common, 10.0% of the isolates showing resistance to ali antimicrobial drugs tested. This indicates that coagulase-negative Staphy/ococci in 3razil exhibit a high degree of antimicrobial agents' resistance, probably as a :onsequence of the pressure of the intensive use of antimicrobial drugs, a practice that :onstitute a public health concem. / Mestre

As ataxias espinocerebelares (SCAs) são doenças neurodegenerativas com herança autossômica dominante que apresentam grande heterogeneidade clínica e genética. O diagnóstico é realizado pela detecção da mutação no gene causador, que, na sua maioria, é uma expansão de repetições trinucleotídicas CAG. O objetivo deste estudo foi analisar os polimorfismos de repetições trinucleotídicas nos genes associados as SCAs tipo 1, tipo 2, tipo 3 e tipo 6 através de PCR-multiplex e eletroforese capilar, visando a melhoria do diagnóstico molecular e a determinação da distribuição das regiões polimórficas nos alelos normais. As análises foram realizadas em 124 pacientes não-aparentados que apresentavam sintomas de ataxia. Nessa amostra, foram identificados 10 pacientes com SCA2, 39 pacientes com SCA3 e 2 pacientes com SCA6. Não encontramos amostras com uma expansão CAG no gene SCA1. Os polimorfismos de cada loci foram estudados nos cromossomos normais desses pacientes (n=209-248). A freqüência dos alelos normais grandes no locus SCA1 (>32 repetições CAG) foi estabelecida em 0,05 e no locus SCA2 (>22 repetições CAG) foi 0,11, enquanto que no locus SCA3 (alelos >28 repetições) a freqüência foi 0,11. A freqüência de alelos normais grandes para o locus SCA6 (>13 repetições) foi 0,04. Concluindo, este estudo proporcionou a primeira análise detalhada da distribuição de repetições CAG nos loci SCA1, SCA2, SCA3 e SCA6 por amplificação multiplex e eletroforese capilar em pacientes brasileiros. A freqüência dos alelos normais grandes nos genes SCA3 e SCA6 nessa amostra reflete a prevalência destas duas doenças na nossa população, concordando com a hipótese que alelos patogênicos podem ser originados pela expansão de alelos normais grandes. / Spinocerebellar ataxias (SCAs) are neurodegenerative disorders inherited as an autosomal dominant trait that present large genetic and clinical heterogeneity. An accurate diagnosis relies on mutation detection in a specific causative gene, which is typically an abnormal number of CAG trinucleotide repeats. The aim of this study was to analyze polymorphic regions of trinucleotide repeats in SCA1, SCA2, SCA3, and SCA6 associated genes through multiplex PCR and capillary electrophoresis, aiming the improvement of molecular diagnosis and distribution of CAG repeats number in normal alleles. Analyses were carried out in 124 unrelated Brazilian patients who presented symptoms of progressive ataxia. To date, we identified 10 patients with SCA2, 39 patients with SCA3, and 2 patients with SCA6. No alleles were identified with a CAG expansion tract in the SCA1 gene. Normal CAG repeats length range was established using data from normal chromosomes (n=209-248). Frequency of large normal alleles in SCA1 locus (>32 CAG repeats) was determined to be 0.05. Frequency of large normal alleles at the SCA2 locus (>22 CAG repeats) was shown to be 0.11 while at the SCA3 locus (>28 CAG repeats) frequency of large normal alleles was 0.11. At the SCA6 locus, frequency of large normal alleles (>13 CAG repeats) was found to be 0.04. Moreover, this study provides the first detailed analysis, to our knowledge, of the distribution of CAG repeats at the SCA1, SCA2, SCA3, and SCA6 loci by multiplex-PCR and automated capillary electrophoresis in Brazilian patients. Frequency of large normal alleles in SCA3 and SCA6 genes established in this sample reflects the prevalence of these two diseases in our population, supporting the hypothesis that disease alleles emerge from expansion of large normal alleles.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-10-16Bitstream added on 2014-08-13T18:01:30Z : No. of bitstreams: 1 000747021_20151016.pdf: 607081 bytes, checksum: bbdf4b1c6ca753edb9c6aef714441073 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-10-16T13:54:03Z: 000747021_20151016.