Made available in DSpace on 2014-10-09T12:49:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09992.pdf: 4690836 bytes, checksum: 0c8fe8bfd81500f9e75841feace3eaa7 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:49:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09999.pdf: 3180052 bytes, checksum: d81b6ae3a2be068f0f996c5912f80e5b (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:03:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06046.pdf: 3970338 bytes, checksum: 788afd1d8690f2f3f60fc44aeaac9f41 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:44:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:07:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06917.pdf: 5485746 bytes, checksum: ddc4368b0a8bc0f9c5bc15933aa944ec (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2015-11-12T10:39:15Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2015-11-12T10:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O sistema de expressão baseado nos promotores PL ou PR do fago lambda que usualmente é regulado pelo repressor termo lábil (cIts) é amplamente utilizado para produzir proteínas recombinantes em células procarióticas. No entanto, o aumento da temperatura requerido neste sistema para promover a inativação do repressor apresenta algumas limitações, como o aumento da expressão de proteínas de HSP (Heat Shock Proteins), por exemplo, proteases, que dependendo da natureza da proteína expressa podem ser prejudiciais ou não. Uma outra limitação é a ativação da resposta SOS, resultando na parada da replicação do DNA celular ou dependendo da cepa pode ocorrer lise celular. Nesse trabalho nós descrevemos o uso do promotor λPL para expressão constitutiva, isto é, sem a regulação do repressor. Nós otimizamos diferentes condições de cultura para aumentar a secreção no espaço periplásmico de Escherichia coli de cinco proteínas: o hormônio do crescimento humano (hGH), que tem sido amplamente utilizado no tratamento de crianças com deficiência e/ou resistência ao hGH, síndrome de Turner, entre outras desordens; prolactina humana (hPRL), um hormônio polipeptídico conhecido por estimular a lactação e por exercer ação regulatória no crescimento e na diferenciação da glândula mamária, dois antagonistas de hPRL, estudados como potenciais fármacos para o tratamento de alguns tipos de cânceres e por fim o interferon α2a (IFN-α2a), que é uma citocina produzida pelas células, em resposta a diferentes estímulos, incluindo ácidos nucléicos virais, células estranhas (particularmente as neoplásicas), antígenos de bactérias, protozoários e vírus. No caso do IFN-α2a, essa citocina de alto valor agregado e de importante aplicação terapêutica, foi desenvolvida em nosso laboratório como parte desse trabalho, incluindo o desenvolvimento e a validação da metodologia de análise por HPLC de fase reversa para determinação do IFN presente no fluído periplásmico bacteriano ou na sua forma pura. As principais estratégias utilizadas para melhorar a expressão foram iniciar a indução junto à densidade óptica máxima do crescimento bacteriano e otimizar a temperatura de indução para controlar a expressão da proteína heteróloga. Essa metodologia pode ser utilizada nos casos onde o produto não será tóxico para a célula hospedeira ou quando a instabilidade do plasmídeo não é problema. A possibilidade de cultivo em temperaturas mais baixas, já que o repressor termo-sensível não se encontra presente, colaborou para o aumento significativo da expressão, mesmo para proteínas menos sensíveis à temperatura de cultivo, como o hGH. / Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

A neurocisticercose (NC) é uma doença provocada por larvas de Taenia solium (Tso) no sistema nervoso central. Seu diagnóstico fundamenta-se em critérios clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. A utilização de antígenos parasitários no imunodiagnóstico apresenta desvantagens como: necessidade de animais, ausência de homogeneidade entre lotes, baixo rendimento, e contaminação com proteínas suínas. Assim, os antígenos recombinantes podem otimizar o imunodiagnóstico da NC, pois são reagentes simples e reprodutíveis, sem requerer animais. Este estudo teve como objetivo a obtenção, caracterização e análise da reatividade de proteína recombinante baseada em antígenos de líquido vesicular de Taenia crassiceps (Tcra). Assim, o cDNA foi obtido por amplificação a partir de RNAm de cisticercos de