L’arrêt cardiaque (AC) est un problème de santé publique dont la mortalité reste très élevée malgré les progrès de la réanimation. La majorité des décès à distance de la réanimation cardio-pulmonaire (RCP) initiale est la conséquence du syndrome post‑AC provoqué par les lésions cellulaires d'ischémie-reperfusion (I/R) qui touchent principalement le cœur et le cerveau. L’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial (PTP), en lien avec la cyclophiline D (CypD), est un déterminant majeur des lésions d'I/R. L’hypothermie thérapeutique est le seul traitement adjuvant de la RCP qui a démontré un bénéfice sur la survie des patients en limitant le syndrome post-AC. Ses mécanismes d’action complexes ne sont que partiellement compris. Dans ce travail de thèse, nous avons, dans un premier temps, utilisé notre modèle d'AC chez le lapin pour étudier les mécanismes mitochondriaux de l’hypothermie thérapeutique. Notre modèle a d'abord permis de mettre en évidence le rôle important joué par la température dans la gravité du syndrome post‑AC et les effets protecteurs de l’hypothermie sur le cœur et le cerveau. Notre travail montre également que l'hypothermie inhibe l’ouverture du PTP par un mécanisme dépendant de la CypD et agit sur une voie de signalisation cellulaire. Nous avons, dans un second temps, mis au point un nouveau modèle d'AC chez la souris déficiente en CypD montrant que l'inhibition complète du mécanisme dépendant de la CypD d'ouverture du PTP améliore le succès de la RCP ainsi que le pronostic à long terme des animaux traités par hypothermie thérapeutique. Ainsi, nos travaux contribuent à identifier les mécanismes d'action mitochondriaux de l’hypothermie thérapeutique ainsi que des pistes pour améliorer le pronostic des patients après un AC réanimé / Despite advances in resuscitation science, mortality after cardiac arrest (CA) remains very high. A substantial proportion of cardiac arrest deaths occur in patients following successful resuscitation and can be attributed to the development of post-CA syndrome caused by cellular ischemia-reperfusion (I/R) injury that primarily affect heart and brain cells. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (PTP), promoted by cyclophilin D (CypD), is a major determinant of I/R injuries. Therapeutic hypothermia is the only adjuvant therapy to cardiopulmonary resuscitation (CPR) known to improve survival by limiting the post-AC syndrome. The mechanisms of action of therapeutic hypothermia are still poorly understood. In this present work, we used our model of CA in rabbit to study the role of the PTP in the mechanisms of action of therapeutic hypothermia. Our model first highlighted the important role played by temperature in the severity of post-AC syndrome and the protective effects of hypothermia on heart and brain injuries. Our work also determined that hypothermia inhibited PTP opening by a CypD-dependent mechanism and acted on a pro-survival signaling pathway. We then developed a new CA model using CypD-deficient mice showing that complete inhibition of the CypD-dependent mechanism of PTP opening improved success of CPR and long-term survival of hypothermia-treated animals. Thus, our work contributes to identifying the mitochondrial mechanisms of action of therapeutic hypothermia and ways to improve the prognosis of patients after CA

Au sein du laboratoire, par une stratégie de conception de médicaments par la méthode des fragments, nous avons généré une nouvelle famille d'inhibiteurs de cyclophilines, les SMCypI (« Small-Molecule Cyclophilin Inhibitors »), non liée aux autres inhibiteurs de cyclophilines existants. Les cyclophilines sont des protéines cellulaires impliquées dans un grand nombre de processus biologiques. Toutefois, les inhibiteurs de cyclophilines disponibles possèdent de nombreux inconvénients qui rendent leur utilisation clinique difficile. Au cours de ma thèse nous nous sommes intéressés au développement des SMCypI dans deux domaines en particulier, la Virologie et l’Hépatologie.Dans le domaine de la Virologie, les cyclophilines sont impliquées dans la réplication de plusieurs virus et constituent donc une cible de choix dans le développement d'antiviraux à large spectre. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de l’activité antivirale de ces molécules sur le virus de l’Hépatite C, avec comme objectif de démontrer leur activité pangénotypique, leur haute barrière à la résistance, leur mécanisme d’action et leur activité antivirale à large spectre pour d’autres virus de la famille des Flaviviridae.Dans le domaine de l’Hépatologie, les lésions d’ischémie-reperfusion hépatique sont rencontrés pendant la chirurgie hépatique et la transplantation hépatique. La mitochondrie est un acteur majeur via l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial. L’ouverture du pore est modulée par la cyclophiline D. Dans un deuxième temps, nous avons étudié les effets des SMCypI sur cette deuxième cible. Cela nous a permis de démontrer leur effet hépatoprotecteur dans un modèle murin d’ischémie-reperfusion hépatique.L’ensemble de ces résultats ouvre la porte pour le concept des antiviraux à large spectre, et l’utilité dans le domaine de l’hépatologie comme molécules hépatoprotectrices.... / In our laboratory we previously reported a rational design of a new family of smallmolecule cyclophilins inhibitors, SMCypI, unrelated to other cyclophilins inhibitors by means of a complex fragment-based drug discovery approach. Cyclophilins are cellular proteins involved in multiple biological processes. Unfortunately, different disadvantages have limited their clinical development. The aim my thesis was to study the SMCypI in two particulars fields, Virology and Hepatology.In the field of Virology, cyclophilins inhibitors are involved in viral replication of multiple viruses, which make them a convenient target for the development of “broad-spectrum antivirals”. Here, we first characterized the pangenotypic anti-HCV activity of this new family of SMCypI, with high resistance barrier. We studied its mechanism of action andits broad antiviral activity on other members of the Flaviviridae family.In the field of Hepatology, ischemia-reperfusion injuries occur during liver surgery and liver transplantation. Mitochondria play a central role in the opening of mitochondrial permeability transition pore. The opening of this pore is mainly regulated by cyclophilin D. The aim of the second part of our work was to demonstrated a hepatoprotective effect of the SMCypl in a murine model of hepatic ischemia reperfusion injury.Overall, these results are leading the way to the development of broad-spectrumantiviral drugs and their use in hepatology as hepatoprotective drugs....

