Dans le domaine de la recherche de gènes causaux, il est maintenant connu que plusieurs caractères complexes peuvent en fait être influencés par une multitude de gènes. Dans ce mémoire, nous présentons l'adaptation d'une méthode de cartographie génétique fine à la cartographie de caractère polygénique. Nous présentons tout d'abord un aperçu de certains outils statistiques utilisés en génétique. En particulier, certaines mesures d'association généralement employées en cartographie génétique. Puis, nous présentons la méthode de cartographie que nous souhaitons adapter: méthode qui suppose que le caractère est causé par l'effet d'un seul gène. Nous supposons plutôt que le caractère est causé par la combinaison de deux gènes. Après avoir présenté notre modélisation et les aspects théoriques de l'adaptation proposée, nous utilisons des données simulées pour tester nos développements. Nous comparons aussi nos résultats avec ceux obtenus avec une mesure d'association, ainsi qu'avec la méthode de cartographie dont nous proposons une adaptation. Les résultats démontrent la nécessité de développer des méthodes de cartographie génétique adaptées aux caractères polygéniques ; avec quelques améliorations concernant l'inférence des génotypes aux gènes causaux, notre adaptation devrait offrir de meilleurs résultats que les autres méthodes présentées. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : statistique génétique, cartographie génétique, caractère polygénique, processus de coalescence, arbre de recombinaison ancestral

Manipulation de la recombinaison chez une plante cultivée, le riz.L’accroissement prévisible de la population mondiale ainsi que les conséquences du changement climatique obligent les sélectionneurs à créer de nouvelles variétés plus productives et plus résilientes. Les nouvelles combinaisons d’allèles favorables sont issues de la recombinaison génétique entre chromosomes homologues dont le siège est la prophase de première division de méiose. De récentes avancées chez la plante modèle Arabidopsis ont montré que l'inactivation de certains gènes permet de manipuler la méiose pour abolir ou au contraire augmenter très significativement la recombinaison. Les mécanismes de la méiose étant relativement bien conservés chez les eucaryotes, l’objectif de cette thèse était de transposer ces avancées chez une plante cultivée importante, le riz. Abolir la recombinaison méiotique permettrait de propager de façon clonale par grain des formules variétales hybrides F1 dont le rendement est de 20% supérieur à celui des lignées pures chez le riz mais dont les semences restent peu utilisées par les riziculteurs de subsistance. Les travaux réalisés dans une première partie de la thèse ont montré que le cumul de trois mutations Ososd1, pair1 et Osrec8, permettait d’obtenir des gamètes clonaux diploïdes mâles et femelles. Le phénotype apoméiotique obtenu, appelé MiMe (Mitosis instead of meiosis) chez Arabidopsis, peut être utilisé pour tester différentes stratégies d’induction de la parthénogenèse afin de produire des grains formant des plantes diploïdes clonales apomictiques. Une optimisation du mécanisme permettrait d'envisager l'utilisation de l'apomixie pour fixer l'hétérosis dans les semences hybrides F1. Par ailleurs, une augmentation globale ou locale de la recombinaison méiotique est recherchée car elle permettrait de diminuer la taille des populations de sélection et de réduire la taille des segments chromosomiques introduits dans les variétés élite de riz. Nous avons montré dans une seconde partie, que la mutation du gène OsRECQl4 codant pour une hélicase permet d'augmenter le taux de recombinaison d'un facteur de 3,3 fois faisant passer la taille de la carte génétique de 1670 cM à 5538 cM sans affecter la fertilité de la plante ni le déroulement de la méiose. Chez les plantes affectées dans la fonction d’une autre hélicase, OsFANCM, le taux de recombinaison a été également augmenté mais dans une moindre mesure (x 2,2). L’augmentation de la recombinaison s’opère sur l'ensemble des bras chromosomiques sauf au niveau des centromères. Ces résultats confirment ceux obtenus chez A. thaliana qui ont montré le rôle de régulateur négatif des crossing-overs (CO) des protéines RECQ4 et FANCM. La combinaison en cours de ces mutations entre elles ou avec celle affectant l’AAA-ATPase FIGL1 permet d’espérer une augmentation de la recombinaison encore supérieure. Ces résultats ouvrent la voie à l'utilisation des gènes anti-COs pour augmenter de façon globale le nombre de recombinants dans les croisements chez le riz et sans doute chez les autres céréales. Pour offrir une possibilité concrète aux sélectionneurs d'utiliser les gènes anti-CO, nous avons montré que la technologie CRISPR/cas9 permet d'éteindre l'expression de OsFANCM OsRECQl4 et OsFIGL1. / Manipulation of recombination in a crop, rice.The forecasted increase of world population as well as the consequences of global climate change oblige plant breeders to develop new varieties that are both more productive and resilient. Novel combinations of favourable alleles are generated through genetic recombination between homologous chromosomes, which