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-16T13:54:46Z : No. of bitstreams: 1 000747021.pdf: 964954 bytes, checksum: 60f92abc05445fbbd653fbb32d487c4c (MD5) / A família Trypanosomatidae compreende um grande número de protozoários parasitas, incluindo importantes agentes etiológicos de doenças humanas. Entre os causadores de doenças, destacam-se Trypanosoma brucei (responsável pela doença do sono), Trypanosoma cruzi (agente causador da doença de Chagas) e Leishmanias sp (causadoras de leishmanioses). Esses parasitas possuem como mecanismo para formação de seus mRNAs, a reação de trans-splicing, que envolve a excisão de íntrons (regiões intergênicas) e a união dos éxons de dois transcritos independentes, SL RNA (spliced leader) e pré-mRNA aceptor. Em outro trabalho realizado no laboratório, a reação de trans-splicing in vitro foi estabelecida utilizando extratos nucleares (livre de células) de formas epimastigotas de T. cruzi e/ou formas procíclicas de T. brucei e como pré-mRNA aceptor, a sequência parcial de alfa tubulina (contendo a região intrônica, splice site e parte do éxon da alfa tubulina) de T. cruzi marcada radioativamente (dados ainda não publicados). O uso de material radioativo é fator limitante, devido a sua alta periculosidade (extremamente nocivo ao homem e ao meio ambiente) e, também, pelo alto custo relativo aos trâmites burocráticos atuais para sua importação. Portanto, neste trabalho reproduziu-se a reação sem o uso de material radioativo, utilizando-se a transcrição reversa/ reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e gel de agarose corado por brometo de etídeo para a análise dos produtos formados. A metodologia permitirá a avaliação da interferência de substâncias tripanocidas, buscando potenciais alvos terapêuticos nas ribonucleoproteínas de parasitas, preservando as células do hospedeiro. / The Trypanosomatidae family includes a large number of protozoan parasites, with importants etiological agents of human diseases. Among the causes of diseases stand out Trypanosoma brucei (responsible for sleeping sickness), Trypanosoma cruzi (Chagas disease causative agent) and Leishmania sp (causing leishmaniasis). These parasites have a mechanism that form their mRNAs, the trans-splicing reaction, which involves the introns (intergenic regions) excision and two exons union of the independent transcripts, RNA SL (spliced leader) and pre-mRNA acceptor. In another laboratory study, the trans-splicing in vitro reaction was established using nuclear extracts (cell-free) from epimastigotes forms of T. cruzi and / or procyclic forms of T. brucei, and as pre-mRNA aceptor was used the alpha tubulin partial sequence (containing the intronic region, splice site and a radiolabelled part of alpha tubulin exon from T. cruzi (unpublished data). The use of radioactive material is a limiting factor, due to its high hazard (extremely harmful to humans and environment), and also by the high cost relative to the current bureaucratic procedures for importation. Therefore, in this work the reaction was reproduced without the use of radioactive material, using the reverse transcription / polymerase chain reaction (RT-PCR) and agarose gel stained with ethidium bromide for analysis of the formed products. The method allows the evaluation of trypanocidal substances interference searching potential therapeutic targets in the parasite ribonucleoprotein, preserving the host cells.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-04-26Bitstream added on 2014-08-13T18:00:49Z : No. of bitstreams: 1 000753173.pdf: 1982685 bytes, checksum: 3e3cf8bcc5e8c696d40a552890c6657d (MD5) / A leptospirose é uma enfermidade infecto-contagiosa causada por diversas cepas da bactéria Leptospira interrogans, as quais infectam animais domésticos, silvestres e o homem. Os animais silvestres podem exercer papel fundamental na epidemiologia da doença, devido a grande disseminação de leptospiras para o meio ambiente e a possibilidade de infecção entre os animais e o homem, constituindo-se, portanto, em uma importante zoonose. Quando esses animais vivem em cativeiro, como em zoológicos, a infecção e a disseminação de patógenos podem ocorrer entre os animais silvestres do próprio zoológico, animais sinantrópicos, funcionários e o público visitante. Com o intuito de conhecer melhor a ocorrência e epidemiologia da leptospirose em animais silvestres e também em roedores sinantrópicos comensais, que co-habitam o local, foi realizado um estudo com animais em cativeiro e de vida livre, procedentes do Centro de Conservação da Fauna Silvestre de Ilha Solteira- SP (CCFS). Foram colhidas amostras sanguíneas de 41 animais em cativeiro e de 59 animais de vida livre, assim como 13 amostras de rim e fígado de ratos. As técnicas diagnósticas utilizadas foram a Soroaglutinação Microscópica (SAM), Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leptospira spp. e cultivo de rim e fígado de ratos em meio de Fletcher. Pela SAM obteve-se 89 (89%) amostras