Dans une première partie, je présente le travail que j’ai accompli sur la coévolution moléculaire. Je présente le contexte biologique et les différentes mesures qui permettent de détecter la conservation et la coévolution à l’échelle des acides aminés. Ensuite, je montre une application de ces mesures à la détection des résidus critiques dans la protéine P53 liée au cancer. Dans ce but, j’ai créé une évaluation des différentes méthodes de prédiction. J’utilise ensuite la même méthodologie sur une base de données de mutations liées à des maladies génétiques. Je montre également comment la coévolution au niveau des résidus permet de découvrir des interactions protéine-protéine sur le virus de l’hépatite C. Enfin, je présente l’algorithme PruneTree, qui permet de filtrer des ensembles de séquences utilisés comme entrée par les programmes de détection de coévolution.Dans une deuxième partie, je m’intéresse à l’étude de l’évolution à l’échelle du génome, en particulier aux mécanismes de recombinaison méiotique. Pour cela j’ai considéré le taux de recombinaison le long du génome et sa cause, les cassures double-brin de l’ADN. Je présente alors un modèle de la distribution de ces cassures et de la liaison des différentes protéines liées à la recombinaison. Je présente également une méthode de détection de périodicité le long du génome basée sur les transformées de Fourier.Enfin, dans la dernière partie, je présente un nouvel algorithme pour simuler l’évolution des génomes de façon à évaluer les outils de reconstruction, et le paquet R-CLAG permettant d’utiliser l’algorithme de classification CLAG depuis R. / In a first part, I show the work I have done on molecular evolution. I present the general biological background and the measures that allow us to detect both conservation and coevolution at the amino-acid level. Then, I present an application of these measures to the detection of critical residues in the cancer protein P53. To this end, I have made a benchmark of different prediction methods. I then use the same methodology on a large scale database of pathogenic mutations linked to genetic diseases. After that, I show how residue-level coevolution can help us discover protein-protein interactions in the hepatitis C virus. Finally, I present the PruneTree algorithm, which allows filtering sequence sets used as input for molecular coevolution detection methods. In a second part, I have studied evolution at the genome level, in particular the recombination mechanisms that occur during meiosis. I have looked at the recombination rates along the genomes and its primary cause, the double-strand breaks, but also at the density of other proteins involved in recombination. I also present a method based on Fourier transforms to analyze these genomic signals, and a model for the distribution along the genome of double-strand breaks and recombination proteins. Finally, I present the other tools I have developed. I describe a novel algorithm that can simulate the evolution of genomes in order to benchmark the phylogenetic reconstruction algorithm PhyChro. Finally, I present the R-CLAG package that allows for easy use of the clustering algorithm CLAG.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) fait partie d’un regroupement de maladies héréditaires dont le tissu cible est la peau. Cette maladie dermatologique est causée par une mutation dans les gènes KRT5 ou KRT14, laquelle entraîne un problème au niveau de la formation des filaments intermédiaires de la kératine qui composent la peau. Un mésappariement au niveau des kératines 5 et 14 est responsable de l’apparition des symptômes de la maladie incluant la formation de cloques suite au trauma mécanique que subit la peau. Ces cloques entraînent d’importantes douleurs chez le patient, et de l’inflammation et de l’irritation. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible pour soulager les patients atteints de la maladie. Depuis quelques années, les chercheurs utilisent des technologies pour modifier directement l’ADN des patients afin de réparer la mutation responsable de l’apparition des symptômes. Des technologies d’édition du génome telles que CRISPR/Cas9 constituent donc une avenue prometteuse pour le traitement de maladies héréditaires monogéniques comme l’EBS. Cette technologie permet de cibler un endroit précis dans le génome par la combinaison d’un ARN guide simple brin et d’une protéine Cas9. La réparation de l’ADN se fait par l’induction d’une coupure double brin de l’ADN par la protéine Cas9 et sa réparation par un fragment d’ADN donneur double ou simple brin. Ce projet a pour objectif principal de corriger les mutations causant l’EBS chez deux patients possédant des mutations hétérozygotes. Plus spécifiquement, ce projet de maîtrise a pour objectif d’optimiser la méthode permettant l’utilisation de CRISPR/Cas9 dans un contexte d’EBS. La technologie CRISPR/Cas9 a été utilisée sur des cellules HEK293T, permettant de démontrer que la Cas9 est en mesure d’induire une coupure double brin de l’ADN au site ciblé dans l’ADN. Ensuite, il a été démontré que la coupure de la Cas9 jumelée à l’utilisation d’un ADN double ou simple brin permet de réparer la coupure en réalisant de la recombinaison homologue. Le séquençage a permis de confirmer ces résultats. À ce jour, les résultats dans les cellules HEK293T se sont montrés concluants et ont permis d’initier les travaux dans les fibroblastes de patients.