occurs during the prophase of the first division of meiosis. Recent advances in the model plant Arabidopsis have demonstrated that the inactivation of some genes allows meiosis manipulation resulting in either an abolishment or in contrast, a significant enhancement of meiotic recombination. The meiosis mechanisms being relatively conserved across eucaryotes, the overall objective of this thesis was to transfer these advances to a crop of crucial importance, rice. To abolish meiotic recombination would allow the clonal propagation by seeds of F hybrids, which exhibit a 20% yield enhancement compared to that of pure lines in rice but remain rarely used in subsistence farming. In a first part, we showed that rice plants cumulating 3 mutations inactivating Ososd1, pair1 and Osrec8, formed clonal diploid male and female gametes. This apomeiotic phenotype, called MiMe (Mitosis instead of meiosis) in Arabidopsis, can serve as material to assay several strategies of parthenogenetic induction that would result in seed forming diploid clonal plants. Further optimization of the mechanisms would allow the use of apomixis to fix heterosis in hybrid seeds. Global and local enhancement of recombination is another desirable goal since it would allow a reduction in breeding population size and a downsizing of the introgressed chromosomal segments in elite plant materials. In a second part, we showed that mutation in the DNA helicase gene OsRECQl4 conducted to a 3.3 fold increase of recombination and inflated the genetic map size from de 1670 cM to 5538 cM, without altering plant fertility nor meiosis progression. Plants altered in a second DNA helicase, OsFANCM, exhibited a more modest 2.2 fold recombination enhancement. Recombination increase operated along the whole chromosome arms except at the centromere level. These results confirms the negative regulator role of RECQ4 and FANCM on crossing overs (CO), previously reported in Arabidopsis. On going combination of these mutations together with that altering the l’AAA-ATPase FIGL1 should conduct to an even higher recombination enhancement. These results pave the way to the use of anti-CO genes to enhance recombinant recovery in crosses of rice and possibly of other cereals. To provide breeders with a workable anti-CO system, we eventually showed that the CRISPR/Cas9 technology can be used to abolish OsFANCM, OsRECQl4 and OsFIGL1 expression.

La recombinaison méiotique n'est pas distribué de manière aléatoire le long des chromosomes, mais est caractérisée par des domaines froids et chauds qui limitent la diversité génétique transmise par les gamètes. Cependant, le profil de la recombinaison méiotique peut être modifiée, étant donné que la fusion de l’ endonucléase Spo11 au domaine de liaison à l'ADN de Gal4 est suffisante pour favoriser la formation des cassures double brin (CDB) et la recombinaison à proximité des sites de liaison de Gal4, dans la levure et dans les souris. Ici, dans la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons étudié l'effet de la fusion de Spo11 à 8 protéines de liaison à l'ADN lors de la méiose. Comme modules de ciblage, nous avons utilisé des facteurs de transcription de levure et des protéines artificiels de liaison à l'ADN (TALEs et ZFs), qui sont apparus comme des outils efficaces pour faire varier la position et / ou le nombre de sites ciblés. Lors de l'expression de chacun des fusions Spo11, nous avons examiné la progression de la méiose, la formation des CDB dans les sites naturels et ciblées ainsi que le niveau relatif de la recombinaison méiotique. Ce travail dans l’organisme modèle levure ouvre de nouvelles voies pour modifier la recombinaison méiotique chez d'autres organismes, tels que des mammifères et des plantes, pour augmenter la diversité génétique dans les sites d'intérêt et disséquer l'information génétique, en surmontant les limitations dues à la liaison génétique. / Meiotic recombination is not randomly distributed along the chromosomes, but is characterized by hot and cold domains that limit the genetic diversity transmitted by the gametes. However, the recombination profile can be modified, since the tethering of Spo11 endonuclease, upon fusion to the Gal4 DNA-binding domain, is sufficient to enhance DSB formation and recombination near several Gal4 consensus binding sites, in yeast and in mouse. Here, in the yeast Saccharomyces cerevisiae, we studied the effect of Spo11 fusions to 8 different DNA-binding proteins during meiosis. As targeting modules, we used yeast full-length transcription factors and artificial DNA-binding modules (TALEs and ZFs), which emerged to be efficient tools to vary the location and /or the number of targeted sites. Upon expression of each of the Spo11 fusions, we examined meiotic progression, DSB formation at natural and targeted sites as well as the relative level of meiotic recombination. This work in the yeast model opens new avenues to modify meiotic recombination in other organisms, such as mammals and plants, to boost genetic diversity at sites of interest and to dissect the genetic information, overcoming the restrictions due to the genetic linkage.