positivas para um ou mais sorovares de Leptospira spp.; com prevalência do sorovar Andamana. Para a pesquisa do agente em fragmentos de fígado e rim dos ratos, 13 amostras de cada tecido foram cultivadas em meio de Fletcher, apresentando sete (53,8%) amostras positivas, sendo três amostras de rim e quatro de fígado e todos os animais com sorologia positiva. Pela técnica de PCR a partir do sangue dos animais de vida livre e em cativeiro 38 animais (38%) foram positivos para Leptospira spp., a partir de órgãos (rim e fígado) dos roedores sinantrópicos ... / Leptospirosis is a disease caused by various strains of the spirochete bacterium Leptospira interrogans, which can infect domestic and wildlife animals, as well humans. Wild animals may play a key role in the epidemiology of the disease, due to the large spread of leptospires into the environment and the possibility of infection between animals and man, becoming therefore an important zoonosis. When these animals live in captivity in zoos, the infection and spread of pathogens can occur between the wild animals of the zoo itself, synanthropic animals, employees and visitors. In order to better understand the occurrence and epidemiology of leptospirosis in wild animals and in synanthropic rodents, which co-inhabit the place, a study was conducted with free-living animals and in captivity, found in Wild Fauna Conservation Center from Ilha Solteira-SP. Blood samples were collected from 41 animals in captivity and 59 free-living animals, as well as 13 samples of kidney and liver of rats. The diagnostic techniques used were the Microscopic Agglutination Test (MAT), the Polymerase Chain Reaction (PCR) and cultivation in Fletcher medium. MAT was positive in 89 (89%) samples for one or more serovars of Leptospira spp., with prevalence of serovar Andamana. For the research of agent into fragments of liver and kidney of rodents, 13 samples of each fragment were grown in Fletcher medium, with seven (53,8%) positive samples (three kidney samples and four liver samples). All rats were reactive by MAT. Related to PCR from the blood of free-living animals and in captivity, 38 animals (38%) were positive for Leptospira spp.; nine rodents (69,2%) presented positive fragments at PCR and four animals (30,8%) presented positive samples of the culture of the fragments at PCR for Leptospira spp. According to the results, we observed the occurrence of infection among the animals, needing the adoption of prophylactic measures to control this zoonosis in this place

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000424947-Texto+Completo-0.pdf: 989171 bytes, checksum: 8bf9e0904b8511d8e311bb590a23d7ff (MD5) Previous issue date: 2010 / Colorectal cancer is one of the neoplasias with higher incidence in humans. TF expression has been associated with development of metastasis and poor prognosis in many types of tumors, and it is considered one of the most important pro-angiogenic factors. This study aimed to demonstrate the differential of TF expression in colorectal carcinomas, by using the technique of quantification of nucleic acids (mRNA) by Polymerase Chain Reaction in Real Time (RT-PCR). Paraffin Blocks were studied in 19 patients with tumors (cases) and 15 without tumors (control) in the database of the Department of Colo-Proctology, at the São Lucas Hospital of PUCRS, and the intensity of TF expression was compared with the microvascular density DMV and with clinical and pathological findings. The tumor group presented a TF expression greater than that of the control group (p <0. 001), and it had a TF expression which, on average, was 7. 33 times higher than the control group. There was a significant association between the presence of metastasis and increased TF expression (p = 0. 001), as well as between age and TF expression in patients with tumors (p = 0. 026); however, we found no association between the expression of tissue factor and DMV (p = 0. 