Thèse en cotutelle, Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire, Université Laval, Québec, Canada et Université de Nantes, Nantes, France / Les cellules humaines sont soumises à des stress induisant des cassures double-brin de l’ADN (CDB). Ces CDB sont réparées notamment par la recombinaison homologue, impliquant les protéines RAD51 et RAD52. Une stratégie thérapeutique émergente est de développer des molécules inhibant RAD51 ou RAD52 afin d’accentuer l’instabilité génétique et la mort de la cellule cancéreuse. En effet, dans certains cancers, l’activité de RAD51 est dérégulée promouvant la prolifération tumorale. Il existe plusieurs molécules inhibitrices de RAD51 et nous nous sommes intéressés au DIDS dont le mode d’action n’a pas encore été déterminé. Concernant RAD52, une létalité synthétique a été montrée lorsque celle-ci est inactivée dans des cellules déficientes en BRCA1, BRCA2 ou PALB2, trois gènes mutés dans de nombreux cancers. Récemment, trois types de molécules inhibitrices de RAD52 ont été mis en évidence. Nous avons tout d’abord étudié l’impact du DIDS ainsi que des molécules dérivées afin de comprendre le mécanisme mis en jeu. Nous avons montré que le DIDS, ainsi que ses dérivés inhibent la liaison de RAD51 à l’ADN. Ces molécules empêchent la formation du nucléofilament entrainant une diminution du nombre de foyers RAD51. Nous avons développé une méthode de criblage par fluorescence pour évaluer l’effet d’une banque de 696 molécules sur la capacité de RAD52 à hybrider deux ADNsb. Deux molécules capables d’inhiber la fonction d’hybridation de RAD52 ont été mises au jour. In vivo, elles entrainent une diminution de la survie de cellules déficientes en PALB2. La recherche et le développement de nouveaux inhibiteurs de RAD51 et RAD52 constituent des stratégies thérapeutiques d’avenir. / Human cells are subjected to stress inducing DNA double-strand breaks (DSB). DSB are repaired in particular by homologous recombination, involving RAD51 and RAD52 proteins. An emerging therapeutic strategy is to develop RAD51 or RAD52 inhibitors that promote genetic instability and induce cancer cell death. In some cancers, the activity of RAD51 is deregulated promoting tumor proliferation. There are several RAD51 inhibitors and we focused on DIDS, whose mechanism of action has not been yet determined. Concerning RAD52, a synthetic lethality has been shown when its gene is inactivated in BRCA1, BRCA2 or PALB2 deficient cells, those genes being mutated in various cancers. Recently, three types of molecules inhibiting RAD52 were highlighted. We studied the impact of DIDS and its derivatives to understand the mechanism involved in the inhibition. We showed that DIDS and its derivatives inhibit RAD51 DNA binding function. These molecules prevent the formation of nucleofilament leading to a decrease in RAD51 foci formation. We have developed a fluorescent method of screening to evaluate the effect of a library of 696 molecules on the RAD52 ability to hybridize two ssDNA. Two molecules were able to inhibit the RAD52 hybridization function. In vivo, they induce a decrease in PALB2 deficient cell survival. Research and development of new RAD51 and RAD52 inhibitors represent promising therapeutic strategies.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / Les cassures double-brin de l'acide désoxyribonucléique (ADN) sont parmi les lésions les plus cytotoxiques car une seule lésion non réparée est létale chez la levure. Dans le but de réparer efficacement ces dommages, la cellule dispose de différents mécanismes tels que le Non Homologous End Joining (NHEJ). Toutefois ces mécanismes peuvent causer des mutations et, lorsqu' il est possible, la cellule privilégie un système qui permet une réparation très fiable: la recombinaison homologue. Ce processus peut aussi être utilisé lors de la méiose pour créer de la diversité génétique. La méiose est un mécanisme complexe et une mauvaise régulation peut mener à des problèmes tels que l' aneuploïdie. La recombinaison homologue méiotique