Tcra. A proteína recombinante Tc14 foi produzida em Escherichia coli (DE3) BL21 utilizando-se o vetor de expressão pET-22b e purificada por cromatografia de afinidade. A caracterização antigênica deu-se por Imunoblot (IB) utilizando anticorpos monoclonais (AcMo). Houve reatividade com todos os AcMo utilizados (AcMo anti-antígeno de excreção/secreção de Tcra, AcMo anti-líquido vesicular de Tcra, AcMo antilíquido vesicular de Tso e AcMo anti-antígeno total de Tso), exceto com o AcMo anti-antígeno de escólex de Tso. Utilizando-se 22 amostras de soro e 19 de líquor (LCR) de pacientes com NC, 48 soros e 28 LCR do grupo controle negativo (GCN) e 17 soros de hidatidose do grupo outras parasitoses (OP) em Imunoblot foi observada reatividade na região de 14kDa, correspondente a Tc14, em todas as amostras NC, mas não nos GCN e OP. Em ELISA com Tc14 obteve-se sensibilidade (S) e especificidade (E) de 100% com LCR (29 amostras de NC e 35 do GCN) e S de 95,1% e E de 100% com soro (41 amostras de NC, 52 do GCN). Dentre 51 soros de OP, mostraram-se reagentes um de hidatidose e outro de estrongiloidíase. A análise comparativa entre diferentes antígenos e testes sorológicos apresentou índice de positividade de 100% em IB utilizando os antígenos Tc14 ou LLG (antígeno purificado de Tso com lentil-lectina); já em ELISA, os índices foram de 83,4% para Tc14 e 91,6% para 18/14 (antígeno purificado de líquido vesicular de Tcra com AcMo). Em ensaios de linfoproliferação a porcentagem de respondedores no grupo NC foi de 16,6% (com 0,05 e 0,6 µg de Tc14/poço), 50% (com 0,4 µg de Tc14/poço), 44,4% (com 1,0 µg de Tc14/poço) e 20% (com 2,0 µg de Tc14/poço). Não houve proliferação no GCN. A dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura apresentou reatividade diferenciada entre o GCN e NC para IL-10, sendo uma amostra do GCN reagente e duas amostras de NC não reagentes. Não foi possível detectar IFN-γ. Em ELISA para IgG total 91,7% dos plasmas do grupo NC apresentaram reatividade, sendo a positividade para os isótipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 respectivamente, de 75; 33,3; 50 e 25%. O antígeno recombinante mostrou-se como ferramenta promissora para imunoensaios na NC, abrindo nova perspectiva envolvendo estudos a serem realizados sobre diferentes sistemas de expressão e antigenicidade frente a um número maior de amostras. / The neurocisticercosis (NC) disease is caused by the presence of Taenia solium (Tso) larvae in the central nervous system. Its diagnosis is based on clinical criteria, epidemiological studies and laboratorial exams. Nevertheless, the use of parasite antigenic extracts into the immunodiagnosis presents some disadvantages: it requires animals, lacks of homogeneity between lots, low yield and may become contaminated with swine proteins. Consequently, the utilization of recombinant antigens could optimize the immunodiagnostic of NC, as they are simple and reproducible reagents that do not require animals. This study aimed the capture, characterization and reactivity analysis of the recombinant protein based on antigens of the vesicular fluid of Taenia crassiceps (Tcra). In order to do so, the cDNA was obtained through the amplification deriving from RNAm of cysticerci of Tcra. The recombinant protein Tc14 was produced in Escherichia coli (DE3) BL21 using the expression vector pET-22b and purified by affinity chromatography (nickel resin). The antigenic characterization was performed by immunoblotting (IB) using monoclonal antibodies (MoAb). The recombinant protein presented reactivity with all the MoAb used (Anti-secretion/excretion antigens from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tso MoAb and anti- total antigen from Tso MoAb), except with the anti-antigen from Tso scolex MoAb. The immunoblot was performed using 22 serum samples and 19 cerebrospinal fluid (CSF) from patients with NC, 48 serum and 28 CSF from the negative control group (GCN) and 17 hydatidosis serum from other parasitosis\' group (OP). It showed reactivity in the 14kDa region, correlated to Tc14, in all NC samples, but not presented on GCN and OP. In ELISA with Tc14, the sensibility (S) and specificity (E) of 100% was obtained with CSF (29 NC samples and 35 GCN samples) and 95.1% of S and 100% of E with serum (41 NC samples, 52 GCN samples). Among 51 OP serums, one from hydatidosis and one from strongyloidiasis demonstrated reactivity. The comparative analysis