67) related to the location of tumors and sex of the patients. In conclusion, the differential expression of tissue factor in the tumor group was significantly higher than in the control group, and it also presented a positive association with older age of patients and the presence of metastases. / O adenocarcinoma colorretal é uma das neoplasias mais incidentes no ser humano. A expressão do Fator Tecidual (FT) foi associada ao desenvolvimento de metástases e a um pior prognóstico em várias neoplasias malignas, sendo considerado um dos mais importantes fatores pró-angiogênicos. Este estudo teve como objetivo principal demonstrar a expressão diferencial do FT em adenocarcinomas colorretais através da técnica de quantificação de ácidos nucléicos (mRNA) por Reação de Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR), Foram estudados blocos de parafina de 19 pacientes com tumor (casos) e 15 sem tumor (controles) do banco de dados, do Serviço de Colo-proctologia do Hospital São Lucas da PUCRS. A intensidade da expressão do TF foi comparada com a DMV e com dados clínicos e anatomo-patológicos. O grupo tumor apresentou expressão do FT maior do que o grupo controle (p< 0,001), e teve uma expressão do FT em média 7,33 vezes maior do que o grupo controle. Houve associação significativa entre a presença de metástase e a expressão aumentada do FT (p= 0,001), bem como entre a idade e a expressão do FT nos pacientes com tumor (p=0,026); entretanto, não foi encontrada associação entre a expressão do Fator Tecidual e a Densidade microvascular, (p=0,67), e em relação a localização dos tumores e sexo dos pacientes. Em conclusão, a expressão diferencial do FT do grupo tumor foi significativamente mais alta do que no grupo controle. Apresentou ainda uma associação positiva com a idade mais elevada dos pacientes e com a presença de metástases.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000444782-Texto+Completo-0.pdf: 1327290 bytes, checksum: 51c0bcf62b76809d6ed98fd7aca7d6b9 (MD5) Previous issue date: 2011 / The Wilms Tumors (WT) is the most frequent renal tumors of children, and although curable, fatal outcomes may occur. A number a genetic alterations have been suggested as associated factors but still, the exact pathogenesis of WT remains to be fully characterized. Tissue factor (TF) is a glycoprotein which happens to be a key receptor for factor VII/VIIa and is the primary initiator of blood coagulation. Also important, TF has been associated with processes that lead to angiogenesis. It is widely expressed among cells and tissues and recent evidences pointed out an important role for TF in cancer progression and metastasis. Recent evidences suggested that TF may have a role in WT since its immunodetection was associated with poor prognosis. In the present investigation the differential expression of TF was assessed in WT using real-time PCR of RNA retrieved from paraffin sections using microdissection. Different histological components of WT - (blastema, epithelial and stromal) were analysed and the results revealed that TF in blastema and epithelial components was upregulated (14. 38 and 16. 02-fold respectively, P<0. 001). Stroma and control non neoplasic tissues expressed similar levels of expression (P>0. 05). TF expression in metastatic lesions from WT was also singificantly upregulated compared to non metastatic lesions. Microvessel density was positively correlated with TF expression (r=0. 721). As described for other tumors, TF seems to play a role in malignancy or WT. Further investigations are warranted to better understand the pathways by which TF exerts its effects on tumor progression. Noteworthy, pharmacological strategies that aim at controlling angiogenesis through regulation of TF may be very promising. / Esta pesquisa teve como objetivo demonstrar a expressão diferencial do fator tecidual (FT) em tumor de Wilms (TW), através de um estudo do tipo transversal. O TW é a neoplasia renal maligna mais comum na infância. Os estudos sobre angiogênese em neoplasias malignas pediátricas apresentam possíveis vias de terapias antiangiogênicas, com menor agressividade e melhor especificidade tumoral. E, entre os fatores angiogênicos possíveis, foi estudo o Fator Tecidual (FT), proteína transmebrana com sua principal função no processo de hemostasia, mas que demonstra ter importante papel nos processos patológicos de tumorigênese, angiogênese e microambiente tumoral favorável à disseminação neoplásica. Sua expressão vem sendo associada às metástases e piora no prognóstico. Contuto, só a partir da pesquisa de Maciel et al (1) que a associação do FT com TW foi observada, onde se encontrou, utilizando imunoistoquímica, a correlação positiva entre a expressão do FT, recidiva tumoral e óbito. Então, a partir desses dados iniciais, a presente pesquisa analisou uma amostra com 27 espécimes fixadas em parafina de TW e 26 controles (área sem TW), para demonstrar a expressão diferencial do FT em TW, através da técnica de quantificação de ácidos nucléicos (RNAm) por Reação Cadeia de DNA Polimerase em Tempo Real (RT-PCR), avaliar a expressão do FT em diferentes componentes tumorais, com a densidade microvascular (DMV) do TW e a ocorrência de metástases. Foi observado aumento da expressão diferencial do FT no TW, sua maior variação do FT foi encontrada nos componentes blastematoso e epitelial, enquanto no componente estromal apresentou variação mínima em relação ao tecido não tumoral, em lesões metastáticas o FT se mostrou significativamente mais elevado, sugerindo um papel importante para essa proteína no processo de disseminação dessas células malignas, o aumento da DMV apresentou associação positiva com a expressão do FT. Os resultados apresentados corroboram os achados de Maciel et al (1) de forma mais concisa e quantitativa, enfatizando a importância do FT na biologia do TW.