se divise en quatre étapes majeures: (i) l' initiation qui crée des cassures double-brin par un complexe muItiprotéique incluant Rec12; (ii) la résection de l'ADN ou les protéines majeures sont Rad32/Rad50/Nbsl; (iii) l'invasion d'un duplex homologue avec les protéines RadSl et Dmcl, et pour terminer (iv) la résolution des jonctions de Holliday. Lors de mes études de doctorat, je me suis concentré sur la caractérisation biochimique des principales protéines des trois premières étapes (initiation, résection et particulièrement l'invasion) de la recombinaison méiotique chez Schizosaccharomyces pombe permettant la réparation des cassures double-brin. Mes travaux avaient pour but de caractériser les protéines Dmcl et le complexe Hop2/Mndl chez S.pombe. Nous avons déterminé que Dmcl avait comme Rad 51 la capacité de former un filament hélical sur l'ADN simple brin, ansi que de catalyser des réactions d'échange de brin. D'autre part j'ai mis en évidence le rôle que joue le complexe Hop2/Mndl dans la stimulation de Dmc 1, ainsi que les différences entre les protéines de S.pombe et de la SOurIS.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Une personne sur trois au Canada sera affectée par une forme de cancer durant son existence. Aujourd’hui, il a été clairement démontré que les mutations dans l'information génétique sont l'événement initiateur du cancer. Les cassures double-brin de l'ADN font partie des lésions les plus dangereuses retrouvées dans les cellules puisqu'elles peuvent induire des mutations menant au cancer. La cellule possède plusieurs mécanismes pour réparer les cassures double-brin de l’ADN. La réparation par recombinaison homologue est le seul de ces mécanismes permettant aux cellules de réparer les cassures double-brin de l’ADN de manière fidèle sans créer d’autres mutations. Ce mécanisme dépend en majeure partie de la protéine RAD51 qui en catalyse les étapes essentielles. RAD51 a besoin d’autres cofacteurs appelés médiateurs, comme la protéine BRCA2, pour son fonctionnement. Récemment, PALB2 a été identifiée comme un régulateur clé de RAD51 et BRCA2, et donc de la réparation par recombinaison homologue. Les individus, avec des mutations de PALB2, possèdent une prédisposition au cancer du sein et à l’anémie de Fanconi. Le projet de mon doctorat consiste en la caractérisation biochimique de la protéine PALB2 afin de comprendre son rôle dans le contrôle et le fonctionnement de la réparation par recombinaison homologue. Nous avons montré que la protéine PALB2, comme BRCA2, est un médiateur de la recombinaison homologue. Dans les cellules, l’activité de PALB2 est contrôlée par sa dimérisation. En présence de dommages à l’ADN, la monomérisation de PALB2 provoque son activation et la stimulation de la formation du filament de RAD51. Finalement, nous avons découvert un nouveau partenaire des médiateurs PALB2 et BRCA2 : la polymérase r

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / L'anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare se manifestant par des troubles développementaux, sanguins, et une prédisposition à certains cancers. Les cellules de patients montrent une sensibilité élevée aux agents causant des ponts interbrins dans l'ADN, dont la réparation implique l'activation de la recombinaison homologue. La présence de PALB2, mutée dans l'anémie de Fanconi, est nécessaire pour la localisation chromatinienne de BRCA2 et RAD51, en réponse aux dommages à l'ADN. Comme BRCA2, PALB2 est un gène de prédisposition au cancer du sein. Il devient important de mieux comprendre le rôle de PALB2/FANCN dans la recombinaison homologue. Nous avons entrepris la caractérisation de l'activité biochimique de PALB2 en la purifiant, de même qu'un mutant associé au cancer du sein, PALB2Q775X, afin de clarifier son rôle dans la réparation de l'ADN. Les données obtenues suggèrent que PALB2 possède les caractéristiques d'un médiateur de la recombinaison homologue, ce qui en fait une cible privilégiée dans le développement de thérapies anticancéreuses dans le futur.

