Effective management of acute pancreatitis has for centuries eluded mankind. The disease has a wide spectrum of presentation; the milder form is usually a self limiting condition, whereas the severe form presents as a highly morbid and frequently lethal attack. The ability to predict disease progression on admission would aid in the comprehensive and multidisciplinary management of patients. The perfect predictor of disease progression has been an elusive factor hindering the management of the disease. On systematically reviewing literature and identifying appropriate biochemical markers in predicting progression of acute pancreatitis, the ideal predictor would be a combination of biochemical, clinical and contemporary organ dysfunction scoring systems. Early prediction of disease progression however, is important in the better management of the disease. The pathophysiological changes of acinar cell injury and death are the earliest events that occur in acute pancreatitis. Identification of potential pharmacological interventions offered through valuable insight in to experimental and clinical acute pancreatitis may lead on to the development of various natural and synthetic potential disease modifiers. Green Tea Extracts (GTE) consumed in many parts of the world has been examined as a potential therapeutic medication. Experimental results have demonstrated the effect of GTE on the oxidative pathway significantly ameliorating the effects of pancreatic injury. The various green tea catechins especially Epigallocatechin-3- gallate (EGCG) can perhaps be useful lead compounds for new drug discovery. With no specific targeted therapy for severe acute pancreatitis at present, various medications have been tested. The possibility of targeting initial acinar cell injury may not be a feasible option as patient presentation and management would usually be after this phase. As the disease progresses, severe acute pancreatitis is characterised by inflammation and necrosis. The hypothesis of preserving pancreatic parenchymal microvascular patency and thus ameliorating pancreatic injury through the early administration of recombinant human Activated Protein C (rhAPC) has identified a potential treatment for acute pancreatitis. rhAPC converted from its inactive precursor, protein C, by thrombin acts through fibrinolysis and inhibition of thrombosis. Studies on rhAPC in experimental acute pancreatitis examined the modulation of rhAPC on inflammatory markers, morphology, microvascular thrombosis and apoptosis. The encouraging results from initial experimental work helped set up the Phase 2 clinical trial of administering rhAPC early on in severe acute pancreatitis. Prior to taking this significant step from bench to bed side, the variation in functional protein C levels with the severity of the disease was examined as a precursor to the Phase 2 trial.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-12T14:29:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tese_Gazzaneo (Biblioteca Central).pdf: 2832068 bytes, checksum: bb29fc38317d9f60a0d6129655b9b7a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-12T14:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tese_Gazzaneo (Biblioteca Central).pdf: 2832068 bytes, checksum: bb29fc38317d9f60a0d6129655b9b7a1 (MD5) Previous issue date: 2016-03-14 / Defensinas são peptídeos antimicrobianos (AMPs) que apresentam atividade contra diversos microrganismos patogênicos, em especial fungos. Embora não totalmente elucidados, há diversos mecanismos de ação propostos para as defensinas, que incluem permeabilização seletiva ou ruptura da membrana plasmática de microorganismos, ação direta em alvos intracelulares, ativação de cascatas de sinalização e aumento da produção de espécies reativas de oxigênio. Desde a sua descoberta e, tendo em vista sua ampla atividade biológica, o uso de defensinas no melhoramento de plantas cultivadas, bem como na produção de novos medicamentos tem sido proposto. Estudos de atividade biológica e possível aplicação biotecnológica das defensinas demandam uma grande quantidade dessas proteínas. Entretanto, o processo de extração da mesma é laborioso, dispendioso e, de acordo com a população ou disponibilidades da espécie vegetal escolhida, não sustentável ecologicamente. Portanto, a utilização de sistemas heterólogos de expressão é uma importante ferramenta para obtenção de defensinas recombinantes em escala industrial. Nesse estudo, um gene de defensina “DeHys”, isolado da Euphorbia hyssopifolia, foi inserido no plasmídeo pET102/D-TOPO e células da linhagem BL21(DE3) de Escherichia coli foram transformada com essa construção. Foi produzida a defensina recombinante Dehys com tamanho aproximado de 24 kDa. Sua identidade foi confirmada por western blot e pela análise do padrão de digestão com proteases. / Defensins are antimicrobial peptides (AMPs) , which present activity against a variety of pathogenic microorganism, especially funghi. Although not completely elucidated, there are a variety of proposed mechanisms of action for defensins, which includes selective microorganisms plasmatic membrane permeabilization or rupture, straight action agains intracellular targets, activation of signaling cascades and the burst of reactive oxygen species. Since it’s discovery and due to it’s wide biological activities, it’s use in crop enhancing, as well as its use in the development of new drugs have been proposed. Defensin’s biological activity and biotecnological application studies demand a reasonable amount of purified protein. However, the extraction processes is laborious, expensive, time consuming and depending on the population or the chosen plant species supply, not ecologically sustainable. So, the use of heterologous expression sytems is an importante tool to obtain purified proteins in industrial scale. In this study, a defensing gene (Dehys) isolated from Euphorbia hyssopifolia was inserted in a p pET102/D-TOPO vector and trasnformed into BL21(DE3) Escherichia coli strains. A recombinat Dehys defensin of approximately 24 kDa was obtained. It’s identity was double-checked using by Western blot and protease digestion pattern analyses.