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000432089-Texto+Completo-0.pdf: 1649266 bytes, checksum: 3e3046dcd0a44006a99c0bdc29d77364 (MD5) Previous issue date: 2011 / Diagnostic methods of TB, nowadays, are prone to delay in diagnosis, increased false negative results and are not sensitive to many forms of paucibacillary disease. The aforementioned are critical since the infected individuals remain untreated in the community, increasing the likelihood of disease transmission and epidemic aggravation, which urges the need of new diagnostic methods. In this context, the aims of this study were to implement a quantitative nucleic acid-based diagnostic test for paucibacillary tuberculosis, enabling the identification and quantification of viable Mycobaterium tuberculosis (Mt) bacilli by fluorescence-assisted PCR, i. e., Real-Time PCR (RT PCR). The intergenic region of the inhA-mabA gene, which is single copy gene, was chosen as the target region to design specific primers and probes conjugated with fluorophores (TaqMan), because of its importance in the biosynthesis of mycolic acids. The construction of synthetic DNA flanking the target region served as standards for absolute quantification of nucleic acids. The DNA can remain intact after cell death, thus molecular diagnostic methods may overestimate the real number of viable cells in a sample. Cultures of Mt H37Rv were treated with different concentrations of EMA and PMA, DNA intercalating dyes that bind to the DNA of dead cells, rendering it insoluble, thus hampering its isolation. The concentration of 100μM PMA was chosen to treat sputum samples from patients with TB. Our method of diagnosis showed a broad sensitivity (96. 1%) when compared to samples of smear-positive sputum and it proved to be 47% more sensitive than Ziehl-Neelsen staining for smearnegative samples. / Nos tempos atuais, os métodos mais utilizados no diagnóstico da Tuberculose (TB) promovem um atraso inaceitável na liberação dos resultados, um elevado número de resultados falso-negativo e muitos não são sensíveis para formas paucibacilares da doença. Este fato se torna crítico uma vez que pacientes infectados continuam não tratados na comunidade aumentando a probabilidade de transmissão da doença e agravo da epidemia, o que corrobora a necessidade de aprimoramento ou desenvolvimento de novas metodologias. Diante deste fato, propusemos implementar um diagnóstico de DNA quantitativo para tuberculose paucibacilar, permitindo uma rápida identificação e quantificação de bacilos viáveis do Mycobacterium tuberculsosis (Mt) em amostras biológicas com o auxílio da PCR em Tempo Real (R-T PCR). A região intergênica do gene inhA-mabA, possui cópia única no genoma do Mt e devido à sua importância na biossíntese de ácidos micólicos, foi escolhida como região alvo para o desenho de primers e sondas específicos acoplados a fluoróforos (TaqMan). A construção de padrões de DNA sintéticos do Mt serviram como referência para a quantificação absoluta dos ácidos nucleicos, com alvo na região intergênica descrita acima. Eles foram amplificados do DNA genômico do Mt utilizando primers específicos, clonados e o DNA plasmidial foi purificado e quantificado para o desenvolvimento de uma curva padrão. Após a morte celular o DNA pode permanecer íntegro; assim, métodos de diagnóstico molecular podem superestimar o número real de células viáveis em uma amostra. Culturas de Mt H37Rv foram tratadas com diferentes concentrações de EMA e PMA, intercalantes de DNA que se ligam no DNA de células mortas tornan-do o insolúvel e desta forma impedindo a sua amplificação. A concentração de 100OM de PMA foi escolhida para tratar amostras de escarro de pacientes em tratamento, ou com suspeita de TB. Nosso método de diagnóstico mostrou uma alta sensibilidade (96,1%) quando comparado a amostras de escarro com baciloscopia positiva e se mostrou 47% mais sensível que a coloração Ziehl-Neelsen para amostras com baciloscopia negativa.