Glioblastomas são os tumores mais agressivos do Sistema Nervoso Central (SNC). Caracterizam-se por sua alta invasibilidade, proliferação, altos índices de recorrência e morte, assim como quimio e radiorresistência. Tumores sólidos apresentam uma organização hierárquica, em que há uma pequena população de células tronco tumorais (CSCs) ou células iniciadoras de tumor (CICs). Essas células são capazes de repopular o tumor, que leva à recorrência. CSCs caracterizam-se por realizar também a mitose assimétrica, na qual parte das células continuam como CSCs e a outra parte sofre diferenciação. Essas células diferenciadas são incapazes de repopular o tumor, uma vez que perderam a sua capacidade tronco. CSCs mostraram ser relativamente resistentes as terapias anticâncer tradicionais como quimio e/ou radioterapia. Doxorrubicina (Doxo) é um agente anticâncer usado em diversos tipos de tumor e atua formando adutos no DNA e também inibindo a ação da topoisomerase II. Dependendo da concentração utilizada de Doxo, diferentes efeitos são observados; por exemplo, baixas doses (100 nM) levam à senescência celular, enquanto que altas doses (10 μM) levam à apoptose. Temozolomida (Tmz) é um anti-tumoral utilizado na terapia de diversos tumores, inclusive gliomas. Resveratrol (Rsv) é um polifenol encontrado em diversas plantas, como a uva, e possui efeitos como: neuroproteção, antiinflamatório, anti-oxidante, proteção cardíaca, entre outros. Nosso objetivo foi avaliar a influência do efeito dessas três drogas nas CSCs derivadas de glioblastoma humano. Realizou-se o ensaio de formação de esferas, um indicador da presença de CSCs, citometria de fluxo para Oct4 e Nanog e ensaio de senescência. Nossos ensaios utilizaram a linhagem U87 e dois tipos diferentes de meio de cultura. O primeiro continha DMEM Low Glucose com SFB e o segundo, um meio de cultura para células tronco (SCM), contendo DMEM F12 suplementado com FGF (fator de crescimento fibroblástico), EGF (fator de crescimento epidermal), LIF (fator inibidor de leucemia) e B27. Os tratamentos realizados utilizaram Doxo 1 e 10 nM; Tmz 5 μM e Rsv 1, 10 e 30 μM. O número de esferas formadas foi reduzido tanto em Doxo 1 quanto em 10 nM quando SFB foi utilizado. Doxo 1 não alterou o número de células Oct4 e Nanog positivas enquanto que Doxo 10 nM reduziu. Ambas as doses induziram senescência. Tmz reduziu o número de esferas formadas e também a porcentagem de células Oct4 e Nanog positivas. Usando SCM, observamos que Doxo e Tmz reduziram o número de esferas e a porcentagem de células Nanog e Oct4 positivas. Rsv 10 μM reduziu o número de esferas formadas enquanto que Rsv 30 μM reduziu o número de células positivas para CD133 e Oct4 com meio com SFB. Nossos resultados sugerem que Doxo 10 nM possui um melhor efeito nas CSCs do que Doxo 1 nM. Doxo 10 nM, além de reduzir o número de esferas, reduziu a porcentagem dos marcadores de CSCs e também induziu senescência celular na presença de SFB. Tmz e Rsv apresentaram resultados semelhantes à Doxo 10 nM. / Glioblastomas are the most aggressive tumors of the central nervous system (CNS). They are characterized by their high invasiveness, proliferation, high rates of recurrence and death, as well as chemo and radioresistance. Solid tumors have a hierarchical organization, in which there is a small tumor stem cell population (CSCs) or tumor initiator cells (CICs). These cells are able to repopulate the tumor, which leads to recurrence. CSCs are characterized by also performing asymmetric mitosis, in which the cells remain as CSCs and the other part undergoes differentiation. These differentiated cells are unable to repopulate the tumor, since they have lost their stem cell capacity. CSCs showed to be relatively resistant to traditional anti-cancer therapies such as chemo and / or radiotherapy. Doxorubicin (Doxo) is an anticancer agent used in several tumor types and acts by forming DNA adducts as well as inhibiting the action of topoisomerase II. Depending on the concentration of Doxo used, different effects was observed, for example, low doses (100 nM) lead to cellular senescence, whereas high doses (10 μM) lead to apoptosis. Temozolomide (Tmz) is an anti-tumor therapy used in many tumors, including gliomas. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol found in various plants, such as grapes, and has effects such as neuroprotective, antiinflammatory, anti-oxidant, cardiac protection, among others. Our objective was to evaluate the effects of these three drugs on CSCs derived from human glioblastoma. We performed the sphere formation assay, an indicator of the presence of CSCs, flow cytometry for Oct4 and Nanog and senescence assay. Our experiments used the cell line U87 and two different types of culture medium. The first contained DMEM Low Glucose with FBS and the second, a culture medium for stem cells (SCM), containing DMEM F12 supplemented with FGF (fibroblastic growth factor), EGF (epidermal growth factor), LIF (leukemia inhibitor factor) and B27. The tests were performed using Doxo 1 and 10 nM, Tmz 5 μM and Rsv 10 and 30 μM. The number of spheres formed was reduced in both doses of Doxo when FBS was used. Doxo 1 nM did not alter the number of Oct4 and Nanog positive cells while Doxo 10 nM reduced. Both doses induced senescence. Tmz reduced the number of spheres formed and also the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Using SCM, we saw that Doxo and Tmz reduced the number of spheres and the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Rsv 10 μM reduced the number of spheres formed while Rsv 30 μM reduced the number of CD133 and Oct4 positive cells with medium supplemented with FBS. Our results suggest that Doxo 10 nM has a better effect in the CSCs than Doxo 1 nM. Doxo 10 nM besides reducing the number of spheres also decreased the percentage of CSCs markers, and induced cellular senescence in the presence of FBS. Tmz and Rsv had similar effects as Doxo 10 nM.