As aminoacil-tRNA sintetases catalisam fielmente a ligação do aminoácido ao seu tRNA cognato. A triptofanil-tRNA sintetase (TrpRS) catalisa a ligação de triptofano e alguns análogos de triptofano ao tRNATrp. 1-metiltriptofano (1MW) e 1-metil-7-azatriptofano (1M7NW) não são reconhecidos pela TrpRS, mas possuem características espectroscópicas convenientes para estudos de fluorescência em complexos multiprotéicos. O objetivo deste trabalho é modificar o sítio ativo da TrpRS de E.coli, visando promover a catálise da ligação de 1MW e 1M7NW ao tRNATrp in vivo e permitir a incorporação destes em proteínas recombinantes. Com base numa análise da estrutura da TrpRS:Trp-AMP de B. Stearothermophilus, foram produzidos quatro mutantes de TrpRS de E. coli, com substituição do Asp 135 por Ala (D135A), Cys (D135C), Ser (D135S) e Thr (D135T). Estas proteínas foram superexpressas nas condições utilizadas para a incorporação de análogos de Trp. Através de ensaio de fluorescência do 1MW, pôde-se observar uma pequena incorporação deste nas TrpRS mutantes. Construiu-se um novo vetor de expressão no qual os TrpRS mutantes seriam expressos de forma constitutiva e uma segunda proteína, troponina C F29W, seria expressa de forma induzível. No entanto, não se observou incorporação do 1MW nestas proteínas. Ensaios de atividade in vitro, de formação de triptofano-hidroxamato e de intercâmbio de pirofosfato da TrpRS e mutantes indicaram uma baixa atividade dos mutantes utilizando triptofano como substrato. Os mutantes D135C e D135S apresentaram um considerável aumento (aproximadamente 24 vezes) na especificidade para 1MW em comparação ao Trp. A anotação do genoma da Xanthomonas indicou que a TrpRS deste organismo possui 88 aminoácidos extras na região C-terminal, o que é incomum para procariotos (somente observado em Xyllela e Pseudomonas). Clonou-se, expressou-se e purificou-se a TrpRS da Xanthomonas, com e sem os 88 aminoácidos extras. Observou-se atividade enzimática em ensaios de formação de triptofano-hidroxamato e intercâmbio de pirofosfato nas quais a TrpRS sem os 88 resíduos C-terminais apresentou uma atividade um pouco menor que a enzima tipo selvagem. / Abstract not available.