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000417689-Texto+Completo-0.pdf: 446640 bytes, checksum: ad192136c1369a936420f7ce2238c5eb (MD5) Previous issue date: 2009 / Tuberculosis is one of the main causes of death around of the world, a disease caused by the pathogen Mycobacterium tuberculosis. The severity of this global epidemic is exacerbated by the co-infection with the HIV, that drastically modified the epidemiology of the same one, causing an increase in the transmission dynamics, morbididy and mortality of infectaded subjects and the emergence of M. tuberculosis multidrug-resistant strains. In Brazil, practically one million of people is infected. With the advance of molecular biology and genetics, a diverse type of methods have been developed to allow fast diagnosis and a better understanding of the pathogenicity of infectious illnesses of several microorganisms. This study focuses on the implementation of a test to detect and quantify Micobacterium sp. using the polimerase chain reaction (PCR) associated with fluorescence. To this purpose, the gene of the enoil-ACP redutase NADHdependent (inhA) was selected as the identification gene and primers/probe marked with fluorophores (TaqMan®) were designed and synthesized. Standards for absolute quantification were produced through cloning of the inhA sequence in plasmids and further used as standards in assays for quantification of DNA samples isolated from sputum from patients diagnosed with tuberculosis. In parallel, M. tuberculosis cultures were used to assess the variability of the PCR assay compared with spectrophotometry, a standard method for cell number determination. The results showed that the system using inhA as identification gene in the implemented conditions was capable to amplify 106 the 101 cells of M. tuberculosis in culture. Compared to the method of the spectrophotometry, the real-time assay was more sensible, presenting less variation in absolute numbers. Samples DNA samples isolated from sputum of TB patients (n=13) classified as ++ and +++ according to the baciloscopy method showed a wide range of Mycobacterium numbers, that reached three orders of magnitude. Importantly, DNA samples isolated from sputum of otherwise healthy individuals did not show any increase in fluorescence, which attested the specificity and reliability of the test. / A tuberculose é uma das principais causas de morte ao redor do mundo envolvendo um único agente infeccioso, o Mycobacterium tuberculosis. A severidade desta epidemia global é exacerbada pela co-infecção com o HIV, que alterou drasticamente a epidemiologia da mesma, causando um aumento na dinâmica de transmissão, morbidade e mortalidade dos infectados, e com o surgimento de cepas multi-resistentes a drogas. No Brasil, praticamente um milhão de pessoas está infectado. Com o avanço da genética e biologia molecular, diversos tipos de métodos laboratoriais vêm sendo utilizados para o rápido diagnóstico e estudo da patogenicidade de doenças infecciosas de diversos microorganismos. A disponibilidade de seqüências genômicas de um grande número de microrganismos patogênicos proverá uma melhor compreensão de sua genética evolutiva, virulência e interações com o hospedeiro. O presente estudo tratou da implementacão de um teste para deteccão e quantificação absoluta de Micobacterium sp. a partir do emprego da reação em cadeia da polimerase associada a fluorescência. Para tanto, o gene da enoil-ACP redutase NADHdependente (inhA) foi selecionado como gene identificador e primers e sonda marcada com fluoróforo (TaqMan®) foram desenhados. Padrões para quantificação absoluta foram produzidos a partir da clonagem da sequencia identificadora em plasmídios, sendo posteriormente empregados em ensaios para quantificacão de amostras de DNA isoladas de escarro de pacientes portadores de tuberculose e células de M. tuberculosis em cultura. Os resultados mostraram que o sistema utilizando a inhA como gene identificador nas condições implementadas foi capaz de amplificar de 106 a 101 células de M. tuberculosis em cultura. Comparativamente ao método da espectrofotometria, o ensaio em tempo real empregando o gene da inhA foi mais sensível, apresentando menor variação em número absolutos. Amostras de DNA (n=13) isoladas de escarro de pacientes portadores de tuberculose de ++ e +++ foram submetidas ao ensaio e foram postivamente detectadas com variação de três ordens de magnitude. Amostras de indivíduos controle saudáveis não apresentaram sinal positivo, atestando a especificidade do sistema.