amongst different antigens and serological tests demonstrated positivity of 100% in IB when using the Tc14 antigens or LLG (purified antigen of Tso with lentil lectin). In ELISA, the positivity indicated was of 83.4% for Tc14 and 91.6% for 18/14 (vesicular fluid purified antigen with MoAb from Tcra). In lymphoproliferation tests, the percentage of responders in NC group was of 16.6% (with .0.5 and 6 µg of Tc14/well), 50% (with 0.4 µg of Tc14/well). No proliferation occurred in GCN. The dosage of cytokines in culture supernatants presented different reactivity amongst GCN and NC for IL-10, as one sample of GCN reacted and two NC samples did not. It was not possible to detect IFN-γ. In ELISA for total lgG, 91.7 % of plasmas from NC group presented reactivity, with positivity for the isotypes lgG1, lgG2, lgG3 and lgG4, 75 %, 33.3 %, 50 % and 25 %, respectively. The recombinant antigen prevails as a promising tool for immunoassays in NC, opening a new perspective involving studies to be performed concerning different expression and antigenicity ahead of a larger number of samples.

A hemofilia A é uma doença caracterizada pela deficiência do fator VIII (FVIII) de coagulação sanguínea e atinge 1 em 5000 homens. Países desenvolvidos, utilizam como terapia o FVIII recombinante (rFVIII), por apresentar maior segurança e consistir uma fonte ilimitada. Estudos realizados em nosso laboratório, utilizando o vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K, originaram as linhagens celulares humanas, HepG2FVIIIdB/P140K (hepática) e Hek293FVIIIdB/P140K (renal), que foram selecionadas pelo mesmo sistema de seleção, o tratamento in vitro com as drogas Benzilguanina e Temozolomide. O presente trabalho teve por objetivo caracterizar e detalhar o padrão de integração do vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K nas duas linhagens celulares humanas, e verificar se o perfil de integração está relacionado ao tipo celular específico ou se este sofre influência da estratégia de seleção a qual as células foram submetidas anteriormente. Foi utilizada a técnica de LM-PCR (ligação-mediada por PCR) que permite localizar o sítio de integração do vetor viral, por meio do sequênciamento do produto de PCR obtido após a digestão com enzimas de restrição e ligação de uma sequência adaptadora (LINKER) ao DNA genômico. Após o seqüenciamento as sequências foram submetidas a análises em bancos de dados de genomas (Human BLAT, QuickMap e DAVID/EASE) para caracterização dos respectivos clones. Também foi realizada uma análise da expressão relativa do mRNA relativo ao rFVIII por RT-PCR e da atividade biológica pelo teste de TTPA. Dessa forma foi possível observar que ambas as linhagens modificadas expressam o mRNA relativo ao rFVIII e que as células HepG2 e Hek293 apresentam níveis de secreção da proteína recombinante biologicamente ativa da ordem de 7,9 UI/mL e 2,1 UI/mL, respectivamente. Foram sequenciados um total de 201 clones da HepG2, sendo 123 similares ao genoma humano e dentre estes 73 considerados verdadeiros e 50 ambíguos. Da Hek293 foram sequenciados 221 clones, sendo 179 similares ao genoma humano e dentre estes 64 verdadeiros e 115 ambíguos. Observamos que o vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K apresenta um perfil de integração não randômico e diferente entre as células estudadas, uma vez que na linhagem HepG2 houve uma preferência pelos cromossomos 19, 17 e 11, e na Hek293 pelo cromossomo 9. Em relação a regiões genômicas tais como distância de ilhas CpGs e de sítios de ligação de fatores de transcrição não houve diferença no perfil de integração em ambas as linhagens celulares, visto que nas duas células o vetor se inseriu preferencialmente a uma distância de ± 30-60Kb dessas regiões. Observamos também que houve uma integração dentro de genes codificadores de proteínas da ordem de 52% e 44% nas células HepG2 e Hek293, respectivamente, contudo em ambos os casos mais de 90% dessas inserções ocorreram em regiões intrônicas. Houve 20% de integrações em sítios frágeis do genoma na linhagem HepG2 e 17% na Hek293. Em suma este trabalho mostrou a integração do vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K específica para as duas linhagens em estudo. Além disso, pudemos observar que em ambas as linhagens celulares, HepG2FVIIIdB/P140K e Hek293FVIIIdB/P140K, existem regiões gênicas dentro dos cromossomos na qual o vetor exibe uma preferência. O perfil