Thesis (MScMedSc (Biomedical Sciences. Medical Physiology))--Stellenbosch University, 2008. / Background and purpose. To limit ischaemic injury, rapid restoration of coronary blood flow is required, which will in turn reduce infarct size. However, reperfusion itself causes myocyte death – a phenomenon termed lethal reperfusion-induced injury, which limits protection of the ischaemic myocardium. Thus the reperfusion of irreversibly damaged myocytes may accelerate the process of cell necrosis. Additive protection of the ischaemic myocardium in the form of adjunct therapy remains a topic of intensive research. Levosimendan, a calcium sensitizing agent with positive inotropic effects has in several studies been found to alleviate the damaging effects of reperfusion injury. Levosimendan has been shown to be a KATP channel opener. These channels have been implicated to play an important role in ischaemic preconditioning (IPC). With this knowledge, the aim of this study was to determine whether levosimendan and IPC have certain cardioprotective mechanisms in common and whether protection with pharmacological preconditioning could be elicited with levosimendan. In this study, we investigated whether: 1) the isolated guinea pig heart could be protected by ischaemic preconditioning (IPC) and postconditioning (IPostC), 2) the heart could be pharmacologically pre- and postconditioned, using levosimendan (LPC & LPostC), 3) a combination of IPC & LPC had an additive protective effect on the heart, 4) the KATP (both mitochondrial and sarcolemmal) channels are involved in this protection and 5) the pro-survival kinases of the RISK (reperfusion injury salvage kinase) pathway are involved. Experimental approach. Isolated perfused guinea pig hearts were subjected to three different IPC protocols (1x5, 2x5 and 3x5 minutes of ischaemia) or levosimendan (0.1μM) preconditioning, before coronary artery occlusion (CAO – 40min@36.5ºC), followed by 30 minutes of reperfusion. Hearts were also subjected to a combination of IPC & LPC, to establish whether they had additive protective effects. In addition, hearts were pre-treated with levosimendan directly before induction of sustained ischaemia (without washout of the drug – levosimendan pre-treatment (LPT)) for 10min. With the postconditioning protocol, iii the hearts were subjected to 3x30second cycles of ischaemia/reperfusion or levosimendan/vehicle. In a separate series of experiments, hearts were treated with KATP channel blockers (for both sarcolemmal & mitochondrial), before LPC, LPT and LPostC. The endpoints that were measured were: cardiac reperfusion function, myocardial infarct size and RISK pathway expression and phosphorylation (PKB/Akt and extracellular signal-regulated kinase – ERK42/44). Results. IPC, IPostC, LPC & LPostC decreased myocardial infarct size significantly compared with their controls (21.9±2.2%, 21.4±2.2%, 20.6±3.1% and 20.6±1.8% respectively vs. 46.4±1.8% for controls, p<0.05). The combination of IPC & LPC had no additive protective effect. Pre-treating the hearts with levosimendan (without washout), before index ischaemia, proved to be the most effective method of cardioprotection (infarct size: 5.8±0.9% vs. 46.4±1.8% for controls, p<0.001). With LPT a significant increase (p < 0.05 vs. control) in phosphorylation of ER42/44 was also observed. An increase in the activity of one of the RISK pathway kinases, ERK42/44 seems to be one of the reasons for LPT’s efficacy. Treating the hearts with KATP channel blockers before subjecting them to LPC, LPT & LPostC abolished the protective effects induced by levosimendan, suggesting a role for the sarcolemmal and mitochondrial KATP channels in levosimendan-induced cardioprotection. Conclusions and implications. 1) Isolated guinea pig hearts could be pre- and postconditioned within the setting of ischaemia, 2) Hearts could be pharmacologically pre- and postconditioned with levosimendan, 3) levosimendan pre-treatment is the most effective way to reduce infarct size, possibly acting by increasing the phosphorylation of ERK42/44, 4) Myocardial protection was not increased by combining IPC & LPC (suggesting similar mechanisms of protection), 5) LPC, LPT and LPostC were abolished by both sarcolemmal and mitochondrial KATP channel blockers. .LPC and especially LPT, could be useful before elective cardiac surgery while LPostC may be considered after acute coronary artery events.

Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2005. / ENGLISH ABSTRACT: The reperfusion injury after myocardial ischemia is relevant in the clinical setting, after cardiopulmonary bypass for cardiac surgery, after PTCA and stenting and after cardiopulmonary resuscitation. The components of the reperfusion injury considered in this study were myocardial stunning and reperfusion arrhythmias. Calcium antagonists have been shown to be beneficial in attenuating the myocardial reperfusion injury in the in vitro and in vivo laboratory setting (Lamping, Gross 1985, Przyklenk and Kloner 1988, Taylor 1990, Ehring 1992, Gross and Piper 1992). However systemic administration of a dose of calcium antagonist, large enough to attenuate the myocardial reperfusion injury in the clinical setting, would inevitably lead to unwanted systemic side effects of the drug. The aim of this study was to investigate the hypothesis that an adequate dose of verapamil administered timeously, directly into the ischemic myocardium, would attenuate the reperfusion injury, either when administered from the onset of ischemia, or from 3 minutes before reperfusion. The anesthetized open chest porcine model of myocardial ischemia (15 min total LAD occlusion) and reperfusion was employed in this study. A low dose of verapamil (0.5 mg/8mt or 0.0625mg/mt), a high dose of verapamil (2mg/8m or O.25mg/ml), or vehicle (saline) (8ml) was infused over 8 minutes, directly into the LAD coronary artery supplying the ischemic segment. The infusion was started either at the onset of ischemia, or from 3 minutes before reperfusion. The time taken for the various parameters to return to pre ischemic values was compared between the different groups. The results showed that the high dose of verapamil (2mg) attenuated the reperfusion injury both when administered from the onset of ischemia, and when administered from 3 minutes before reperfusion, compared to either the low dose of verapamil, or the saline infusions. The high dose of verapamil groups had a faster recovery of both systolic contractile function and diastolic function and a lower incidence of ventricular fibrillation on reperfusion. There were no systemic effects of verapamil infusion in any of the groups. The clinical setting of cardiac surgery expressly lends itself to the clinical application of this finding. There is direct access to the coronary arteries both before ischemia and before reperfusion. A small dose of calcium channel blocking drug, with no systemic effect can be administered into the aortic root at the onset of ischemia, just prior to cardioplegia (when the heart is still warm), and after rewarming a few minutes prior to removal of the aortic cross clamp. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die reperfusie besering na miokardiale isgemie is klinies relevant na kardiopulmonêre omleiding vir hart chirurgie, na kardiologiese PTKA en stut prosedures en na kardiopulmonale ressussitasie. Die komponente van die reperfusie besering wat in hierdie studie oorweeg is, is miokardiale tydelike omkeerbare onderdrukking (stunning) en reperfusie arritmieë. Kalsium antagoniste is gewys om effektief te wees in beperking van die reperfusie besering in beide in vitro en in vivo laboratorium eksperimente (Lamping, Gross 1985, Przyklenk en Kloner 1988, Taylor 1990, Ehring 1992, Gross en Piper 1992). Sistemiese toediening van 'n dosis kalsium kanaal blokker, voldoende om die miokardiale reperfusie besering in die pasiënt te beperk, lei egter tot ongewenste sistemiese newe effekte van die middel. Die doel van die studie was om die hipotese te ondersoek dat 'n voldoende dosis verapamil, wat betyds direk toegedien is aan die isgemiese miokardium, die reperfusie besering sal beperk, ongeag of dit toegedien is vanaf die begin van isgemie, of van 3 minute voor reperfusie. Die vark model van miokardiale isgemie en reperfusie is aangewend in die studie. Die varke was tydens die eksperiment onder narkose, met die borskas oop, en 15 minute totale LAD okklusie is toegepas. 'n Lae dosis verapamil (0.5mg/8ml of 0.0625 mg/mt), of hoë dosis veraparnil (2mg/8mt of 0.25mg/mt), of saline (8mt) is oor 8 minute toegedien direk in die LAD arterie wat die isgemiese segment voorsien. Die infuus is begin direk na die aanvang van isgemie, of 3 minute voor die aanvang van reperfusie. Die tyd geneem vir terugvoer van parameters na pre isgemiese waardes is tussen die groepe vergelyk. Die resultate toon dat die hoë dosis veraparnil die reperfusie besering beperk in vergelyking met die lae dosis veraparnil of saline infusies, ongeag of dit van die begin van isgemie, of van 3 minute voor reperfusie toegedien word. Die groepe wat die hoë dosis veraparnil ontvang het, het vinniger herstel van sistoliese en diastoliese funksie getoon en het'n laer insidensie van reperfusie disritmieë, gewys. Geen sistemiese effekte van veraparnail infuus is waargeneem nie. Die kliniese toepassing van hierdie bevinding is by uitstek geskik vir toepassing tydens kardiopulmonale omleiding by kardiale chirurgie. Daar is direkte toegang tot koronêre arteries voor isgemie en voor reperfusie. 'n Klein dosis kalsium antagonis, met weglaatbare sistemiese effekte, kan toegedien word in die aorta wortel met die aanvang van isgemie, net voor kardioplegie toediening (hart steeds warm), en na verwarming, 'n paar minute voor verwydering van die aorta kruis klem.