Dans les cellules somatiques, la recombinaison des chromosomes homologues, suivie d'une ségrégation équationnelle, mène à des évènements de perte d'hétérozygotie qui permettent l'expression d'allèles récessifs et la production de nouvelles combinaisons d'allèle qui sont potentiellement bénéfiques lors de la sélection Darwinienne. Cependant, les recombinaisons inter-homologues sont rares dans les cellules somatiques, réduisant ainsi la possibilité de générer des recombinants. Ici, nous avons exploré une propriété de S. cerevisiae à entrer le programme de développement méiotique, induire au travers du génome des cassures double-brins dépendantes de Spo11, et retourner dans un cycle de division mitotique, un processus appelé retour en croissance végétative (" return to growth " ou RTG). Le séquençage du génome de 36 souches RTG dérivées de la souche diploïde S288c/SK1 démontre que ces souches RTG sont bien diploïdes, avec des génomes recombinés mosaïques. Les génotypes des souches RTG portent de 5 à 87 régions homozygotes, dues à des évènements de perte d'hétérozygotie (" loss of heterozygosity " ou LOH) de longueur variées, allant de quelques nucléotides à plusieurs centaines de kilobases. En outre, nous montrons que l'itération du processus de RTG augmente de manière séquentielle le pourcentage d'homozygotie du génome. Des analyses phénotype/génotype des souches RTG pour les caractères d'auxotrophies ou de résistance à l'arsénite valident le potentiel de cette procédure de diversification du génome pour cartographier des caractères complexes (" quantitative trait loci " ou QTL) dans des souches diploïdes, sans passer par le cycle complet de reproduction sexuée. / In somatic cells, recombination between the homologous chromosomes, followed by equational segregation, leads to loss of heterozygosity events (LOH), allowing the expression of recessive alleles and the production of novel allele combinations that are potentially beneficial upon Darwinian selection. However, inter-homolog recombination in somatic cells is rare, thus reducing the potential to generate recombinants. Here, we explored the property of S. cerevisiae to enter the meiotic developmental program, induce meiotic Spo11-dependent double-strand breaks genome-wide and return to mitotic growth, a process known as Return To Growth (RTG). Whole genome sequencing of 36 RTG strains derived from the hybrid S288c/SK1 diploid strain demonstrates that the RTGs are bona fide diploids with mosaic recombined genome. Individual RTG genotypes comprised 5 to 87 homozygous regions due to loss of heterozygous (LOH) events of various lengths, varying between a few nucleotides up to several hundred kilobases. Furthermore, we show that the iteration of the RTG process orderly increments the percentage of homozygosity. Phenotype/genotype analysis of the RTG strains for the auxotrophic and arsenate resistance traits validates the potential of this procedure of genome diversification to rapidly map complex traits loci (QTLs) in diploid strains, without going through sexual reproduction.

Chez les organismes à reproduction sexuée, les gamètes (cellules sexuelles) sont produits par un processus comprenant deux divisions successives appelé méiose. Durant la première division, la recombinaison méiotique permet un contact physique et un échange de matériel génétique entre les chromosomes homologues. Elle résulte de la réparation, par recombinaison homologue, de cassures double-brin de l’ADN générées par la protéine SPO11 au début de la prophase de la première division. Chez les mammifères, les évènements de recombinaison se situent dans des régions de 1-2 kb appelées points chauds de recombinaison. La protéine PRDM9, qui contient un domaine PR/SET et des doigts de zinc, détermine la position des points chauds en ciblant des séquences spécifiques d’ADN par ses doigts de zinc. Son domaine PR/SET porte une activité lysine méthyltransférase, corrélée avec un enrichissement de H3K4me3 au niveau des points chauds, dans les spermatocytes.Les objectifs de mon travail étaient de caractériser l’activité catalytique de PRDM9 et d’étudier son rôle dans l’initiation de la recombinaison chez la souris. La structure cristallisée du domaine PR/SET de PRDM9 en complexe avec un peptide de l’histone H3 nous a permis de montrer que ce domaine adopte une structure similaire aux domaines SET canoniques portés par d’autres méthyltransférases, et d’identifier des résidus clés pour son activité. Nous montrons que le domaine PR/SET de PRDM9 méthyle in vitro non seulement H3K4, mais aussi H3K9 et H3K36. Nous confirmons in vivo la triméthylation de H3K36 dépendante de PRDM9 dans les spermatocytes. Utilisant deux allèles différents de PRDM9, Prdm9b et Prdm9wm7, qui activent des points chauds différents grâce à leur spécificité de séquence, nous avons généré des lignées de souris exprimant des allèles mutés du domaine PR/SET dont l’activité catalytique est abolie, Prdm9wm7G278A ou Prdm9wm7Y357F. La protéine mutante PRDM9wm7Y357F se fixe à ses cibles, mais n’y permet in vivo ni la triméthylation de H3K4, ni celle de H3K36. Enfin, nous montrons que l’activité catalytique de PRDM9 est requise pour promouvoir la recombinaison aux points chauds. Chez les souris exprimant uniquement un allèle Prdm9 muté, les spermatocytes présentent des défauts d’appariement des chromosomes homologues et de réparation des cassures double-brin de l’ADN, ainsi qu’un arrêt de la progression en méiose en milieu de prophase I, phénotype similaire à celui de la souris KO pour Prdm9 (Prdm9-/-). L’ensemble de nos résultats met en évidence le rôle primordial de l’activité méthyltransférase de PRDM9 pour la détermination des sites de recombinaison méiotique et plus généralement pour la progression de la méiose et finalement la formation de gamètes chez la souris. / In sexually reproducing organisms, gametes are produced by a process comprising two successive division, called meiosis. During the first division, meiotic recombination enables a physical contact and an exchange of genetic material between homologous chromosomes. Meiotic recombination