de integração caracterizado aqui difere de outros trabalhos da literatura que utilizaram retrovírus derivados de MLV. Isso nos leva a crer que o padrão de inserção descrito pode estar relacionado ao fato de que essas células foram tratadas anteriormente com drogas quimioterapêuticas para seleção de um clone celular com maior nível de produção de rFVIII, levando consequentemente a seleção de um perfil de integração semelhante entre as linhagens celulares, mesmo estas tendo origens teciduais diferentes. / Hemophilia A is a disease characterized by deficiency of blood clotting factor VIII (FVIII) and affects 1 in 5000 men. Developed countries use as therapy for Hemophilia A recombinant FVIII (rFVIII) because rFVIII concentrates have proven efficacy and safety and this therapy consist of an unlimited supply.. Studies in our laboratory using the retroviral vector pMFG-FVIII-P140K, originate the human recombinant cell lines, HepG2FVIIIdB/P140K (liver origen) and Hek293FVIIIdB/P140K (renal origen) which were selected with high doses of Benzyladenine and Temozolomide. This study aimed to characterize the integration pattern of retroviral vector pMFG-FVIII-P140K in these human cell lines, and verify if the profile of integration is related to specific cell type or it was influenced by the selection strategy which cells have been previously submitted. We used the technique of LM-PCR (ligation-mediated PCR) that allows to locate the site of viral vector integration by the sequencing of PCR products. The sequences were obtained after genomic DNA digestion with restriction enzymes and subsequent connection of an adapter (LINKER) to 5or 3 of the DNA fragment. The sequences were analyzed in genomic databases (Human BLAT, and Quickmap DAVID / EASE) for characterization of the respective clones. It was also performed an analysis of relative expression of rFVIII mRNA by RT-PCR and the biological activity was measured by APTT test. Thus it was observed that both cell lines express the mRNA relative to rFVIII and HepG2 and HEK293 cells have levels biologically active recombinant protein approximately 7.9 IU / mL and 2.1 IU / mL, respectively . We sequenced a total of 201 clones of HepG2FVIIIdB/P140K, 123 of these sequences match to the human genome and, among those 73 were considered true and 50 were ambiguous. In Hek293FVIIIdB/P140K 221 clones were sequenced, these total, 179 were similar to the human genome. 64 were true and 115 were ambiguous. We note that the retroviral vector pMFG-FVIII-P140K presents a profile of integration different and non-random between the studied cells lines, in HepG2FVIIIdB/P140K was observed a preference of integration for chromosomes 19, 17 and 11, and in Hek293FVIIIdB/P140K for the chromosome 9. In genomic regions such as CpG islands and transcription factors binding sites (TFBS), there was no difference in the profile of integration in both cell lines. In the two cell lines the vector is inserted preferably at a distance of ± 30 - 60Kb of these regions. We also observed that there was 52% of integration within genes encoding proteins (RefSeq genes) in HepG2FVIIIdB/P140K and 44% in Hek293FVIIIdB/P140K cells. In both cases more than 90% of the insertions occurred in intronic regions. There were 20% of integrations at fragile sites in the genome of HepG2 cell line and 17% in Hek293. In summary this study showed the integration profile of retroviral vector pMFG -FVIII-P140K in two different cell lines that produces FVIIIr protein are very similar. Furthermore, we observed that in both cell lines, HepG2FVIIIdB/P140K and Hek293FVIIIdB/P140K, there are genetic regions within the chromosomes in which the vector displays a preference. The integration profile featured described here differs in CpGs island and TFBS from other studies in the literature that used retroviruses derived from MLV. This leads us to believe that the integration pattern described here may be related to the fact that these cells were previously treated with chemotherapeutic drugs for selecting a cell clone with the highest level of production of rFVIII, consequently leading to selection of a similar profile integration between cell lines, even those having different tissue origins.