Cette thèse de doctorat présente 3 études reliées à l’hybridation d’ADN fixée à un support solide et les phénomènes qui y sont associés. L’hybridation d’ADN en phase aqueuse est bien caractérisée, cependant plusieurs phénomènes et paramètres restent encore à déterminer lorsqu’un des brins est fixé sur un support solide. Un de ces paramètres est l’influence du brin complémentaire en fonction de la longueur de l’extrémité d’ADN cible immobilisée exposée à la phase aqueuse. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons établi une méthode pour digérer spécifiquement le brin d’ADN complémentaire pour simplifier l’hybridation sur support solide. La combinaison d’une molécule favorisant la digestion du brin complémentaire et d’une molécule bloquant la digestion du brin cible a permis de produire un ADN cible simple brin à l’aide de l’exonucléase Lambda, permettant d’obtenir des signaux d’hybridation supérieurs à ceux obtenus avec des ADN doubles brins. Ensuite, l’observation en temps réel de l’hybridation d’amplicons simples brins et doubles brins a permis de mieux comprendre les phénomènes de compétition entre le brin complémentaire et la cible. Finalement, les conclusions des deux premières études nous ont permis d’inventer une technologie tirant profit de la compétition entre le brin complémentaire et la sonde de capture et de l’activité exonucléase pour réaliser l’amplification PCR et l’hybridation sur biopuce en un seul site réactionnel et dans un seul tampon réactionnel. La combinaison de ces techniques aura pour effet une simplification des dispositifs et une diminution du nombre de réactifs permettant la fabrication de tests diagnostiques automatisés à moindre coûts. Les travaux de cette thèse ont permis d’approfondir nos connaissances sur les phénomènes reliés à l’hybridation sur support solide et de concevoir une technologie faisant l’objet d’une demande de brevet. La suite logique de ces travaux serait de poursuivre le développement et l’optimisation de la technologie pour augmenter ses capacités de multiplexage tout en l’intégrant à un dispositif microfluidique et à un instrument de détection qui combine amplification PCR et hybridation sur biopuce dans une seule réaction réalisée en une seule étape. / This thesis presents three studies related to the phenomenon related to DNA hybridization onto capture probes attached to solid support. The work was carried out in the context of infectious diseases detection, but the conclusions are of interest to any test based on the recognition of genetic material by solid support immobilized capture probes. DNA hybridization in aqueous phase is well characterised, however several parameters and phenomena related to hybridization onto solid supports are still to be determined. One of these parameters is the influence of the complementary strand in relation with the length of the solvent-exposed immobilized target strand. To better understand this phenomenon, we established a method to specifically digest the complementary DNA strands to simplify hybridization onto solid support. The presence of a molecule favorising digestion on the complementary strand and a blocking molecule on the target strand enabled selective digestion of the complementary strand using Lambda exonuclease in PCR buffer. Hybridization of single-stranded target DNA generated this way resulted in significantly higher fluorescence signals than those obtained with double stranded hybridization. Afterwards, observation of real-time hybridization of single-stranded amplicons and double-stranded amplicons to capture probes fixed onto solid support allowed for a better understanding of the competition phenomena between the complementary strand and the capture probe. Finally, the knowledge gained with the first two studies was used to invent a technology taking advantage of the competition between the complementary strand and the capture probe and exonuclease activity to perform single vessel and single buffer PCR amplification and microarray hybridization. The combination