Nous avons démontré la présence d'apoptose dans le système limbique suivant un infarctus du myocarde. Cette mort cellulaire serait partiellement reliée à l'augmentation de cytokines pro-inflammatoires. Des études démontrent que certains probiotiques ont des effets bénéfiques en diminuant le ratio de cytokines pro/anti-inflammatoires. La prise de probiotiques en prévention, avant l’occlusion d’une artère coronarienne, pourrait-elle diminuer l’apoptose dans le système limbique? Méthodes : La combinaison de probiotiques Lactobacillus helveticus R0052 et Bifidobacterium longum R0175 ou son véhicule fut additionné dans l’eau des rats pendant 28 jours consécutifs. Un infarctus du myocarde fut provoqué par l’occlusion de l’artère coronaire gauche. Après 40 minutes d'occlusion, les régions ischémiques ont été reperfusées pour 72 heures. Les animaux furent sacrifiés et la taille de l'infarctus mesurée. L'amygdale et l'hippocampe furent prélevés pour déterminer l'activité de la caspase-3 (pro-apoptotique), le ratio Bax/Bcl2(proapoptotique/ anti-apoptotique) et l'activité d'Akt (survie cellulaire). Résultats : La taille de l’infarctus n'est pas diminuée dans le groupe probiotique (45% de la région à risque)comparé au groupe placebo. Nos marqueurs d’apoptose démontrent une diminution dans les régions du gyrus denté, de l’amygdale latérale et médiane dans le groupe probiotique par rapport au placebo. L’activité de la caspase-3 et le ratio Bax:Bcl2 furent réduits dans le groupe probiotique de 50% et 40% respectivement (p < 0.05) et phosphorylation d’Akt fut augmentée de 35% (p<0.05). Aucune différence fut observée pour les régions Ca1 et Ca3. Conclusion : La combinaison de probiotiques utilisée réduit l’apoptose dans différentes régions du système limbique 72 heures après un IM. / Apoptosis is observed in limbic system after a myocardial infarction (MI). This cell death is due to the release of pro-inflammatory cytokines. Since probiotics reduce the pro/anti-inflammatory cytokine ratio, we hypothesise that probiotics will lessen apoptosis in the limbic system following MI. Methods: Rats were given probiotics or placebo for 4 consecutive weeks. Rat in the probiotic group received a daily dose of over 1 billion live bacterial cells of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 in combination. A MI was then induced in anesthetised rats by a 40-minute occlusion of the left anterior coronary artery followed by a 72 hours of reperfusion. Infarct size was measured and apoptosis was determined in the amygdala and hippocampus in both groups. Results: Infarct size was not diminished in the probiotic group (45% of the risk area), apoptosis was lessened in the dentate gyrus (DG), the lateral (LA) and medial (MA)amygdala compared to the placebo group. Caspase-3 and Bax/Bcl2 ratio were reduced in the probiotic group by about 50% and 40% respectively. Akt activity was increased by 35% in these regions. No difference was observed in the hippocampus Ca1 and Ca3 regions. Conclusion: This probiotic combination can reduce the apoptosis found in specific regions of the limbic system following a MI, which may have significance for post-MI depression.

Le récepteur CD36 est impliqué dans le transport des acides gras libres non estérifiés (AGNE) au niveau des tissus cardiaque et périphériques. Les dommages tissulaires et la dysfonction cardiaque observés après une ischémie-reperfusion (I/R) du myocarde sont en partie liés à l’internalisation et au métabolisme oxydatif accrus des AGNE dont la concentration sanguine augmente transitoirement après un infarctus du myocarde, contrairement à ce qui est observé chez des souris déficientes en CD36. Nous avons émis l’hypothèse selon laquelle le EP 80317, un ligand synthétique du récepteur CD36, exercerait un effet cardioprotecteur contre les dommages induits par une ischémie transitoire du myocarde. Nos objectifs étaient 1) de vérifier l’effet cardioprotecteur du EP 80317 et 2) de définir son mécanisme, plus précisément de documenter l’effet du traitement sur le métabolisme lipidique. À cette fin, des souris de type sauvage ont été traitées par le EP 80317 (289 nmol/kg) par voie sous-cutanée pendant 14 jours avant d’être soumises à 30 minutes d’ischémie suivant la ligature de l’artère coronaire gauche descendante et de sa reperfusion pendant une période de 6 ou 48 heures. Le cœur et les tissus périphériques (foie, muscle squelettique et dépôts adipeux) ont été prélevés pour déterminer le profil de certains gènes impliqués dans la régulation du métabolisme lipidique. Nos travaux ont montré que l’effet cardioprotecteur d’un traitement préventif par le EP 80317 est associé à une augmentation transitoire du stockage des triglycérides et d’une réduction des AGNE circulants. / The CD36 receptor is involved in the transport of non-esterified fatty acids (NEFA) in cardiac and peripheral tissues. Tissue injury and cardiac dysfunction are in part due to acute internalization and oxidative metabolism of NEFA which concentration rises transiently in the blood following myocardial infarction, in opposition to what is observed in CD36-deficient mice. We hypothesized that EP 80317, a synthetic ligand of the CD36 receptor, provides cardioprotective effect against injuries induced by transient myocardial ischemia. Our objectives were 1) to verify the cardioprotective effect of EP 80317 and 2) to define its mechanism, more precisely to investigate the mechanisms of the treatment on lipid metabolism. For this purpose, wild-type mice were treated with EP 80317 (289 nmol/kg) subcutaneously for 14 days before being submitted to 30 minutes of ischemia following left anterior descending coronary artery ligature and reperfusion for a period of 6 or 48 hours. Heart and peripheral tissues (liver, skeletal muscle and adipose tissue) were harvested to determine the profile of selected genes involved in the regulation of lipid metabolism. Our work has shown that the cardioprotective effect of a pretreatment with EP 80317 is associated with a transient increase of triglycerides storage and reduced circulating NEFA.