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448547-Texto+Completo-0.pdf: 664963 bytes, checksum: 65aa603337ed5626e1f7e96bf42a9364 (MD5) Previous issue date: 2013 / Abdominal angiostrongyliasis is a zoonotic infection caused by Angiostrongylus costaricensis, a nematode with intravascular location in the mesentery. Humans become accidentally infected by ingesting food or water contaminated with third stage larvae present in mucus secreted by intermediate hosts, terrestrial mollusks. The confirmed diagnosis of human infection is made only through histopathology of biopsies or mesenteric tissues removed during surgical treatment. There are many cases in which the pathology is very suggestive however there is no evidence of parasite structures in the sections. Thus, the goal of this study was to standardize the extraction of DNA from formalin fixed paraffin embedded (FFPE) tissues from mice experimentally infected with Angiostrongylus costaricensis for DNA detection and future study of human angiostrongyliasis suspected cases. Materials and methods: 45 samples of each tissue of liver, lung, intestine and mesentery, totalizing 180 samples from 15 infected mice with A. costaricensis. Worms of Angiostrongylus cantonensis were separately embedded in paraffin as controls. From embedded tissues, histological sections of 3 μm were performed and stained with HE to confirm the presence of parasite structures under the microscope. Approximately 24 to 31 sections of 10 μm were used for DNA extraction. Worms were embedded in paraffin under different conditions such as fixative chemicals, time of fixation and types of paraffin. Specific DNA of Angiostrongylus was detected by Polymerase Chain Reaction (PCR) to amplify a sequence of 232bp, previously designed for detection in human serum assays. There was a positive amplification in 33 samples from liver, 12 from lung, 45 from mesentery and 36 from intestine wall. For different conditions of embedment, the amplification of the DNA with the buffered formalin fixative was more efficient compared to the unbuffered one; the time of fixation and the commercial brand of wax did not affect the detection of nucleic acids, however, the ratio of paraffin to tissue appears to influence the performance of the method since samples with residual paraffin no amplification was obtained. The 232bp segment also was not visualized in samples where there was no evidence of presence of parasite structures, suggesting that histopathology findings should guide the choice of the samples for DNA extraction, and those most likely to have parasite structures surrounding the lesion, even if degraded. The description of the performance of PCR in paraffin embedded tissues as a diagnostic tool in human abdominal angiostrongyliasis depends on the detailed evaluation criteria in histopathology and their association with a positive amplification of the specific probe. / Angiostrongilíase abdominal é uma infecção zoonótica causada por Angiostrongylus costaricensis, um nematódeo com localização intravascular no mesentério. O homem se infecta acidentalmente ao ingerir alimentos ou água contaminados com larvas de terceiro estágio presentes no muco secretado por moluscos terrestres, hospedeiros intermediários. O diagnóstico confirmado da infecção humana é feito pelo exame histopatológico de biópsias ou segmentos ressecados durante o tratamento cirúrgico de casos complicados. Há muitos casos em que a histopatologia é muito sugestiva, porém sem evidenciarem-se estruturas do parasito nos cortes. Desse modo, o objetivo foi padronizar a extração de DNA em tecidos embebidos em parafina em modelo murino visando à detecção de ácidos nucléicos e posterior utilização no estudo de casos suspeitos a partir do exame histopatológico em humanos. Materiais e Métodos: 45 amostras de cada tecido de fígado, pulmão, mesentério e intestino, totalizando 180 amostras de 15 camundongos infectados com Angiostrongylus costaricensis; e vermes de Angiostrongylus cantonensis foram embebidos separadamente em parafina e nesses blocos contendo os tecidos foram realizados cortes histológicos de 3 μm para coloração por Hematoxilina-Eosina, e confirmado a presença de estruturas parasitárias, foram coletados de 24 a 31 cortes de 10 μm em um microtubo para a extração de DNA. Para a padronização do método, vermes foram embebidos em parafina em diferentes condições tais como o tipo de fixador, tempo de fixação e marcas comerciais de parafina. A partir dos cortes foram realizadas as extrações de DNA com o Kit Quiagen DNEasy tissue. Para a detecção de DNA específico de Angiostrongylus foi