results from the repair, by homologous recombination, of programmed DNA double-strand breaks (DSBs) catalyzed by the SPO11 protein at the beginning of prophase I. In mammals, recombination events are localized in 1 to 2 kb-long regions called recombination hotspots. PRDM9, a PR/SET domain and zinc finger-containing protein, determines hotspot localization by targeting specific DNA sequences through its zinc finger array. Notably, PRDM9 PR/SET-domain possesses an H3K4 methyltransferase activity, while PRDM9-dependent H3K4me3 enrichment is found at hotspots in spermatocytes.We aimed at characterizing PRDM9 methyltransferase activity and studying its role in meiotic recombination initiation in mouse. The crystal structure of PRDM9 PR/SET domain, which we generated in complex with a histone H3 peptide, shows that this domain adopts a similar topology to that of classical SET domains and allowed us to identify key residues for its catalytic activity. PRDM9 PR/SET domain catalyzes not only mono-, di- and trimethylation of H3K4, but also of H3K9 and H3K36. We confirmed PRDM9 dependent H3K36 trimethylation in spermatocytes. Taking advantage of the distinct DNA binding specificity of two Prdm9 alleles, Prdm9b and Prdm9wm7, each activating its own set of hotspots, we generated transgenic mouse lines expressing either Prdm9wm7G278A or Prdm9wm7Y357F mutant allele together with the endogenous wild-type Prdm9b allele. Both G278A and Y357F mutations abolish PRDM9 catalytic activity. We show that PRDM9wm7Y357F binds normally to its genomic targets, but is not able to promote H3K4 nor H3K36 trimethylation at these sites. In addition, PRDM9wm7Y357F does not promote recombination at one Prdm9wm7-dependent hotspot, showing that PRDM9 catalytic activity is required for promoting recombination at hotspots. In mice expressing only the mutant allele (Prdm9wm7G278A or Prdm9wm7Y357F), spermatocytes display defects in homologous chromosome synapsis and DSBs repair, as well as an arrest of meiosis at the mid-prophase I. This phenotype is similar to that of Prdm9 KO mice. Overall, our results demonstrate the role of PRDM9 methyltransferase activity in determining recombination hotspots and more generally for meiotic progression and gametes formation.

Les génomes bactériens sont le siège de deux phénomènes de transferts de l'information génétique: les transferts verticaux et horizontaux. Leur coéxistence ce qui implique une délicate balance entre maintenance et instabilité des génomes. L'information génétique des bactéries est généralement portée par des réplicons circulaires : chromosomes et plasmides. Un des sérieux désavantages des réplicons circulaires est leur grande sensibilité aux réarrangements causés par recombinaison homologue. Un nombre impair de crossing-over pendant ou après la réplication de ces réplicons entraine la formation de molécules dimériques. Ces dimères correspondent à une fusion covalente des deux copies du réplicon, non-résolus les dimères ne ségrégeront pas correctement au moment de la division cellulaire. La résolution des formes multimériques des plasmides et chromosomes circulaires est médiée par un mécanisme de recombinaison spécifique de site efficace et extrêmement contrôlé : le système Xer. Les mécanismes de résolution des dimères de chromosome et de plasmide sont différents. De plus, bien que le système de résolution de dimères de chromosome soit contrôlé dans le temps et dans l'espace, chez de nombreuses bactéries il est détourné de son rôle principal par des éléments génétiques mobiles appelés IMEXs (Integrative Mobile Elements exploiting Xer). Le système Xer est alors impliqué dans les transferts verticaux et horizontaux de gènes, illustrant comment une même machine moléculaire peut intervenir dans plusieurs processus biologiques. Pour cela, des acteurs externes différents vont jouer un rôle clé dans le contrôle d'une machine Xer centrale et ainsi apporter une diversité de mécanismes, chacun dédié à une processus biologique propre. Afin de mieux comprendre les contrôles différentiels du système Xer, je me suis intéressé aux éléments génétiques mobiles. Via l'étude de la stabilité intra-chromosomique des IMEXs et de la résolution des dimères de certains grands plasmides, j'ai pu montrer que FtsK, la protéine activatrice de la résolution des dimères de chromosome, est impliquée dans la stabilisation des éléments acquis par transferts horizontaux de gènes. / The genetic information of bacteria is generally carried by circular replicons: chromosomes and plasmids. One of the serious disadvantages of circular replicons is their high sensitivity to rearrangements caused by homologous recombination. An odd number of crossing-over, during or after the replication of these replicons, results in the formation of dimeric molecules. These dimers correspond to a covalent fusion between the two copies of the replicon. If they are not resolved, the dimers will not segregate properly at the time of cell division. The resolution of multimeric forms of circular plasmids and chromosomes is mediated by an efficient and highly controlled site-specific recombination mechanism: the Xer system. The mechanisms of resolution of the chromosome and plasmid dimers are different. In addition, even if the chromosome dimer resolution system is controlled in time and space, in many bacteria it is hijacked by mobile genetic elements called IMEXs (Integrative Mobile Elements Exploiting Xer). The Xer system is then involved in the vertical and horizontal transfer of genes, illustrating how the same molecular machine can intervene in several biological processes. For this, different external actors will play a key role in controlling a central Xer machine and thus bring a variety of mechanisms, each dedicated to a specific biological process. In order to better understand the differential controls of the Xer system, I focused on mobile genetic elements. By studying the intra-chromosomal stability of IMEXs and the resolution of large plasmids dimers, I was able to show that FtsK is involved in the stabilization of the acquired mobile genetic elements.