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-28T12:32:36Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Emerth Mayra Hungria Pinto - 2013.pdf: 1722909 bytes, checksum: e6a82b8a35ca4753b2bb8ca10dd21280 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-28T13:14:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Emerth Mayra Hungria Pinto - 2013.pdf: 1722909 bytes, checksum: e6a82b8a35ca4753b2bb8ca10dd21280 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-28T13:14:01Z (GMT). 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Material and Methods: IgG antibodies to M. leprae recombinant proteins (92f, 46f, LID-1, ML0405 e ML1213; 2 g/ml) and IgM antibodies for the PGL-I synthetic trissacaride (NT-P-BSA; 0.01 g/ml) were detected by ELISA. The following study groups were included (n=847): newly diagnosed untreated leprosy patients (paucibacillary- PB and multibacillary- MB), household contacts of MB patients (HHC), healthy endemic controls (EC) and former MB that concluded leprosy multidrug therapy (MDT) (post MDT). Results: Among participants from Rondonópolis/MT (n=764), the seropositivity of MB patients (n=58) was 59% for 92f, 81% for 46f, 89% for LID-1, 84% for ML0405; 83% were anti-PGL-I positives. Among 10 anti PGL-I negative MB patients, 5 recognized LID-1 e 4 had IgG antibodies to 92f, 46f and ML0405. Among PB leprosy patients (n=93) seropositivity rates to M. leprae recombinant proteins ranged from 5-16%; 8% were anti PGL-I positives. In the HHC (n=192) and in the EC groups (n=282) low reactivity rates were detected ranging from 3-7%. For the post MDT group, positivity rates ranged from 17-45%. Among participants from “Vila do Prata” 3-8% of HHC were seropositives for recombinant proteins; 11% were anti- PGL-I positives. In the post MDT group from “Vila do Prata” (n=47) 33-50% were seropositives for recombinant proteins. Conclusion: High positivity rates to M. leprae- 46f, ML0405 e LID-1 were detected among MB leprosy patients with different genetic/ethnic profiles from distinct geographical regions. These results indicate that the development of a serologic test for leprosy employing both M. leprae recombinant proteins and PGL-I can potentially detect the majority of MB patients from different hiperendemic regions. The use of this diagnostic tool by the public health system can contribute for the early diagnosis and treatment of MB disease which are crucial for the control/elimination of leprosy in Brazil. / O desenvolvimento de testes laboratoriais para o diagnóstico/classificação das diferentes formas clínicas da hanseníase é tema prioritário em pesquisa. O sequenciamento completo do genoma do Mycobacterium leprae, avanços em técnicas de clonagem e expressão gênica e novas ferramentas de bioinformática promoveram a produção e a disponibilidade de novas proteínas recombinantes para avaliação imunológica. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar reatividade sorológica a proteínas recombinantes do M. leprae em pacientes com hanseníase e controles de duas áreas hiperendêmicas para hanseníase do Brasil: Rondonópolis/MT e Vila do Prata/Igarapé-Açú/PA. Materiais e Métodos: A presença de anticorpos IgG para as proteínas recombinantes do M. leprae (92f, 46f, LID-1, ML0405 e ML1213; 2 g/ml) e IgM para o trissacarídeo sintético do PGL-I (NT-P-BSA; 0.01 g/ml) foi avaliada por ELISA. Os grupos de estudo incluíram (n=847): pacientes recém diagnosticados com hanseníase (paucibacilar- PB e multibacilar- MB) virgens de tratamento, contatos domiciliares de MB (CD), controles saudáveis de área endêmica (CS) e casos antigos de hanseníase MB que concluíram a multidrogaterapia (MDT) (pós MDT). Resultados: Entre os participantes de Rondonópolis/MT (n=764), a soropositividade de pacientes MB (n=58) foi de 59% para 92f, 81% para 46f, 89% para LID-1, 84% para ML0405; 83% apresentaram IgM para PGL-I. Dentre 10 pacientes MB soronegativos para PGL-I, 5 reagiram com LID-1 e 4 reconheceram 92f, 46f e ML0405. Entre os pacientes PB (n=93) as taxas de sororeatividade para as proteínas recombinantes variaram de 5-16% e 8% apresentaram sorologia anti- PGL-I positiva. Nos CD (n=192) e CS (n=282) as taxas de reatividade variaram de 3-7%. No grupo pós MDT as taxas de positividade variaram de 17-45%. Na Vila do Prata a taxa de positividade para as proteínas recombinantes nos CD (n=36) variou de 3-8% e 11% dos CD apresentaram anticorpos anti-PGL-I. Entre os indivíduos pós MDT (n=47) as taxas de reatividades variaram de 33-50%. Conclusões: Taxas de positividade acima de 80% foram detectadas para proteínas recombinantes do M. leprae- 46f, ML0405 e LID-1 em pacientes com hanseníase MB com diferentes características genéticas/ étnicas de distintas regiões geográficas. Estes resultados indicam que o desenvolvimento de um teste sorológico para hanseníase que associe proteínas recombinantes e PGL-I tem o potencial de detectar a grande maioria dos pacientes MB provenientes de diferentes regiões hiperendêmicas. O uso deste teste pelo sistema de saúde pública poderá contribuir para o diagnóstico e tratamento precoces da hanseníase MB que são cruciais para o controle/eliminação da doença no Brasil.