utilizado a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), para amplificação de uma sequência de 232pb, previamente desenhada para ensaios de detecção em soro humano. Em 33 amostras de fígado, 12 de pulmão, 45 de mesentério e 36 da parede intestinal houve amplificação do segmento de 232pb. Para as diferentes condições de emblocamento, as amplificações do DNA das amostras a partir do fixador formalina tamponada foram mais frequentes quando comparado com a formalina não tamponada; o tempo de fixação e o tipo de parafina não interferiram na detecção de ácidos nucléicos, entretanto, a quantidade de parafina no tecido parece influenciar no desempenho do método, pois nas amostras onde havia excesso de parafina não houve amplificação. O segmento de 232pb também não foi visualizado nas amostras onde não foi evidenciada a presença de estruturas parasitárias, sugerindo que a informação provinda da histopatologia deve orientar a retirada da amostra para extração de DNA, como aquelas de maior probabilidade de possuir estruturas parasitárias nas proximidades da lesão, mesmo que degradadas. A descrição do desempenho da PCR como recurso diagnóstico da infecção humana, em material embebido em parafina, depende da avaliação detalhada dos critérios de suspeita na histopatologia correlacionada com a frequência e reprodutibilidade do resultado da extração de DNA e sua amplificação.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-23Bitstream added on 2014-06-13T19:03:34Z : No. of bitstreams: 1 antunes_jmap_dr_botfmvz.pdf: 459822 bytes, checksum: 49113c35cf13816409ac1cccdd0ec4f8 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Mundialmente a brucelose continua sendo um problema econômico e de saúde pública. A brucelose ovina é reconhecida como a mais importante causa de epididimite, sendo uma das principais causadoras de infertilidade em ovinos. Os mecanismos imunes envolvidos na defesa e eventualmente na persistência e manutenção do agente são desconhecidos. Brucellas spp. geram somente uma resposta inflamatória moderada e os estudos da patogenia da brucelose ovina são escassos. Recentes avanços demonstram que a resposta inflamatória induzida pelas Brucellas spp. representam provavelmente o resultado de uma tentativa de evasão e supressão da resposta imune hospedeira. Utilizando as tecnologias de RT-PCR em tempo real (q) e microarranjos este trabalho avaliou a expressão gênica da resposta imune e inflamatória na brucelose experimental ovina. O estudo apresenta a primeira análise do perfil de expressão gênica de citocinas através de RT-qPCR em tecidos reprodutivos e não reprodutivos de carneiros experimentalmente infectados com cepa de B. ovis PA até 240 dias pós infecção (dpi). O estudo também demonstra a primeira análise geral da expressão gênica por meio de microarranjos em tecidos reprodutivos e pool de linfonodos de carneiros experimentalmente infectados com cepa de B. ovis PA até 240 dpi. Neste trabalho demonstrou a persistência da B. ovis e o perfil inflamatório da resposta imune gerado pela infecção. Com este estudo espera-se aumentar o conhecimento da patogênese da B. ovis em carneiros infectados / Globally, brucellosis remains an economic problem and public health threat. The ovine brucellosis is recognized as the most important cause of epididymitis, one of the main causes of infertility in sheep. The mechanisms involved in immune defense and possibly the persistence and maintenance of the agent are unknown. Brucellas spp. generate only a moderate inflammatory response, and studies of the pathogenesis of ovine brucellosis are scarce. Recent developments have shown that Brucella spp. induces a moderate inflammatory response probably the result of an attempt to escape and to suppress the host immune response. Through real time (q) RT-PCR and microarrays the purpose this study evaluated the gene expression of immune and inflammatory response in experimental ovine brucellosis. The study demonstrated for the first time the gene expression profile of cytokines by RT-qPCR in reproductive and non reproductive tissues of rams experimentally infected with B. ovis PA strain up to 240 days post infection (dpi). The research also showed the first overall analysis of gene expression using microarrays in reproductive tissues and pool of lymph nodes of rams experimentally infected with B. ovis PA strain up to 240 dpi. The study demonstrated the persistence of B. ovis and the inflammatory profile of immune response occasioned due the infection. These results are expected to increase the knowledge of the pathogenesis of B. ovis in sheep