La recombinaison homologue au cours de la méiose est un événement essentiel pour la ségrégation fidèle des chromosomes homologues, et contribue à la production de la diversité génétique. La recombinaison méiotique est initiée par l'induction de cassures double brin d'ADN (CDB), catalysée par SPO11, à des régions spécifiques du génome appelés points chauds. Récemment, il a été montré que PRDM9 est un déterminant majeur des points chauds de recombinaison chez la souris et l'homme. PRDM9 contient un domaine PR/SET avec une activité d'histone méthyltransférase, un domaine de liaison à l'ADN constitué d'une série de doigts de zinc en tandem, et des domaines prédit pour être impliqué dans des interactions protéine-protéine. Notre modèle de travail récent place PRDM9 comme un élément clé pour l'initiation de la recombinaison méiotique: PRDM9 se lie à l'ADN via le domaine à doigts de zinc, et modifie localement la structure de la chromatine. Grâce à un processus encore inconnu, SPO11 est recruté à proximité des sites de liaison de PRDM9, où il catalyse la formation de CDB. Le but de ma thèse était de répondre à la question : comment PRDM9 recrute-t-elle la machinerie CDB aux points chauds ? Pour mieux comprendre ce mécanisme, je me suis attaché à la caractérisation des protéines interagissant avec PRDM9. Les protéines interagissant potentiellement avec PRDM9 ont été identifiées, par criblage double hybrides dans la levure avec des banques d'ADNc issues de testicules, et par purification par affinité-spectrométrie de masse des complexes PRDM9. La cartographie par double hybride avec des formes tronquées de PRDM9 a révélé que le domaine KRAB atypique de PRDM9 joue un rôle clé dans les interactions protéine-protéine. Les protéines identifiées comprennent CXXC1, un composant évolutivement conservé du complexe SET1-COMPASS, et HELLS qui est indispensable à la progression de la méiose I chez la souris. J’ai montré que ces deux protéines sont exprimées au cours de la spermatogenèse chez la souris. Puisque Spp1, l'orthologue chez S. cerevisiae de CXXC1, est connu pour servir de médiateur de recrutement de la machinerie de formation des CDB aux sites de CBD, l'interaction entre PRDM9 et CXXC1 pourrait refléter la conservation de la fonction méiotique de Spp1 chez la souris. / Meiotic homologous recombination is an essential event for faithful segregation of homologous chromosomes, and contributes to production of genetic diversity. Meiotic recombination is initiated by the induction of programmed DNA double strand breaks (DSBs), which are catalyzed by SPO11, at specific regions of the genome called hotspots. Recently, PRDM9 was reported as a major determinant of recombination hotspots in mouse and human. PRDM9 contains a PR/SET domain with histone methyltransferase activity, a zinc-finger array, and putative domains for protein-protein interactions. Our recent working model involves PRDM9 as a key component for the initiation of meiotic recombination: PRDM9 binds DNA via the zinc-finger array, and modifies chromatin structure locally. Through an unknown process, SPO11 is recruited and catalyzes DSB formation near PRDM9-bound sites. The aim of my thesis was to address the question: how does PRDM9 recruit DSB machinery to hotspots. To gain insight into this mechanism, I focused on characterization of PRDM9-interacting proteins. Potential interactors of PRDM9 were identified by yeast two hybrid (Y2H) screens with testis cDNA libraries and by affinity purification-mass spectrometry of PRDM9 complexes. Further Y2H assays with truncated derivatives of PRDM9 revealed that the atypical KRAB domain of PRDM9 plays a key role in protein-protein interactions. The identified proteins include CXXC1, a component of the evolutionarily conserved SET1-COMPASS complex, and HELLS, which is indispensable for progression of meiotic prophase I in mouse. Both proteins were found to be expressed during mouse spermatogenesis. Since Spp1, the S.cerevisiae orthologue of CXXC1, is known to mediate tethering of DSB sites to DSB machinery, the interaction between PRDM9 and CXXC1 might imply potential conservation of the Spp1 function in mouse meiosis.