L’infarctus du myocarde (IC) représente plus de 15 % de la mortalité mondiale liés aux maladies cardiovasculaires (MC). En absence d’une rapide reperfusion des coronaires occluses, aucune intervention thérapeutique n’est capable de limiter les effets délétères de l’IC. Un des moyens les plus efficaces de la cardioprotection, étudié en recherche, est le préconditionnement cardiaque ischémique (PCI). L’adénosine libérée au cours du PCI active via ces récepteurs P1 les voies de cardioprotection. Des études mettent en évidence également l’implication des purinorécepteurs P2Y dans la cardioprotection. Les récepteurs P2Y2, 4 et 6 sont les plus étudiés dans la cardioprotection. Les récepteurs P2Y sont sensibles aux nucléotides comme l’ATP et l’UTP libérés au cours de l’ischémie. Parmi les récepteurs P2Y seul le récepteur P2Y11 est doublement couplé à l’adénylate cyclase et à la phospholipase C (PLC). Il est également le seul récepteur dont le polymorphisme génétique, induisant une perte du signal métabotropique, prédispose à plus de risques d’IC et d’inflammation dans toutes les catégories d’âge indépendamment des facteurs de risques variables de l’IC (Amisten et al., 2007). Ceci suggère un important rôle du récepteur P2Y11 dans la prévention primaire et comme cible thérapeutique de l’infarctus du myocarde. Le β-NAD, nucléotide à base de pyridine, est libéré au cours de l’ischémie comme les médiateurs de cardioprotection notamment l’adénosine, l’ATP et l’UTP. Cependant, aucune étude ne s’est intéressée spécifiquement aux rôles du P2Y11 et des nucléotides pyridiniques, comme médiateurs, dans la cardioportection alors que le NAADP, un métabolite du β-NAD, est rapporté comme agoniste (Moreschi et al., 2008) du récepteur P2Y11. Dans ce travail, nous avons mis en évidence pour la première fois l’augmentation des concentrations interstitielles des métabolites du β-NAD comme le NAADP au cours de l’ischémie. L’augmentation des concentrations du NAADP décrit une cinétique comparable à celle de l’adénosine. Le NAADP extracellulaire ([NAADP]e), appliqué avant un cycle d’ischémie/reperfusion (I/R), déclenche une cardioprotection envers les effets délétères de l’I/R. En effet, le [NAADP]e améliore les fonctions contractiles, réduit les contractures, les arythmies de reperfusion et la taille de l’infarctus, dans un modèle d’I/R cardiaque chez le rat. Ce préconditionnement pharmacologique induit par le [NAADP]e implique les récepteurs P2Y11-like. Dans un modèle de cardiomyocytes, nous mettons en évidence l’activité métabotropique spécifique du récepteur P2Y11-like déclenché par le [NAADP]e. Le [NAADP]e déclenche via le récepteur P2Y11-like l’activation de la PKCε, ERK1/2, AKT et GSK-3β, des protéines kinases de prosurvie cellulaire, ce qui explique ses effets cardioprotecteurs. La phosphorylation des protéines de prosurvie cellulaire nécessite la médiation de la PKA, de la PLC et de la src. Le NF546, un nouvel agoniste sélectif du récepteur P2Y11, déclenche une activité métabotropique semblable à celle du [NAADP]e, confirmant ainsi l’existence fonctionnelle du récepteur P2Y11-like au niveau des cardiomyocytes de rat. L’activation du récepteur P2Y11-like, que ce soit par le [NAADP]e ou le NF546, induit une augmentation des concentrations intracellulaires du β-NAD et de ses métabolites, le NADP, le NAADP, le NAAD et l’ADP ribose cyclique. Le β-NAD, le NAADP comme le NAAD, ont été impliqués dans le déclenchement au niveau intracellulaire des voies de cardioprotection comme la voie des sirtuines et de l’autophagie. Ces mécanismes peuvent être complementaires de l’effet cardioprotecteur du [NAADP]e. L’ensemble de nos données conforte le rôle cardioprotecteur du récépteur P2Y11 et suggère que le NAADP interstitiel accumulé au cours de l’ischémie pourrait avoir un rôle de facteur paracrine de survie cellulaire améliorant la survie des cardiomyocytes au cours des évènements ischémiques. / Myocardial infarction (MI) accounts for more than 15 % of global deaths related to cardiovascular diseases (CD). In the absence of a prompt reperfusion of occluded coronary arteries, none of therapeutic interventions is able to limit the deleterious effects of MI. One of the most effective means of cardioprotection, studied in research, is the ischemic cardiac preconditioning (ICP). Adenosine released during ICP triggers, via P1 receptors, cardioprotective effects. Involvement of the purinoceptors (P2Y) in cardioprotective effects has been also reported. P2Y2,4,6 receptors, the most studied P2Y receptors in cardioprotection, are activated by the nucleotides released during ischemia such as ATP and UTP. Among the P2Y receptors, P2Y11 is dually coupled to Gs and Gq proteins and is the single P2Y receptor which has been linked, via a genetic polymorphism, to an increased risk of acute myocardial infarction and elevated levels of C-reactive protein in humans in all age groups (Amisten et al., 2007). This suggests for the P2Y11 receptor an important role in primary prevention and as a therapeutic target of the P2Y11 receptor for myocardial infarction. β-NAD, a pyridine nucleotide, is released during ischemia like adenosine, ATP and UTP. However, no study has focused on the roles of P2Y11 receptor and pyridine nucleotide in mediating cardioprotective effects while NAADP, a β-NAD metabolite, has been reported as an agonist (Moreschi et al., 2008) of the P2Y11 receptor. In this work, we show, for the first time, increased interstitial concentrations of NAADP during ischemia. Interstitial kinetics of NAADP is similar to adenosine. Using a pharmacological preconditioning protocol, triggered by extracellular NAADP ([NAADP]e) before a prolonged ischemia/reperfusion (I/R), rat hearts rapidly recovered post-ischemic contractile function and displayed attenuated contracture, infarct size and arrhythmogenesis. This pharmacological preconditioning involves the P2Y11-like receptor. In cardiomyocytes culture, [NAADP]e induces specific metabotropic response of the P2Y11-like receptor. [NAADP]e triggers via the P2Y11-like receptor prosurvival protein kinases