Au Canada, en 2015, il était estimé que 78 000 personnes allaient mourir d’un cancer, représentant 30 % de tous les décès et faisant de celui-ci la première cause de mortalité. De plus, 196 900 nouveaux cas de cancers seraient découverts au cours de cette même année (Canadian Cancer Society’s Advisory Committee on Cancer Statistics. Canadian Cancer Statistics 2015. Toronto, ON : Canadian Cancer Society; 2015). L’intégrité du génome est chaque jour menacée par des conditions environnementales qui endommagent l’ADN (ultraviolets, produits chimiques divers, etc.). Parmi les différents types de lésions, l’un des plus délétères et pouvant mener au cancer est la cassure double-brin (CDB). Celle-ci peut être réparée suivant deux mécanismes majeurs : la jonction des extrémités non homologues (Non-Homologous End-Joining ou NHEJ) ou la Recombinaison Homologue (RH). Cette dernière, prépondérante pendant les phases S/G2, consiste en la réparation d’une CDB grâce à l’utilisation d’une chromatide soeur comme modèle, permettant une réparation fidèle du dommage. La RH est sous la dépendance de diverses protéines, dont RAD51, PALB2 et BRCA2. Ces deux dernières sont connues pour être mutées dans les cancers du sein et des ovaires. Ainsi, la compréhension de l’implication de chaque acteur dans la RH est un objectif fondamental dans la lutte contre le cancer et constitue l’objectif général de cette thèse. En 2012, une étude a montré qu’une nouvelle protéine, APRIN (Androgen-induced PRoliferation INhibitor), appartenant au complexe cohésine, interagissait avec BRCA2 et jouait un rôle dans la RH. Les rôles précis d’APRIN dans ce mécanisme restaient toutefois à être définis. Le projet principal de cette thèse repose sur la caractérisation fonctionnelle d’APRIN dans la réparation par RH. Nous révélons qu’APRIN aurait un rôle spécifique et indépendant de celui de la cohésine dans la RH, et pourrait agir à diverses étapes cruciales de ce mécanisme. De plus, nos données montrent que le niveau d’expression d’APRIN pourrait être un marqueur de prédiction dans le cancer ovarien. Étant donné qu’APRIN interagit aussi avec PALB2, autre partenaire essentiel de BRCA2, nous avons également étudié et caractérisé les fonctions de divers mutants de PALB2. Nous faisons ainsi la découverte inattendue d’un nouveau phénotype induit par une troncation de cette protéine associée à certains cancers agressifs. Ainsi, cette thèse apporte des informations supplémentaires et indispensables à la compréhension de la réparation de l’ADN par RH et de la survenue de certains cancers. / Cancer is the leading cause of death in Canada (30% of all deaths). By 2015, it was estimated that 78,000 Canadians would die of cancer. Moreover, 196,900 new cases of cancer were discovered in that same year (Canadian Cancer Society’s Advisory Committee on Cancer Statistics. Canadian Cancer Statistics 2015. Toronto, ON: Canadian Cancer Society; 2015). Each day, genome integrity is threatened by environmental conditions that can induce DNA damages (UV, chemicals, etc.). Amongst different types of lesions, double-strand breaks (DSB) are one of the most deleterious and can lead to cancer development. DSB can be repaired following two different and major pathways: Non-Homologous End-Joining (NHEJ) and Homologous Recombination (HR). HR mainly takes place during S/G2 phases and uses the intact sister chromatid as a template for repair. This renders HR to be a faithful mechanism, which depends on three important proteins: RAD51, PALB2 and BRCA2. The last two proteins are frequently found mutated in both breast and ovarian cancers. Understanding how each HR actor is specifically implicated in this pathway is important to develop strategies to fight cancer and constitutes the general aim of this thesis. In 2012, APRIN (Androgen-induced PRoliferation INhibitor), known as a regulator of the cohesin complex, was described as a new interacting partner of BRCA2 and an actor of HR. Nevertheless, how APRIN was specifically implicated in HR remained unclear. Hence, the major objective of this thesis was to functionally characterize APRIN in HR. We show that APRIN possesses a specific and independent role from the cohesin complex in HR and could be implicated in different steps during this repair pathway. Interestingly, APRIN expression levels in ovarian cancer tumours may be used as a prognostic marker. Moreover, to achieve the general objective of this thesis, we focused on another BRCA2 partner : PALB2. We studied the impact of different truncating mutations found in cancers on PALB2 functions. Surprisingly, we discovered that the consequence of an aggressive cancer-causing mutation could stem from an aberrant localization of PALB2. Consequently, this thesis provides important new information on the repair of DSB by HR and on the occurrence of cancers.