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As lectinas constituem ferramentas biotecnolÃgicas de fundamental importÃncia em estudos histoquÃmicos e citoquÃmicos para a detecÃÃo de glicoconjugados nos tecidos. Entre estas aplicaÃÃes, destacam-se a identificaÃÃo de receptores de membrana e a detecÃÃo de estruturas caracterÃsticas de neoplasias. A Frutalina, uma lectina -D-galactose-ligante encontrada em sementes de Artocarpus incisa, jà foi utilizada na detecÃÃo histoquÃmica de lesÃes malignas de mama e tireÃide. No presente trabalho foi realizada a clonagem e expressÃo do gene da frutalina em cÃlulas de Escherichia coli Origami (DE3) e foi determinada a estrutura tridimensional dessa proteÃna atravÃs da modelagem por homologia. A clonagem do gene da frutalina foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes em diferentes estÃgios de maturaÃÃo dos frutos de A. incisa. Foram obtidos 12 clones, dos quais 5 foram seqÃenciados. A lectina recombinante foi expressa como cadeia Ãnica, formada pela cadeia beta com 20 resÃduos, ligada a um peptÃdeo de ligaÃÃo com quatro resÃduos, e a cadeia alfa com 133 resÃduos. A expressÃo da lectina foi indicada pelo aparecimento de uma banda protÃica com massa molecular aparente de 19,2 kDa, superior a da lectina nativa (15 kDa), apÃs a induÃÃo com IPTG 1mM. A lectina recombinante foi mantida exclusivamente em corpos de inclusÃo e foi reconhecida imunologicamente por anticorpos policlonais anti-Frutalina. Os modelos gerados para os clones obtidos indicam que as mutaÃÃes ocorridas nÃo alteram os sÃtios de ligaÃÃo a carboidratos das molÃculas. As mutaÃÃes nos clones obtidos sugerem a ocorrÃncia de isoformas dessa proteÃna. / The lectins constitute biotechnological tools of fundamental importance in hystochemical and cytochemical studies for the detection of tissue glycoconjugates. Among their applications are the identification of membrane receptors and the detection of neoplastic characteristic structures. Frutalin, an -D-galactose-binding lectin from Artocarpus incise seeds, has already been used in the hystochemical detection of thyreoid and breast neoplasia. In this work was made a study of the cloning and expression of the frutalin gene in Escherichia coli Origami (DE3) cells and was determined the three-dimensional structure of this protein through homology modeling. The frutalin gene cloning was accomplished from the product on RT-PCR with seeds in distinct stages of development of the Artocarpus incisa fruits. Twelve clones were obtained, from which five were sequenced. The frutalin gene was expressed in E. coli using the pET15b expression vector. A recombinant lectin (rFrutalin) was expressed by growing the bacteria in the presence of isopropyl -D-thiogalactopyranoside 1mM. All the recombinant lectin was found in an insoluble aggregated form as inclusion bodies. The recombinant lectin had a higher molecular mass (19,2 kDa) than the native lectin (15 kDa) as estimated by SDS-PAGE and Western blot analyses, showing that the recombinant single chain Frutalin is not processed in E. coli cells. The models generated for the clones obtained indicate that the mutations do not change the molecules active sites. Mutations in the clones obtained suggest the occurrence of isoforms of this protein.