of these techniques will simplify devices and require fewer reagents storage and handling, facilitating production of automated diagnostic tests at lower costs. The works of this thesis have expended our understanding of the phenomena associated with hybridization onto a solid support and also resulted in the creation of a new technology covered by a patent application. The logical progression of this work is to further develop and optimize this technology by integrating it into a microfluidic device and an instrument compatible with the detection of microarrays to increase the multiplexing capabilities of molecular diagnostics.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Bien que l’on attribue généralement un effet néfaste à l’instabilité génomique, pour le parasite Leishmania, elle s’avère pourtant bénéfique. De façon étonnante, ce protozoaire possède la capacité de remanier le nombre de copies de ses gènes pour s’adapter à son environnement et résister aux drogues utilisées contre lui. La présence de séquences répétées identiques près des gènes essentiels à sa survie permet une recombinaison homologue (RH) efficace et entraîne subséquemment la formation d’une copie extrachromosomique supplémentaire du gène ciblé. Ce phénomène de réarrangement génique induit la formation d’amplicons circulaires ou linéaires et est, entre autres, responsable de la résistance aux agents thérapeutiques. À l’heure actuelle, les enzymes impliquées dans ce processus sont peu connues et l’émergence d’un nombre croissant de cas d’infections réfractaires aux traitements favorise l’étude des protéines médiant la RH dans des conditions de résistance. Il a été récemment montré que la formation d’amplicons circulaires est compromise en l’absence du gène LiRad51, mais n’est toutefois pas abolie. Cette observation suggère l’implication d’autres acteurs dans ce processus, alors que le mécanisme par lequel les amplicons linéaires sont formés demeure inconnu. Cette thèse présente la caractérisation biochimique et cellulaire des protéines clés de la RH impliquées dans l’amplification génique chez le parasite Leishmania infantum. Plus précisément, le rôle de LiBrca2, en tant que médiateur de LiRad51, est tout d'abord démontré en raison de son implication essentielle dans la localisation nucléaire de LiRad51 et dans la stimulation d’invasion de brins effectuée par la recombinase. De façon similaire, les paralogues de LiRad51 peuvent, possiblement grâce à leur capacité de lier et d’apparier de l’ADN, eux aussi, stimuler LiRad51 pour l’invasion d’un ADN simple-brin dans un duplex homologue. L’inactivation génique pour l’un d’entre eux (LiRad51-4) a montré un rôle considérable sur l'amplification circulaire, malgré le fait qu’aucune activité d’invasion n’a pu être observée en l’absence de LiRad51. Enfin, en accord avec son rôle bien établi chez l’humain, cette étude confirme que la protéine LiMre11 possède une activité exonucléase et qu’elle serait impliquée dans la production d’amplicons linéaires. Ces résultats mettent en évidence le potentiel thérapeutique des protéines de la réparation de l’ADN, domaine de recherche prometteur pour mieux lutter contre la leishmaniose. / Genomic instability is usually known as a harmful hallmark, although in the parasite Leishmania this represents a beneficial feature. Surprisingly, this protozoan takes advantage of its ability to reorganize its genome for adapting itself to different environments as well as for drug resistance. In fact, the presence of identical repeats near essential genes allows homologous recombination (HR) between them, and subsequently causes the formation of an additional extrachromosomally copy of the targeted gene. This phenomenon of gene rearrangement induces circular or linear amplicons which leads to drug resistance. However, little is known about the enzymes involved in this process. In addition, the increasing number of infection cases refractory to treatment promotes the study of proteins mediating HR in these circumstances. It has been shown