La recombinaison homologue (RH) est une réaction universelle qui assure la maintenance des génomes. Elle participe aussi à leur variabilité. De fait, dans les trois domaines du vivant elle est au centre de nombreux processus biologiques tels que la réparation des dommages à l'ADN ou encore le brassage génétique au cours de la méiose. Chez les bactéries, la RH est également impliquée dans les processus de transferts horizontaux qui favorisent les échanges génétiques entre les espèces. La transformation génétique est l'un de ces processus largement répandus parmi les bactéries. Celle-ci a spécifiquement lieu lorsque les cellules entrent dans un état physiologique particulier nommé la compétence. Comparativement aux autres types de transferts horizontaux, la transformation génétique à la caractéristique d'être entièrement contrôlée par la cellule receveuse qui dirige l'intégration d'ADN exogène capturé dans son milieu extérieur. Le but de ma thèse a été d'améliorer notre compréhension moléculaire de la voie de RH spécifique de la transformation génétique de Streptococcus pneumoniae qui permettrait à ce pathogène non seulement d'échapper aux vaccins mais également d'acquérir de nouvelles résistances aux antibiotiques. Bien qu'elle présente des variations d'un organisme à l'autre, la RH peut fondamentalement être décomposée en trois phases successives catalysées par la recombinase RecA chez les bactéries. La phase présynaptique consiste en la polymérisation de la recombinase sur l'ADN simple brin (sb) générant un nucléofilament. L'étape synaptique comprend l'appariement du nucléofilament avec celui des deux brins de la séquence homologue qui lui est complémentaire. Elle aboutit à l'apparition d'une D-loop, intermédiaire de recombinaison résultant de la jonction entre les deux molécules ADN engagées. Enfin, la phase postsynaptique constitue l'étape finale durant laquelle les jonctions entre les molécules ADN sont maturées puis clivées de manière à maintenir l'intégrité double brin du génome. L'action optimale de la recombinase au cours de ces trois étapes nécessite l'assistance de partenaires protéiques spécifiques au processus au sein duquel la réaction de RH intervient. Dans le cadre de la transformation génétique, la RMP (recombination mediator protein) DprA et la protéine de liaison à l'ADNsb SsbB sont deux partenaires de RecA spécifiquement produits par les cellules en état de compétence. Nous avons révélé in vitro que leurs actions conjuguées permettent d'améliorer l'efficacité de la RH catalysée par RecA en facilitant l'étape présynaptique de la réaction. De plus, nous avons montré que contrairement à SsbB, la protéine SsbA constitutive et essentielle ne stimule pas la RH spécifique de la transformation génétique de S. pneumoniae. Ce résultat suggère que les deux paralogues n'interviennent pas au cours des mêmes processus biologiques. La protéine RadA, ubiquitaire et très conservée parmi les bactéries, est un autre partenaire de RecA constitutivement produit par les cellules mais spécifiquement induit lors de la transformation génétique de S. pneumoniae. Par une combinaison d'approches in vivo, in vitro et structurale, nous avons mis en évidence d'une part, l'appartenance de RadA à la famille SF4 d'hélicases de type DnaB, et d'autre part son rôle clef dans la phase postsynaptique de la RH. Ce travail a permis de proposer un modèle inédit du mécanisme de migration de branches permettant la maturation des intermédiaires de recombinaison. Via son interaction avec RecA, nous proposons que RadA accède aux deux brins de l'ADN receveur de part et d'autre de la D-loop. Ainsi chargé symétriquement, RadA transloquerait de manière divergente le long des deux ADNsb dans le sens 5'-3' permettant ainsi l'ouverture du duplex receveur. L'incorporation de l'ADNsb envahissant serait ainsi facilitée par l'action de RadA tant au cours de la transformation génétique que des processus de maintenance faisant intervenir la RH / Homologous recombination (HR) is a central biological process in living organisms across all three domains of life. Crucial both for genomic maintenance and genetic plasticity, HR acts either to repair harmful DNA breaks or to produce new DNA combinations on chromosomes. In bacteria, HR is also used to exchange genetic material between different strains or species through horizontal gene transfers processes. Genetic transformation is one of those processes, widely distributed among species. Genetic transformation, occurring during a distinct physiological state called competence, is entirely directed by the recipient cell which uses exogenous DNA as a source of transferred genetic material. The goal of my PhD was to provide a molecular understanding of the specific HR pathway operating during the genetic transformation process of Streptococcus pneumoniae which enables this human pathogen to escape vaccine by capsular serotype switching as well as to acquire new antibiotics resistance genes. Although HR mechanisms vary among different organisms and cell types, the same three basic steps are conserved. During the pre-synaptic phase, the highly conserved recombinase named RecA in bacteria polymerises along ssDNA. The synaptic step proceeds through invasion of this nucleofilament into complementary duplex DNA, promoting the formation of joint molecules called D-loops. Finally, the post-synaptic phase corresponds to the maturation and clivage of thoses branched structures to preserve genomic integrity. To complete this strand exchange reaction, RecA requires the assistance of several specific partners depending on the context of the HR event. During genetic transformation, the recombination mediator protein DprA and the ssDNA binding protein SsbB are such partners specifically produced in the competence state. We have