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:55:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Pereira de Sousa.pdf: 2276123 bytes, checksum: a079176d073fb54e951e38fb4291c529 (MD5) Previous issue date: 2012-11-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Malaria is one of the most serious public health problems in the world, accounting for high morbidity and mortality. The diagnosis remains the most widely used microscopy, however this approach requires adequate infrastructure and highly skilled professionals for the exams, making it unfeasible in areas of difficult access. Tests for the rapid and simple diagnosis of malaria are commercially available, but none of national origin, complicating the deployment by the Unified Health System (SUS). Faced with this problem, this study has as main objective the production of Plasmodium vivax Lactate Dehydrogenase (pLDH), aiming at the development of polyclonal antibodies anti-LDH able to detect the native antigen in blood samples from patients infected with the intention of offering future perspectives for the development of a rapid diagnostic test for malaria. For this, pvLDH protein was produced by recombinant DNA technology in host cells chemically competent. Therefore, it was purified to inoculation into rabbits and mice Balb /c. The response of the inoculated animals as well as the performance of polyclonal antibodies anti-LDH in the recognition of native antigen were assessed by ELISA immunoassays and sandwich system, respectively. The animals showed good antibody titers anti-pLDH after the third inoculation of the recombinant protein pLDH, and the rabbit antibody response than the response of mice with absorbance values at dilution 1/100, 2,600 and 2,100, respectively. Polyclonal antibodies anti-pLDH were able to recognize the native protein pLDH 131 samples to 154 samples positive malaria and incapable of recognizing human isoforms of LDH when evaluated against malaria negative samples, since the 23 negative samples evaluated, all also remained negative during the tests. The proposal idealized in this study proved extremely viable and promising. The results of this study meet expectations and provided future prospects as regards the use of recombinant pvLDH for the development of polyclonal and monoclonal antibodies functional in murine model for use in rapid diagnostic test (RDT) for malaria in attempt to offer alternatives to diagnosis in Brazil, or for use in immunoassay targeting the monitoring of the disease course. / A malária é um dos mais sérios problemas de saúde pública do mundo, sendo responsável por elevada morbidade e mortalidade. O diagnóstico mais utilizado continua sendo a microscopia, contudo esta metodologia exige infraestrutura adequada e profissionais altamente qualificados para a realização dos exames, tornando-se inviável em áreas de difícil acesso. Testes para o diagnóstico rápido e simples de malária estão disponíveis no mercado, porém nenhum de origem nacional, dificultando a implantação pelo Sistema Único de Saúde (SUS). Diante desta problemática, o presente estudo tem como principal objetivo a produção de Lactato Desidrogenase de Plasmodium vivax (pvLDH), visando o desenvolvimento de anticorpo os policlonais anti-LDH capazes de detectar o antígeno nativo em amostras sanguíneas de pacientes infectados com a pretensão de oferecer perspectivas para a elaboração de um teste diagnóstico rápido para a Malária. Para isto, a proteína pvLDH foi produzida pela tecnologia do DNA recombinante em células hospedeiras quimicamente competentes. Logo, a proteína foi purificada para a imunização de coelho e camundongos Balb/c. A resposta dos animais as inoculações assim como o desempenho dos anticorpos policlonais anti-LDH no reconhecimento do antígeno nativo foram avaliados por ensaios imunoenzimáticos ELISA indireto e em sistema sanduíche, respectivamente. Os animais demonstraram boa resposta de anticorpos anti-pvLDH após a terceira imunização de proteína recombinante, sendo a resposta de anticorpos do coelho superior a resposta dos camundongos, com valores de absorbância de até 2.600 e 2.100, respectivamente. Os anticorpos policlonais anti-pvLDH foram capazes de reconhecer a proteína LDH nativa em 131 amostras de 154 amostras positivas para malária e incapazes de reconhecer isoformas de LDH humana quando avaliados em relação a amostras negativas para malária, uma vez que das 24 amostras negativas avaliadas, todas se mantiveram também negativas nos ensaios. A proposta idealizada neste trabalho se mostrou extremamente viável e promissora. Os resultados obtidos neste estudo corresponderam às expectativas e forneceram perspectivas futuras no que diz respeito à utilização da pvLDH recombinante para a produção de anticorpos policlonais e monoclonais funcionais, em modelo murino, para a utilização em teste diagnóstico rápido (TDR) para a malária, na tentativa de oferecer alternativas ao diagnóstico no Brasil, ou para a utilização em imunoensaio visando o monitoramento do curso da doença.