recently by gene inactivation that LiRad51 recombinase plays an important role in circular amplicon formation but was not essential. This observation suggested the presence of other players involved in this process while the mechanism by which linear amplicons are formed is still unknown. This thesis presents biochemical and cellular characterization of key HR proteins involved in extrachromosomal DNA amplification. We first determine the role of LiBrca2 as a mediator of LiRad51. In particular, LiBrca2 is involved in LiRad51 nuclear localisation and stimulates the homology search performed by the recombinase. Secondly, we show evidence that the LiRad51 paralogs help LiRad51 to promote HR through their capacity to bind and anneal DNA. Similary to LiBrca2, they can stimulate LiRad51 to invade a resected DNA double-strand break in an undamaged template to form a D-loop structure. However, they cannot perform this key step on their own. We succeed to inactivate one paralog (LiRad51-4) and provide insights on circular gene amplification. Finally, we show that LiMre11 harbors both DNA binding and exonuclease activities while inactivation of this gene led to a reduction of linear amplicon formation after drug selection. These results highlight a novel LiMre11-dependent pathway used by Leishmania to amplify stochastically portions of its genome. The relevance of DNA repair for drug resistance and its potential as a drug target represent a promising area of research for future treatments of leishmaniasis.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / De toutes les lésions qui menacent l'intégrité du génome, les cassures double-brin (CDBs) de l'ADN sont l'une des plus délétères, puisque toute cassure mal réparée suffit à induire des mutations et des translocations chromosomiques pouvant mener au cancer. La recombinaison homologue (RH) est un processus permettant aux cellules de réparer les CDBs de façon fidèle sans créer de mutations. Chez les eucaryotes supérieurs, ce mode de réparation repose en grande partie sur les fonctions catalytiques de la recombinase RAD51 et des évidences génétiques démontrent que ses paralogues, RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 et XRCC3, sont également des acteurs clés dans ce processus. Jusqu'à présent, les paralogues de RAD51 n'ont été que très peu caractérisés sur le plan cellulaire et moléculaire si bien que leurs fonctions précises demeurent mal définies. Dans cette étude, nous apportons des évidences implicant les paralogues de RAD51 humains dans les étapes précoces de la RH. Plus précisément, nous démontrons que le paralogue RAD51C interagit avec la recombinase RAD51 et qu'il est requis pour l'assemblage de cette dernière en foyers de réparation. De plus, nous établissons par des immunoprécipitations de chromatine que les paralogues sont recrutés à proximité d'une CDB unique en phase S-G2 du cycle cellulaire et nous montrons par immunofluorescence que RAD51C s'y accumule en foyers, une signature des enzymes de réparation. Par ailleurs, nous avons découvert que les paralogues de RAD51 jouent un rôle crucial dans la progression du cycle cellulaire. Tandis que l'inhibition par ARN interférence de RAD51B ou RAD51C provoque un arrêt prolongé en G2-M, celle de XRCC3 favorise l'entrée en mitose par le phénomène d'adaptation. La microscopie en temps réel a démontré que la perte de XRCC3 engendre un délai mitotique qui s'accompagne d'une fréquence élevée d'anomalies de centrosomes et de défauts de ségrégation chromosomique (micronoyaux et ponts anaphases). Des phénotypes mitotiques comparables sont obtenus suivant la depletion de la résolvase GEN1. Conséquemment, nous proposons qu'une fonction tardive de XRCC3 et de GEN1 dans la RH, soit au niveau de la résolution des jonctions de Holliday, puisse être à l'origine de ces aberrations mitotiques. L'ensemble de ces données permet d'éclaircir les fonctions distinctes et communes des paralogues de RAD51 lors de la RH ainsi que leur rôle dans le maintien de la stabilité du génome en mitose.