shown in vitro that their interplay with RecA improves HR efficiency by facilitating the pre-synaptic step of the reaction. Moreover, we have shown that, contrary to SsbB, the essential SsbA protein does not stimulate this specific HR reaction, suggesting that the two paralogous proteins could be implicated in different processes. The ubiquitous bacterial RadA in an other RecA partner constitutively produced by the cells and specifically induced during genetic transformation of S. pneumoniae. Using a combination of in vivo, in vitro and structural approaches, we have shown that RadA is a DnaB-like helicase implicated in the post-synaptic phase of HR. This structural and functional analysis of RadA leads to an unprecedented model of DNA branch migration acting to maturate D-loops structures. Through its interaction with RecA, RadA gains access to both strands of the recipient duplex DNA on both sides of the D-loop. Once symmetricaly loaded RadA could translocate divergently thereby unwinding the complementary duplex DNA thus facilitating the incorporation of ssDNA during genetic transformation as well as in genomic maintenance processes.

L’ADN est constamment exposé à des insultes génotoxiques endogènes et exogènes. Plusieurs mécanismes de réparations de l’ADN sont mis en œuvre pour préserver la stabilité du génome et de l’épigénome. La recombinaison homologue (RH) joue un rôle central dans la réparation des cassures double brin de l’ADN (DSBs) et le redémarrage des fourches de réplication en réponse à un stress réplicatif. Ces deux processus sont tous deux couplés à l’assemblage de la chromatine. Le facteur d’assemblage de la chromatine 1 (CAF-1) est un chaperon d’histone conservé au cours de l’évolution qui fonctionne dans le processus d’assemblage des nucléosomes couplé à la réparation de l’ADN et à la réplication, en déposant sur l’ADN les tétramères d’histones (H3-H4)2 nouvellement synthétisés. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, le complexe CAF-1 est constitué de trois sous-unités, Pcf1, Pcf2 et Pcf3. Il a été montré que CAF-1 agit dans l’étape de synthèse de l’ADN durant le processus de réplication dépendante de la recombinaison (RDR) et protège le désassemblage des D-loop par l’hélicase Rqh1, membre de la famille des hélicases RecQ. Dans cette étude, nous avons adressé le rôle de CAF-1 pendant la réparation de l’ADN par recombinaison homologue chez la levure Schizosaccharomyces pombe. Par l’utilisation d’approches in vivo et in vitro, nous avons validé des interactions protéines-protéines au sein d’un complexe contenant Rqh1, CAF-1, PCNA, et l’Histone H3. Nous avons montré que Rqh1 interagit avec Pcf1 et avec Pcf2 indépendamment l’un de l’autre, et que l’interaction Rqh1-Pcf1 est stimulée par des dommages à l’ADN. Nous avons mis en place une méthode d’analyse de liaison à la chromatine pour suivre l’association de CAF-1 à la chromatine en réponse aux dommages à l’ADN. Nous avons observé qu’un stress réplicatif, mais pas l’induction de cassures double brin de l’ADN, favorise l’association de CAF-1 à la chromatine. Nous avons identifié plusieurs facteurs de la RH nécessaire pour l’association de CAF-1 à la chromatine en réponse à un stress réplicatif. De plus, nous avons mis en évidence des interactions physiques entre Pcf1 et des facteurs de la recombinaison homologue, parmi lesquels RPA et Rad51. Nos données suggèrent que CAF-1 pourrait s’associer aux sites de synthèse d’ADN dépendent de la recombinaison via son interaction avec des facteurs de la RH. L’ensemble des données de cette étude contribuent à renforcer le role de CAF-1 couplé à réparation de l’ADN, et révèlent une interconnexion entre les facteurs de la RH et l’assemblage de la chromatine. / DNA is constantly exposed to both endogenous and exogenous genotoxic insults. Multiple DNA repair mechanisms are exploited to guard the genome and epigenome stability. Homologous recombination (HR) plays a major role in repairing DNA double strand breaks (DSBs) and restarting stalled replication forks under replicative stress. These two processes are both coupled to chromatin assembly. Chromatin assembly factor 1 (CAF-1) is a highly conserved histone chaperone known to function in a network of nucleosome assembly coupled to DNA repair and replication, by depositing newly synthesized histone (H3-H4)2 tetramers onto the DNA. The fission yeast CAF-1 complex consists of three subunits Pcf1, Pcf2 and Pcf3. CAF-1 has been previously reported to act at the DNA synthesis step during the process of recombination-dependent replication (RDR) and protects the D-loop from disassembly by the RecQ helicase family member, Rqh1. In this study, we addressed the role of CAF-1 during homologous-recombination-mediated DNA repair in fission yeast.Using in vivo and in vitro approaches, we validated interactions within a complex containing Rqh1, CAF-1, PCNA, and Histone H3. We showed that Rqh1 interacts with both Pcf1 and Pcf2 independently of each other, and the Pcf1-Rqh1 interaction is stimulated by DNA damage. We developed an in vivo chromatin binding assay to monitor the association of CAF-1 to the chromatin upon DNA damage. We observed that replication stress but not double strand break favors CAF-1 association to the chromatin. We identified that several HR factors are required for CAF-1 association to the chromatin upon replication stress. In support of this, we have identified physical interactions between Pcf1 and HR factors, including RPA and Rad51. Our data suggest that CAF-1 would associate with the site of recombination-dependent DNA synthesis through physical interactions with HR factors. Put together, this work contributes to strengthening the role of CAF-1 coupled to DNA repair, and reveals the crosstalk between HR factors and chromatin assembly.