activation such as PKCε, ERK1/2, AKT and GSK-3β which explains its protective effects. Phosphorylation of prosurvival protein kinases requires the mediation of PKA, PLC and src. As with [NAADP]e, the NF546, a new selective agonist of P2Y11 receptor, triggers a metabotropic activity, thus confirming the functional existence of P2Y11-like receptor in rat cardiomyocytes. Activation of the P2Y11-like receptor, either by [NAADP]e or NF546 induced an increase in intracellular concentrations of β-NAD and its metabolites, NADP, NAADP, NAAD and cyclic ADP ribose. More, β-NAD, NAADP as well as NAAD have been involved in activation of cardioprotective pathways such as sirtuine pathways and autophagy. Taken together, our data demonstrate for the first time that the P2Y11 receptor mediates cardioprotective effects induced by [NAADP]e. NAADP is released during ischemia suggesting that [NAADP]e may act as a paracrine survival factor, prolonging cardiomyocytes lifespan during ischemic events.

Implication du PTP dans la mort cellulaire β pancréatique L'hyperglycémie, l'hyperfructosémie et l'ischémie-reperfusion sont délétères pour la viabilité cellulaire β pancréatique, jouant un rôle majeur dans la perte de la masse cellulaire β. Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (PTP) est un canal mitochondrial impliqué dans le déclenchement de la mort cellulaire. Des données récentes montrent l'implication du PTP et du stress oxydant dans la toxicité induite par l'ischémie-reperfusion sur cardiomyocytes et également dans la glucotoxicité induite sur cellules endothéliales. La première partie de notre étude a visé à étudier l'implication de l'ouverture du PTP dans la mort cellulaire des cellules INS-1 et des îlots pancréatiques humains soumis à de fortes concentrations de glucose et de fructose. Nous démontrons que l'incubation des cellules INS-1 et des îlots pancréatiques humains en présence de 30 mM de glucose ou 2,5 mM de fructose déclenche une ouverture du PTP et induit la mort cellulaire. La metformine et la Cyclosporine A (CsA) préviennent l'ouverture du PTP et la mort cellulaire induite par le glucose et le fructose. La deuxième partie de notre travail montre que l'exposition des INS-1 à une heure de carence en substrat concomitante d'une hypoxie, suivie d'une restauration des conditions basales conduit à l'ouverture du PTP et à une majoration drastique de la mort cellulaire. Ces deux évènements sont totalement prévenus par l'incubation préalable par la CsA et la metformine mais aussi par la N-Acétyl-Cystéine (NAC) ou par l'exposition à une anoxie, soulignant ainsi le rôle fondamental du stress oxydant dans le déclenchement de l'ouverture du PTP et de la mort cellulaire. Nous montrons qu'au cours de l'ischémie-reperfusion simulée, la production de superoxide est bi-phasique : nous décrivons un premier pic de production au cours de la carence en substrat, lié à un flux reverse d'électrons au sein du complexe I de la chaîne respiratoire. Ce premier pic est suivi d'un deuxième pic de production après la restauration du niveau de substrats et d'O2, lié à l'ouverture du PTP. La NAC, l'anoxie ou la metformine préviennent les deux pics de production de superoxide tandis que la CsA prévient seulement le second pic. Enfin, nous montrons que l'hypoxie seule n'induit ni stress oxydant, ni ouverture du PTP ni mortalité cellulaire. L'ensemble de notre travail démontre le rôle central du PTP dans la gluco-fructotoxicité et dans la toxicité induite par l'ischémie-reperfusion sur la cellule β pancréatique. Ainsi, prévenir l'ouverture du PTP peut-être une approche intéressante pour préserver la viabilité cellulaire β. / PTP involvement in β pancreatic cell death Hyperglycemia, hyperfructosemia and ischemia-reperfusion play a major role in the progression of β cell loss in diabetes mellitus. The permeability transition pore (PTP) is a mitochondrial channel involved in cell death. PTP opening and oxidative stress have been shown to be involved in ischemia-reperfusion injury on cardiomyocytes and in hyperglycemia-induced cell death in endothelial cells. In the first part of this work, we have examined the involvement of PTP opening in INS-1 cells and human pancreatic islets cell death induced by high levels of glucose or fructose. We first reported that Metformin and Cyclosporin A (CsA) prevented Ca2+-induced PTP opening in permeabilized and intact INS-1 cells. We then shown that incubation of INS-1 cells and human islets in the presence of 30 mM glucose or 2.5 mM fructose induced PTP opening and led to cell death. Because both Metformin and CsA prevented glucose and fructose induced PTP opening, and hampered glucose and fructose induced cell death, we conclude that PTP opening is involved in high glucose and high fructose induced INS-1 and human islets cell death. We therefore suggest that preventing PTP opening might be a new approach to preserve β cell viability. In the second part of the work, we demonstrate that the incubation of INS-1 cells in the absence of energy substrates in hypoxic condition for 1 hour followed by incubation in normal condition led to PTP opening and to a dramatic increase in cell death. Both events were totally prevented when PTP opening was inhibited by either Cyclosporin A (CsA) or Metformin or when the cells were incubated in the presence of the antioxidant N-acetyl-cystein (NAC), in anoxia, highlighting the implication of oxidative stress is the commitment of PTP opening. Superoxide production increased during the removal of energy substrates, due to reverse electron flux through complex I and again increased when normal energy substrate and O2 were restored, due to PTP opening. NAC, anoxia or Metformin prevented the two phases of oxidative stress, while CsA prevented only the second one. Hypoxia alone did not induce oxidative stress, PTP opening or cell death. Our work demonstrates the implication of PTP opening in ischemia-reperfusion injury and gluco- fructotoxicty in β pancreatic cells. We therefore suggest that preventing PTP opening might be a new approach to preserve β cell viability.