La rencontre des lymphocytes B matures avec l’antigène (Ag), au niveau des organes lymphoïdes secondaires, déclenche la maturation terminale, au cours de laquelle deux évènements peuvent avoir lieu : la commutation de classe de l’immunoglobuline (CSR pour Class Switch Recombination) et l’hypermutation somatique (SHM).Dernièrement, notre laboratoire a décrit pour la première fois la recombinaison suicide du locus IgH (LSR pour Locus Suicide Recombination) (Péron et al., 2012). Cette recombinaison engendre une délétion totale de l’ensemble des gènes constants du locus IgH, empêchant ainsi l’expression d’Ig, et donc l’absence du récepteur BCR (B Cell Receptor). La cellule B se retrouve privée des signaux de survie délivrés par ce récepteur, et est induite à l’apoptose. La LSR semble opérer par les mêmes étapes que la CSR : 1- la transcription de régions de l’ADN ciblées, 2- la génération de cassures double brin (CDB) à partir de lésions introduites par AID (Activation-induced cytidine deaminase), 3- la réparation de l’ADN lésé majoritairement par le système classique de ligation des extrémités non homologues (C-NHEJ). Cependant, la réparation au cours de la LSR n’a pas été pleinement décrite, et sa détermination constitue l’objectif principale de mon doctorat. Dans un premier temps, nous avons mis au point un programme bio-informatique « CSReport », afin d’analyser la masse de données générées par le séquençage haut débit de jonctions du locus IgH (CSR et LSR) (Boyer et al., 2017). Cet outil nous a permis d’étudier le système de réparation des CDB, à travers la détermination de la structure au point de jonction. De façon inattendue, nos résultats montrent que la réparation de l’ADN dans la LSR est similaire entre la souris et l’Homme et si la CSR fait intervenir le C-NHEJ, la LSR semble faire appel à l’A-EJ (Alternative End Joining) et/ou la HR (Homologous Recombination). Ces observations sont renforcées par les résultats mettant en évidence une différence de l’association de protéines de réparation, ainsi que des marques épigénétiques particulières entre les segments concernés par la CSR et ceux ciblés par la LSR chez la souris.Nous nous sommes ensuite interrogés sur la LSR dans le lymphome de Hodgkin (HL pour Hodgkin lymphoma), car l’absence de BCR à la surface des cellules de Reed Sternberg pourrait provenir de cet évènement. Les résultats de séquençage haut débit révèlent une réparation différente au cours de la LSR entre le HL et le contrôle (amygdales saines) ce qui nous laisser stipuler que des altérations intrinsèques aux systèmes de réparation de l’ADN dans les cellules tumorales sont en cause.Globalement, nous avons développé « CSReport », un outil qui nous permet d’analyser la structure de réparation de l’ADN en partie, et de montrer une réparation similaire des CDB entre la souris et l’Homme et une différence de réparation de l’ADN entre la recombinaison CSR et LSR. De plus, nous avons mis en évidence une altération de la réparation dans des échantillons de lymphomes B (HL et CLL) comparé à des contrôles (amygdales saines). / Mature B lymphocytes meeting with antigen (Ag) inside secondary lymphoid organs activates their terminal maturation, with occurrence of class switch recombination (CSR) and somatic hyper mutation (SHM).Recently, our laboratory described for the first time IgH locus suicide recombination (LSR) (Péron et al., 2012). This process removes the whole constant genes of the locus, preventing Ig and BCR (B Cell Receptor) expression. The B cell is devoid of survival signals delivered by its receptor and is induced to apoptosis.LSR seems to operate with same molecular steps as CSR : 1- transcription of targeted DNA regions, 2- generation of double strand breaks (DSB) from DNA lesions induced by AID (Activation-induced cytidine deaminase), 3- DNA repair by classical non homologous end joining (C-NHEJ) pathway. However, DNA repair during LSR was not fully understood, and this is the principal objectif of my PhD studies. First, we developped a bioinformatic program « CSReport », to analyse high throughput sequencing (HTS) datas of IgH locus junctions (CSR and LSR) (Boyer, Boutouil et al.,2017). This tool allowed us to study the DSB repair systems, through determination of the structure at the junction site. Unexpectedly, our results show that DNA repair in DNA during LSR is similar between mice and human, and if CSR implicates C-NHEJ, LSR seems to invlove Alternative end joining (A-EJ) and /or homologous recombination (HR). These observations are consolidated by results showing a difference in the association of repair proteins, and in particular epigenitic marks between DNA segments concerned by CSR and those targeted by LSR in mice. We asked ourselves about LSR in HL, because BCR absence on its Reed Sternberg cells surface may be a result of this recombination. HTS results reveal a different repair during LSR between HL and the control (healthy tonsils), which let us stipulate that alterations in DNA repair systems of tumoral cells are the cause.Globaly, we developped « CSReport », a tool which permits us to study DNA repair structure in a part, and to show a similar DSB repair systems between mice and human, and a difference between CSR and LSR repair. Furthermore, we show an alteration in DNA repair of B lymphoma samples (HL and CLL) compared with the control (healthy tonsils).