A utilização de células humanas para a produção do fator VIII de coagulação recombinante (rFVIII) visa obter padrões de glicosilação equivalentes aos encontrados na proteína normal. O objetivo do trabalho foi obter um processo de produção do rFVIII em biorreator em perfusão, devido à sua labilidade térmica. Foram realizados estudos preliminares em Spinner e biorreator utilizando uma linhagem de rHeLa, cujos resultados embasaram os estudos com a linhagem produtora rSkHep. Foram utilizados microcarregadores nos cultivos com esta linhagem devido à dificuldade de adaptação da mesma à suspensão. Ensaios preliminares identificaram a melhor condição de cultivo com 3 g/L Mic e 1 cel/mic e, a partir destes valores, realizou-se um ensaio em perfusão, com tempo de residência de 24 h, no qual as variáveis controladas foram mantidas constantes durante três tempos de residência. A concentração de rFVIII obtida foi semelhante 2 UI/ mL. / The interest in using human cells for the recombinant coagulation factor VIII (rFVIII) lies in obtaining glycosylation patterns similar to the ones found in the normal protein. The objective of this work was to obtain a process for rFVIII production in bioreactor, in perfusion mode, due to the thermal lability of the protein. Using a recombinant HeLa cell line adapted to suspension growth a group of studies in a bioreactor in batch mode were performed. These results were the basis for the studies performed with the producing cell line rSkHep. Microcarriers (micc) were used due to the harshness to adapt the cell line to suspension and to serum-free medium. Preliminary tests identified the best culture condition with 3 g micc/L and 3 cell/micc and, from its values, it was performed a bioreactor study in perfusion mode, with a residence time of 24 hours. The controlled variables were kept constant for three residence times. The maximum rFVIII concentration obtained was 2 UI/mL.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. No mundo, aproximadamente 500.000 casos são reportados a cada ano, com 10% de taxa de mortalidade. Atualmente, vacinas contra leptospirose são compostas por células inativadas e são ineficazes em diferentes aspectos. Após analise do genoma, os genes LIC11121, LIC11087, LIC11228 e LIC11084 foram escolhidos para caracterização da imunogenicidade de suas respectivas proteínas. Esses genes foram clonados no vetor de expressão pAE e as proteínas recombinantes foram purificadas. Os resultados sugerem que essas proteínas podem estar localizadas na membrana externa, são imunogênicas, possivelmente expressas durante a infecção e que podem ter envolvimento em mecanismos de evasão do sistema imune e de patogenicidade da bactéria. Além disso, em um de dois experimentos, a proteína rLIC11084 induziu imunidade protetora parcial em hamsters imunizados frente desafio letal. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. In the world, nearly 500,000 cases are reported each year, with 10% of mortality rate. Currently, vaccines against leptospirosis are composed by inactivated cells that are ineffective in many aspects. After genome analysis, the genes LIC11121, LIC11087, LIC11228 e LIC11084 were chosen for immunogenicity characterization of their respective proteins. These genes were cloned in the pAE expression vector and the proteins encoded by LIC11087, LIC11228 and LIC11084 were purified. The results suggest the localization of these proteins in the bacterial outer membrane, are immunogenic, are possibly expressed during infection and may have involvement in mechanisms of immune system evasion and pathogenicity. Moreover, in one of two experiments, the rLIC11084 protein induced partial protective immunity of immunized hamsters against lethal challenge.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. O sequenciamento do genoma completo de L. interrogans sorovar Copenhageni tem permitido a obtenção e caracterização de proteínas potencialmente envolvidas na patogênese desta bactéria, como lipoproteínas e proteínas de membrana externa. Neste trabalho, foram estudados três genes, OmpL1, LIC10731 e LIC10645, dos quais o gene OmpL1 foi o mais frequente em diferentes espécies de Leptospira. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade ao metal. As três proteínas recombinantes promoveram resposta humoral e celular após imunização em camundongos. Ensaios de adesão mostraram que as proteínas se ligam à laminina e plasminogênio, e adicionalmente a proteína OmpL1 se liga ao fibrinogênio e fibronectina plasmática. A proteína OmpL1 foi bastante reativa com soro de pacientes de leptospirose. Os resultados sugerem que as proteínas referentes aos genes estudados podem desempenhar um papel na patogênese da bactéria. / Leptospirosis is a zoonosis caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. Annotation of the genome sequences of L. interrogans serovar Copenhageni allows the identification and characterization of proteins potentially involved in the pathogenesis of this bacterium, such as lipoproteins and outer-membrane proteins. The present study characterized three genes, OmpL1, LIC10731 and LIC10645, and one of them, OmpL1, was the most frequent among different species of Leptospira. The recombinant proteins were purified by metal-chelating chromatography. All three recombinant proteins promoted humoral and cellular response after immunization in mice. Binding assays showed that all proteins interact to laminin and plasminogen, and additionally protein OmpL1 binds to fibrinogen and plasma fibronectin. OmpL1 was highly reactive with positive-leptospirosis human sera. The results suggest that the proteins encoded by these genes may play a role in the bacterium pathogenesis.