Les complications cardiovasculaires au décours du syndrome métabolique ou le diabète, sont une conséquence directe de l'installation d'un stress oxydant, dont la progression est associée à une augmentation de la production de radicaux libres et des composés de dégradation des molécules biologiques, parallèlement à une diminution des défenses antioxydantes. Ces pathologies, enjeux important de santé publique, suscitent la recherche de méthodes de prévention ou de traitement. Dans ce contexte notre 1er objectif a été de développer deux modèles chez le rat, mimant les conditions du syndrome métabolique et du diabète, le premier par administration d'un régime ou d'une boisson riches en fructose, le deuxième étant induit par voie chimique. Notre 2ème objectif a été de préparer des extraits riches en phycocyanines d'un antioxydant naturel, la spiruline, et de les évaluer dans ces deux modèles expérimentaux. Les résultats ont montré l'effet bénéfique de la spiruline sur la diminution de la glycémie, l'amélioration de l'insulinémie et du profil lipidique, ainsi que sur le renforcement des défenses antioxydantes et l'amélioration de la récupération fonctionnelle du myocarde après ischémie/reperfusion. Notre 3ème objectif a été de d'évaluer la capacité antioxydante et cardioprotectrice de nouveaux dérivés polyphénoliques. Une trentaine de nouveaux flavonols ont été isolés au Laboratoire, les meilleurs résultats ont été obtenus avec ceux portant un groupement ionisable en C6, et des groupements méthoxy en C3' et C5', apportant une meilleure solubilité et une plus faible cytotoxicité. / Cardiovascular disorders related to metabolic syndrome or diabetes are a direct consequence of the installation of oxidative stress, which progress is associated with free radicals overproduction and increase of biomolecules degradation, in parallel with lowered antioxidant defenses. These pathologies represent a considerable public health problem, and research to improve prevention and treatment is strongly encouraged. In this context, our 1st objective was to develop two models in vivo, mimicking on rats metabolic syndrome and diabetes conditions, one by administration of a fructose-enriched diet or drink, the second being chemically induced. Our 2nd objective was to prepare phycocyanine-rich extracts of spirulina, a natural antioxidant, and to evaluate their properties on the two experimental animal models. Results showed the beneficial effect of spirulina on glycemia decrease, insulinemia improvement and lipid profile, accompanied by and increase of the antioxidant defenses and an improvement of myocardial functional recovery after ischaemia/reperfusion. Our 3rd objective was of to evaluate the antioxidant and cardioprotective capacities of new polyphenol derivatives. Around thirty new flavonols have been isolated in our Laboratory; best results were obtained with molecules bearing an ionizable group in C6 position, and methoxy groups in C3' and C5', leading to better solubility and lower cytotoxicity. Finally, the 4th objective was to quantify the therapeutic and cardioprotective potential of hybrid compounds, associating an antioxidant pattern with an antidiabetic molecule.