La recombinaison génétique est un processus biologique fondamental, ayant lieu au cours de la méiose et assurant la bonne ségrégation des chromosomes, ainsi que le maintien de la variabilité génétique grâce au brassage intrachromosomique. La recombinaison a été étudiée dans de nombreuses espèces, en particulier chez les Mammifères et les animaux d’élevage, comme les bovins, les porcs ou les ovins. Dans tous les cas, une variation du taux de recombinaison a été observée entre les individus et il a été démontré qu’elle était héritable et sous déterminisme génétique. Dans certaines espèces, des cartes génétiques ont également été construites, ce qui a permis de localiser les crossingovers et de détecter de très petites zones du génome où la recombinaison était importante : les points chauds. En race ovine Lacaune, de nombreuses données de génotypages sont disponibles, notamment grâce à l’existence de deux puces : une de moyenne densité avec 54 000 marqueurs et une de haute densité avec 600 000 marqueurs. Deux jeux de données étaient donc disponibles ; un jeu de données familial avec près de 6 000 individus apparentés et génotypés pour les 54 000 marqueurs et un jeu de données comportant 70 Lacaune non apparentés et génotypés pour les 600 000 marqueurs. Des cartes génétiques ont donc été créées pour ces deux jeux de données. Avec les animaux non apparentés, environ 50 000 points chauds ont été détectés. Le jeu de données familial a permis d’observer des motifs de distribution de la recombinaison communs aux autres Mammifères. Enfin, la combinaison des deux jeux de données a révélé la présence de signatures de sélection et a permis de créer une carte génétique de haute densité. De plus, une variation du taux de recombinaison a été observée entre les individus et a pu être liée à l’existence de 2 QTLs majeurs sur les chromosomes 6 et 7. Des gènes candidats plus ou moins bien connus ont pu être proposés, voire étudiés : RNF212 et HEI10. De plus, une comparaison avec une autre population ovine a permis de montrer que les cartes de recombinaison étaient quasiment identiques, mais que le taux de recombinaison individuel était soumis à un déterminisme génétique différent. Il a également été possible de proposer une application concrète pour l’utilisation des cartes génétiques en sélection génomique, grâce à la création de puces basse densité pouvant être utilisées pour l’imputation des reproducteurs et donc favoriser le génotypage et la sélection génomique à moindre coût. / Genetic recombination is a fundamental biological process, which occurs during the meiosis. It allows the good segregation of the chromosomes and contributes to maintain the genetic diversity. Recombination was already studied in a lot of different species, especially in mammals and in farm animals, such as the pig, the cattle or the sheep. In each case, a variation of the recombination rate between the individuals was observed. This variation was heritable and under genetic determinism. In some species, genetic recombination maps were also created, which allowed to localize the crossovers and to detect really tiny genomic regions where the recombination is huge: the recombination hotspots. In the Lacaune breed sheep, a lot of genotyping data are available thanks to two existing arrays: a first with a medium density of markers (about 54,000 markers) and a second with a high density of markers (about 600,000 markers). Two datasets were thus available: a familial dataset with about 6,000 animals genotyped for the 54,000 markers and a dataset of 70 unrelated Lacaune genotyped for the 600,000 markers. Genetic recombination maps were created for these two datasets. With the 70 unrelated Lacaune, about 50,000 hotspots were detected. The familial dataset allowed to observe the mammals common recombination patterns. Finally, when the two datasets were combined, selection signatures were revealed and a high density recombination map were created. Furthermore, a variation of the recombination rate within the individuals was observed and was associated to 2 main QTLs on the chromosomes 6 and 7. Already known, or not, candidate genes were proposed and sometimes studied: especially RNF212 and HEI10. Finally, a comparison with another sheep breed revealed that the genetic recombination maps were really similar, but the individual recombination rate was under a different genetic determinism. A concrete application of the genetic recombination map in genomic selection was also proposed thanks to the creation of lowdensity SNPs sets, which could be used to impute the animals and thus to improve the genotyping and the genomic selection for lessercosts.