Leptospirose é uma zoonose mundial que causa grandes prejuízos econômicos e sociais. Os mecanismos de patogenicidade da leptospira ainda não estão totalmente elucidados. Nesse trabalho foi avaliado o papel de três proteínas hipotéticas de superfície na patogenia da leptospirose: LIC11009, LIC11360 e LIC11975. Os genes foram clonados a partir do DNA da L. interrogans sorovar Copenhageni e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. RT-qPCR mostrou a transcrição dos genes em leptospiras. As proteínas recombinantes reagiram com soro de humanos diagnosticados com leptospirose. rLIC11009 induziu somente resposta imune Th1 em camundongos, enquanto que rLIC11360 e rLIC11975 induziram resposta Th1 e Th2. As três proteínas recombinantes se ligaram à laminina e plasminogênio, enquanto rLIC11360 e rLIC11975 também se ligaram à fibronectina plasmática e fibrinogênio. Em adição, rLIC11360 se ligou ainda aos reguladores do sistema complemento fator H e C4BP. Os resultados sugerem que as proteínas estudadas podem auxiliar a leptospira a evadir e invadir o hospedeiro. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis that causes great economic and social losses. The pathogenic mechanisms of leptospira are not yet fully elucidated. In this study we evaluated the role of three hypothetical surface proteins in the leptospiral pathogenesis: LIC11009, LIC11360 and LIC11975. Genes were cloned from DNA of L. interrogans serovar Copenhageni and the recombinant proteins were purified by affinity chromatography. RT - qPCR data have shown that the genes are fully transcribed in leptospires. Recombinant proteins reacted with sera from humans diagnosed with leptospirosis. rLIC11009 induced Th1 immune response in mice, whereas rLIC11360 and rLIC11975 promoted both Th1 and Th2. The three recombinant proteins interacted with laminin and plasminogen while, rLIC11360 and rLIC11975, also interacted with plasma fibronectin and fibrinogen. In addition, rLIC11360 interacted with the complement regulators factor H and C4BP. These results suggest that the proteins tested can help leptospires to evade and invade the host.

O sistema de expressão de proteínas que utiliza baculovírus como vetor tem sido intensamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes, pois ele permite a formação de modificações pós-traducionais e conta com um forte promotor, a poliedrina. Porém, em alguns casos, esse sistema não é tão eficaz, pois a infecção das células pelo vírus induz morte por apoptose, limitando a produção industrial de várias proteínas recombinantes de interesse. Reportamos a ocorrência de apoptose em cultivos de células de insetos e de mamíferos com depleção de nutrientes ou induzidos por agentes químicos e virais, e a suplementação dessas culturas com hemolinfa de Lonomia obliqua é capaz de estender a viabilidade da cultura evitando a morte por apoptose. Como objetivo, verificamos previamente o mecanismo de ação antiapoptótica de um isolado protéico da hemolinfa de L. obliqua. A identificação deste mecanismo poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias para controlar a apoptose nos cultivos permitindo a otimização da produtividade viral e de proteínas recombinantes. / The protein expression system using baculovirus as a vector has been intensively used for the production of recombinant proteins because it allows the formation of post-translational modifications and has a strong promoter, polyhedrin. However, in some cases, this expression system is not as effective because the infection of cells by baculovirus induces death by apoptosis, thereby limiting the industrial production of various recombinant proteins of interest. We report the occurrence of apoptosis in cultured insect cells and mammalian depleted of nutrients or induced by chemical and viral agents, and supplementation of these cultures with hemolymph of Lonomia obliqua is able to extend the viability of the culture avoiding death by apoptosis. This study aimed to determine in advance the anti-apoptotic mechanism of action of a protein isolated from hemolymph of L. obliqua. The identification of this mechanism may help develop strategies for controlling apoptosis in cell culture allowing the optimization of productivity of viral and recombinant proteins.