La progression de l'incidence de l'insuffisance rénale chronique dans le monde nécessite d'améliorer les mesures visant à ralentir sa progression et son évolution vers l'insuffisance rénale terminale. Le régime pauvre en protéines ou la prévention des épisodes d'ischémie- reperfusion appartiennent à ces mesures de néphroprotection mais leur bénéfice n'est qu'incomplètement compris. Le rein étant un des organes les plus vascularisé, rapporté à son poids, l'évaluation concomitante de la perfusion rénale ([15O]H2O), du métabolisme oxydatif ([11C]acetate) puis du contenu tissulaire en oxygène (BOLD-IRM) est fondamentale dans la mesure où ces trois mesures ne sont pas corrélées de manière linéaire. La TEP-IRM, appareil hybride combinant les fonctionnalités de la TEP et de l'IRM, permet une évaluation concomitante de ces trois paramètres de manière non invasive et sur rein isolé ce qui permet de l'utiliser en recherche clinique pour l'évaluation de l'effet de différentes interventions. Les régimes pauvres en protéines ont démontré qu'ils permettaient un ralentissement du déclin de la fonction rénale mais le mécanisme à l'origine de cet effet bénéfique n'est pas connu. Nous avons démontré que le contenu en AGE (Advanced Glycation End Products ou protéines modifiées) d'une charge protéique était responsable de la mobilisation de la réserve fonctionnelle rénale avec une augmentation de la perfusion et du métabolisme oxydatif plus importants après une charge protéique riche en AGE par rapport à une charge protéique pauvre en AGE. Nos résultats permettent de s'interroger sur l'intérêt d'une alimentation pauvre en AGE pour les insuffisants rénaux chroniques au-delà d'une restriction protéique pure. La prévention des épisodes d'ischémie- reperfusion est également particulièrement importante dans le cadre de la néphroprotection alors que la revascularisation d'une sténose de l'artère rénale s'accompagne obligatoirement de lésions de reperfusion. L'utilisation de la ciclosporine avant la dilatation d'une sténose de l'artère rénale dans le cadre d'un pré conditionnement a permis de réduire les lésions rénales chez la souris mais ce bénéfice clinique n'a pas été démontré chez l'homme. L'étude CICLOSAAR qui a pour but d'évaluer le bénéfice d'un pré conditionnement par la ciclosporine A avant dilatation d'une sténose de l'artère rénale sur des paramètres fonctionnels rénaux (perfusion, métabolisme oxydatif et contenu tissulaire en oxygène) est en cours. Dans un second temps et afin d'améliorer l'applicabilité clinique de ces techniques d'imagerie fonctionnelle, nous avons démontré que l'acétate, qui était jusque-là utilisé comme un marqueur de métabolisme oxydatif, pouvait également être utilisé comme un marqueur de perfusion rénale grâce à la modélisation de son uptake par le rein. Au total, la TEP- IRM est un outil fondamental pour l'évaluation des paramètres fonctionnels rénaux de manière non invasive chez l'humain. La mise en évidence de l'impact du contenu en AGE sur la perfusion et le métabolisme rénal devrait permettre d'affiner nos conseils diététiques aux insuffisants rénaux pour prévenir la progression de la maladie vers l'insuffisance rénale terminale. L'étude CicloSAAR actuellement en cours devrait permettre d'améliorer les mesures mises en oeuvre pour protéger le rein des lésions de reperfusion après dilatation d'une sténose de l'artère rénale. Enfin, nos résultats sur la forte corrélation entre les données de perfusion en acétate et en eau devraient permettre d'utiliser ce traceur pour obtenir la perfusion et le métabolisme oxydatif à l'issue d'une seule injection de radio-traceur et renforcer l'applicabilité clinique de ces techniques / The increase in the incidence of chronic renal failure worldwide requires improvements in measures to slow its progression to end-stage renal failure. The low-protein diet or the prevention of episodes of ischemia-reperfusion belong to these measures of nephroprotection but their benefit is only incompletely understood. The kidney is one of the most vascularized organs, compared to its weight, the concomitant evaluation of renal perfusion ([15O] H2O), oxidative metabolism ([11C] acetate) and tissue content in oxygen (BOLD-IRM) is fundamental in that these three measures are not linearly correlated. PETMRI, a hybrid device combining the functionalities of PET and MRI, allows a concomitant evaluation of these three parameters in a non-invasive and isolated kidney way which allows to use it in clinical research for the evaluation of the effect of different interventions. Low-protein diets have been shown to slow down the decline in renal function, but the mechanism behind this beneficial effect is not known. We have demonstrated that the AGE (Advanced Glycation End Products) content of a protein load is responsible for the mobilization of the renal functional reserve with an increase in perfusion and oxidative metabolism after a high- AGE high- protein compared to a low- AGE high- protein load. Our results make it possible to question the interest of a low-AGE diet for chronic renal insufficiency beyond a pure protein restriction. The prevention of episodes of ischemia reperfusion is also particularly important in the context of nephroprotection, whereas the revascularization of a stenosis of the renal artery is necessarily accompanied by reperfusion injury. Use of ciclosporin prior to dilation of renal artery stenosis in pre-conditioning reduced renal damage in mice, but this clinical benefit has not been demonstrated in humans. The CICLOSAAR study, which aims to evaluate the benefit of pre-conditioning with ciclosporin before dilation of renal artery stenosis with renal functional parameters (perfusion, oxidative metabolism and tissue oxygen content) is in progress. In a second step and to improve the clinical applicability of these functional imaging techniques, we have shown that acetate, which was previously used as a marker of oxidative metabolism, could also be used as a marker of renal perfusion through the modeling of its uptake by the kidney. In total, PET-MRI is a fundamental tool for the evaluation of renal functional parameters in a non-invasive way in humans. Demonstrating the impact of the AGE content of a protein load on perfusion and renal metabolism should help refine our dietary advice to patients with chronic kidney disease to prevent progression of the disease to end-stage renal failure. The current CicloSAAR study is expected to improve the measures implemented to protect the kidney from reperfusion injury after dilatation of renal artery stenosis. Finally, our results on the strong correlation between acetate and water perfusion data should allow this tracer to be used to obtain perfusion and oxidative metabolism after a single radio tracer injection and reinforce clinical applicability of these techniques