La recombinaison homologue est un processus conservé chez les eucaryotes. Au cours de la méiose,ce mécanisme est essentiel à la formation des crossing-overs, eux-mêmes essentiels à la bonne ségrégation des chromosomes homologues. La recombinaison méiotique est assurée par l’action combinée de facteurs mitotiques et méiotiques. La protéine MEIOB a récemment été identifiée et caractérisée comme étant essentielle à la réparation des cassures double brin de l’ADN au cours de la méiose. MEIOB est un paralogue de RPA1, la grande sous-unité du complexe RPA qui est un complexe de liaison à l’ADN simple brin ubiquitaire et composé de RPA1, RPA2 et RPA3. MEIOB peut interagir avec SPATA22 et RPA2. Cette observation suggère que MEIOB, SPATA22 et RPA pourraient agir ensemble au cours de la recombinaison méiotique. En se basant sur l’homologie de structure entre MEIOB, SPATA22 et les sous-unités de RPA, nous avons caractérisé les modalités et le rôle de leur interaction. Nous avons montré que MEIOB et SPATA22 interagissent grâce à leur domaines OB-folds C-terminaux à l’image de RPA1 et RPA2 et que MEIOB et SPATA22 coopèrent pour interagir avec le complexe RPA. Par microscopie électronique, nous avons mis en évidence que la présence de MEIOB-SPATA22 induit une forte condensation du filament RPA ADN simple brin. Nous avons également montré par immunofluorescence sur chromosomes méiotiques murins que l’hélicase BLM accumule sur les axes chromosomiques et que cette accumulation est corrélée avec l’élimination de la recombinase DMC1 des cassures méiotiques non-réparées, en absence de MEIOB. Enin, nous avons mis en évidence par microscopie à haute résolution que l’absence de MEIOB favorise une distribution anormale des protéines recombinases. Nos résultats suggèrent que MEIOB, SPATA22 et RPA collaborent pour assurer l’intégrité des intermédiaires de recombinaison méiotiques au cours de l’invasion d’un brin homologue. / Homologous recombination is a conserved process among eukaryotes. During meiosis, thismechanism is essential to the formation of crossovers and thus for the proper segregation of chromosomes. Meiotic recombination is ensured by the combined action of mitotic and meiotic factors. MEIOB has been recently identiied and shown to be essential to the repair of meiotic DNA double-strand breaks. MEIOB is aparalog of RPA1, the large subunit of RPA, which is a ubiquitous ssDNA-binding trimeric composed ofRPA1, RPA2 and RPA3. MEIOB has been shown to interact with SPATA22 and RPA2. This observation suggested that MEIOB, SPATA22 and RPA may work together. Based on the homology existing betweenstructural domains of MEIOB, SPATA22 and the RPA subunits, we deciphered the modality and the role oftheir interactions. We show that MEIOB and SPATA22 interact through their C-terminal OB domains like RPA1 and RPA2 and cooperate to interact with the RPA complex. Using Transmission Electron Microscopy,we evidenced that the presence of MEIOB/SPATA22 induces a strong compaction of the RPA/ssDNAilament. Immunofluorescent microscopy performed on murin meiotic chromosomes revealed that in theabsence of MEIOB, the BLM helicase accumulates on chromosomes axis and correlates with the eviction ofthe DMC1 recombinase from unrepaired meiotic breaks. Finally, we show that the absence of MEIOB favorsabnormal recombinase distribution observed by SIM microscopy. Together, our results evidence thatMEIOB, SPATA22 and RPA act together to insure the integrity of recombination intermediates during strandinvasion.