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Chez Saccharomyces cerevisiae, la methylation de la lysine 4 de l'histone H3 (H3K4) est catalysée par le complexe à activité methyltransférase Set1, conservé au cours de l'évolution. Durant la méiose, l'absence de Set1 conduit à un retard de démarrage de la phase S, et à un défaut dans la formation des coupures double-brin de l'ADN (CDBs). Nous avons cherché à mieux caractériser ces deux conséquences phénotypiques liées à l'absence de Set1. Nous montrons que le retard de réplication est lié à la perte de méthylation de H3K4 mais qu'il ne résulte pas d'un défaut d'activité des kinases responsables de l'activation des origines de réplication ou de l'activation des voies canoniques de surveillance moléculaire liées aux dommages de l'ADN. L'importante diminution de fréquence de CDB sur la majorité des points chauds chez le mutant set1∆ a été corrélée à l'absence de la marque de H3K4 triméthylée. Nous avons confirmé le role de la méthylation de H3K4 sur la base de la diminution générale de la fréquence des CDBs observée en absence des différentes sous-unités du complexe associé à Set1 (COMPASS) ou chez un mutant exprimant une histone H3 non-méthylable (H3K4R). Pour tester la relation de causalité entre méthylation et CDBs, différentes sous-unités du COMPASS, telles que Set1 et Spp1, ont été fusionnées avec le domaine de fixation à l'ADN de Gal4 pour les cibler vers des régions non méthylées et dépourvues de CDB. Gal4BD-Spp1 stimule fortement la fréquence des CDBs à certains loci, y compris en contexte mutant H3K4R. Ainsi, le ciblage de Spp1 peut etre suffisant pour recruter et/ou activer la machinerie de CDB. / In Saccharomyces cerevisiae, the methylation of the lysine 4 of histone H3 (H3K4) is catalysed by the evolutionary conserved Set1 methyltransferase complex. During meiosis, the absence of Set1 leads to a delay of S-phase onset and to a defect in the formation of double-strand breaks (DSBs). Our work was intended to give some clues about these two phenotypic consequences of Set1 loss. We show that the replication delay is linked to the absence of H3K4 trimethylation but does not result from a defect of the kinases responsible for the activation of replication origins or the activation of the canonical DNA-damage checkpoints. The severe decrease of DSB levels at the majority of recombination hotspots in set1∆ has been correlated with the specific marking of DSB sites by H3K4 trimethylation at some loci. We have confirmed the role of H3K4 methylation by observing a general decrease in DSB frequency similar to that of set1∆ in mutants lacking various subunits of the Set1- associated complex (COMPASS) or expressing a nonmethylatable histone H3 (H3K4R). To test for a causal relationship between H3K4 methylation and DSB formation, we have fused different proteins of the COMPASS, such as Spp1 or Set1, with the DNA binding domain of Gal4, in order to target them to H3K4-unmethylated and DSB-cold regions. Remarkably, Gal4BD-Spp1 strongly stimulates DSB formation in naturally cold DSB regions, even in the H3K4R mutant context. Thus, the specific tethering of Spp1 to a chromosome site is sufficient to recruit and/or activate the DSB machinery.

Les extrémités des chromosomes portent des structures nommées télomères, nécessaires à la survie des cellules. La sénescence réplicative induite par l’altération des télomères bloque les proliférations cellulaires excessives. Cependant, certaines cellules échappent à ce contrôle et deviennent immortelles. Je me suis intéressée aux mécanismes permettant de reconstituer des télomères fonctionnels par recombinaison chez la levure. Le noyau est divisé en sous-compartiments plus ou moins permissifs pour la recombinaison. J’ai étudié comment la localisation des télomères dysfonctionnels aux pores nucléaires (NPC) conditionne leur réparation et la prolifération des cellules. J’ai montré que les lésions réplicatives au télomères sont relocalisées aux NPC ce qui favorise leur réparation par un mécanisme conservatif. J’ai aussi montré la présence aux NPC de cercles d’ADN télomérique qui pourraient servir de matrice pour allonger les télomères et sortir de la sénescence réplicative. / Chromosome ends are formed by structures called telomeres, which are necessary for genome integrity and cell survival. Upon aberrant proliferation, as in precancerous cells, telomere alterations blocks cell proliferation, a mechanism called replicative senescence. However, some cells escape this control and become immortals. Using budding yeast as model, my work aimed to understand the mechanisms that allow cells to reconstitute functional telomeres using homologous recombination. The nucleus is divided in sub-compartments that are differently permissive for recombination. I investigated how the localization of dysfunctional telomeres to the nuclear pore complex (NPC) determines their repair and favors cell proliferation. I showed that replicative lesions at telomeres relocate to the NPC allowing conservative repair by recombination. I further shed light on the presence at NPC of telomeric DNA circles that may serve as template for telomere elongation and thus escape from senescence.