Asma alérgica é uma inflamação pulmonar crônica mediada por células Th2. A Hipótese da Higiene é a teoria aceita para explicar o aumento das alergias nas últimas décadas e preconiza que a menor exposição dos indivíduos a componentes microbianos prejudica a geração mecanismos imunorregulatórios. Nosso estudo abordou a modulação da resposta alérgica pulmonar induzida por ovalbumina, por cepas de bacilo Calmette-Guérin recombinantes (rBCG) que expressam fragmentos de toxinas bacterianas. Observamos que dependendo do antígeno heterólogo expresso, a imunização intranasal com rBCG pode levar tanto a supressão como a exacerbação da resposta alérgica pulmonar. Demonstramos que tanto em um contexto profilático quanto terapêutico, rBCG é capaz de suprimir os parâmetros alérgicos, e a supressão não envolve o recrutamento de células T regulatórias, é um fenômeno local, está associada a maior produção de IFN-g do que IL-4 e é dependente de IL-12. Estes dados sugerem que a infecção pulmonar por rBCG gera um milieu capaz de bloquear a migração de células Th2 inflamatórias. / Allergic asthma is an atopic disorder mediated by Th2 cells. The Hygiene Hypothesis is the accepted theory to explain the increasing in allergy in recent deacades. It states that modern health care and hygiene practices have led to a reduced exposure to microorganisms components which impairs the generation of immunoregulatory mechanisms. The present study analysed how the intranasal infection with recombinant bacillus Calmette-Guérin (rBCG) strains expressing fragments of bacterial toxins could modulate an allergic pulmonary inflammation induced by ovalbumin. We demonstrated that the rBCG strains could supress or exacerbate the allergic inflammation depending on the expressed heterologous antigen. We analysed the effect of the mycobacterial infection in a prophylactic and in a therapeutical contexts, and we have identified that for both situations the of supression allergic features does not involve the recruitment of regulatory T cells to the lungs, is a local phenomena, is associated with an increased production of IFN-g, and is an IL-12 dependent mechanism. Taken togheter, this data suggest that the rBCG pulmonary infection generates a milieu capable to supress the chemotaxis for Th2 cells, which suppress the establishment of the allergic inflammation in the lungs.

O sequenciamento genômico da L. interrogans sorovar Copenhageni e ferramentas de bioinformática nos permitiram selecionar 15 genes que codificam proteínas hipotéticas conservadas preditas de superfície. A conservação foi confirmada por PCR em seis dos sorovares mais predominantes de L. interrogans. As proteínas recombinantes foram clonadas em vetor de expressão de E. coli em fusão com seis resíduos de histidina, que permite a purificação por cromatografia de afinidade a metal. Seis proteínas apresentaram reatividade com anticorpos presentes em soros de pacientes com leptospirose. Através de um ensaio de adesão por ELISA, identificamos uma nova adesina de leptospira, Lsa21, que interage fortemente com laminina, colágeno IV e fibronectina plasmática. Usando a metodologia de Western blotting, identificamos mais nove possíveis adesinas. Nossos ensaios de desafio demonstraram que as proteínas rLIC12730 conferiu proteção contra infecção letal de L. interrogans em hamsters. Nossos dados sugerem que seja um promissor candidato na prevenção da leptospirose. / The whole-genome sequences of L. interrogans serovar Copenhageni and the bioinformatic tools allow us to choose fifteen genes encoding for conserved hypothetical proteins predicted to be exported to the membrane. The chosen genes were amplified by PCR from six predominant pathogenic serovars, the DNA cloned in an E. coli vector, the recombinant proteins expressed in fusion with 6xHis-tag at N-terminus and purified by metal affinity chromatography. Six proteins were recognized by antibodies present in sera from human patients diagnosed with leptospirosis. By ELISA-attachment assay, we have identified a novel adhesion, named Lsa21, that binds strongly to laminin, collagen IV, and plasma fibronectin. By western blotting assay, we have further identified nine novel probable adhesions. The immunization/challenge assays showed that the recombinant protein rLIC12730 afforded protection against lethal leptospiral inoculation in hamsters. Our data suggest that it is a promising candidate for prevention of leptospirosis.