Os gliomas representam a maioria dos tumores do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma o mais maligno entre eles. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente e a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente um ano após o diagnóstico. A remoção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia é o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel mais importante, uma vez que possibilita a ativação de mecanismos endógenos antitumorais, como senescência celular. Este mecanismo possui potencial de induzir a perda irreversível da capacidade da divisão de células tumorais. O resveratrol e a quercetina, dois polifenóis naturais, induzem senescência em diferentes linhagens tumorais, incluindo os glioblastomas. Ambos têm efeitos pleiotrópicos e induzem a ativação de vários alvos moleculares, sendo SIRT1, um desses alvos. SIRT1 é uma histona desacetilase (HDAC) associada ao desenvolvimento de vários tipos de tumores. Por este motivo, foi avaliada a indução de senescência em células de glioblastomas pelo resveratrol e quercetina combinados com butirato de sódio, um inibidor de HDAC classe I e II. Os resultados mostram um efeito combinado do butirato de sódio e estes polifenóis para induzir a senescência nas linhagens celulares U87 e C6, mas não em astrócitos normais de ratos. Os co-tratamentos induzem perda de capacidade proliferativa e aumento do número de células positivas para β-galactosidase, um marcador de senescência. Estes resultados foram acompanhados de parada no ciclo celular na fase G2 na linhagem U87, mas nenhum efeito foi observado sobre o ciclo de células C6. A análise por Western Blot sugere o aumento do supressor tumoral p21 após co-tratamentos. Além disso, o co-tratamento com quercetina e butirato de sódio aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, mas não os níveis de gama-H2AX (um marcador de dano). Estes dados sugerem que o butirato de sódio em combinação com os polifenóis tem potencial terapêutico para a supressão de glioblastomas. Por outro lado, um dos problemas em biologia e medicina é entender como células pré-cancerosas e cancerosas entram em senescência ou conseguem evitá-la. A chave para a compreensão da indução da senescência e do seu bypass é a ativação da enzima telomerase (TERT), presente em 85 % dos tumores. Na segunda parte desta tese, ferramentas de biologia de sistemas foram utilizadas para projetar uma rede câncer e senescência humana com o objetivo de estudar a relação entre senescência e câncer (incluindo glioblastoma). Os resultados mostram uma interação direta entre TERT e oncogenes como MYC, E2F1, AKT1 e ABL1, que podem induzir a senescência. Além disso, uma associação metabólica forte entre estes oncogenes e sua capacidade de induzir senescência foi mostrada através de análise por ontologia gênica. Estes oncogenes também atuam como reguladores da transcrição e/ou pós-transcrição da subunidade catalítica de TERT. Resultados obtidos a partir da análise de centralidade da rede juntamente com dados de microarranjos derivados de tumores foram utilizados para conceber um modelo dinâmico da regulação de TERT em câncer. Com base nestes resultados, foi gerado um modelo hipotético no qual a expressão de TERT pode ser transitória ou induzida por espécies reativas de oxigênio, aumentando a sobrevivência de diferentes tipos de tumores, como o glioblastoma. Este estudo fornece novas evidências para a relação entre senescência e câncer. Além disso, esta hipótese, se verificada experimentalmente, pode permitir a formulação de novas abordagens quimioterapêuticas para o tratamento de gliobastomas. / Gliomas are the majority of central nervous system tumours, being glioblastoma the most malign among them. The treatment for these tumors is still inefficient and survival average of patients is approximately one year after diagnosis. Surgical removal, if possible, followed by radiotherapy and chemotherapy is the standard treatment. The trend is that chemotherapy assumes a greater role, since it allows the activation of antitumour mechanisms, such as cellular senescence. This mechanism has potential to induce irreversible loss of division ability in tumor cells. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, are able to induce senescence in different cancer models, including glioblastoma. Resveratrol and quercetine are molecules with pleiotropic effects and leads to SIRT1 activation. SIRT1 is a histone deacetylase (HDAC) which has been linked positively to cancer development. Therefore, we analyzed the ability of sodium butyrate, a HDAC class I and II inhibitor combined with resveratrol or quercetin to induce senescence in glioblastoma cell lines. Results show a combined effect of sodium butyrate and these polyphenols to induce senescence in U87 and C6 cell lines, but not in normal rat astrocytes. Co-treatments induce a loss of proliferative capacity and increase the number of positive cells for β-galactosidase, a senescence marker. These results were accompanied with cell cycle arrest in G2 checkpoint in U87, but no effect on cell cycle phase‟s distribution in C6 was observed. Western blott analysis suggests that these arrests are result of tumour suppressor p21 increase. Moreover, co-treatments increased reactive oxygen species, but not gamma-H2AX levels (a damage marker). The data underline that tumor cells can be driven towards cellular senescence by sodium butyrate combined with polyphenols, which may further arise as a possibility for tumor suppression. On the other hand, one of the challenging problems in biology and medicine is to understand how pre-cancerous or cancer cells enter in senescence or can avoid it. The key to understanding senescence induction and its bypass is the telomerase (TERT), which is present in 85 % of tumors. In a second part of this thesis, system biology tools were used to design a human cancer-senescence network with the aim to study the relationship between senescence and cancer (included glioblastoma). The results show a direct interaction between TERT and oncogenes such as MYC, E2F1, AKT1 and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Results obtained from centrality analysis and microarray data derived from tumors were used to design a dynamic model for TERT regulation in cancer. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches to glioblastoma treatment. and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches.

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Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9730_Dissertacao Estevão Barcelos. pdf.pdf: 1406331 bytes, checksum: 7e6b1b06aa09689055107d02d115cdf7 (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania, e encontram-se distribuídas por 98 paises incluindo o Brasil, que possui uma grande importância epidemiológia e clínica, considerando o número de casos registrados. Embora os atuais tratamentos disponíveis sejam eficazes, importantes considerações acerca da toxicidade e alto custo têm sido levantados pela OMS, o que torna urgente a busca por novas drogas. O Resveratrol, um polifenol encontrado em diversas plantas, dentre elas uva, amendoim e eucalipto, tem sido amplamente pesquisado nas últimas décadas. Suas características farmacológicas e ações biológicas incluem: capacidade antiinflamatória; antitumoral; antioxidante; antiagregação plaquetária; fungicida; antiviral e antibacteriana. Além disso, o resveratrol já demonstrou ação anti-promastigotas e anti-amastigotas de Leishmania in vitro. O presente estudo objetivou avaliar os efeitos do tratamento oral com resveratrol contra a leishmaniose visceral murina. Camundongos BALB/c infectados com L. infantum chagasi foram tratados resveratrol (50mg/kg/dia) por via oral durante 10 dias. O tratamento com resveratrol não induziu toxicidez sistêmica, demonstrado pelas dosagens de transaminases (TGO, TGP) e creatinina. Além disso, o tratamento com resveratrol foi capaz de induzir redução no parasitismo do baço e fígado, quando comparado ao grupo não tratado, e compatíveis ao aumento do infiltrado linfocitário observado no fígado destes animais. A avaliação de citocinas mostrou redução significativa da produção de IL-4, IL-6 e IL-17, bem como o aumento de TNF-α e TGF-β no sobrenadante do fígado. Significante redução da produção de TNF-α e IL-10 foi observada nos sobrenadantes de macerado do baço de animais tratados com resveratrol. Este mesmo grupo apresentou uma significativa redução da apoptose de esplenócitos quando comparado com os controles experimentais. Juntos, nossos dados demonstraram pela primeira vez viabilidade da utilização do resveratrol como uma eficiente e segura droga anti-Leishmania, o que o torna um promissor candidato a utilização contra as leishmanioses humanas.

Submitted by FERNANDA PATRICIA GULLO null (nanda_gullo@hotmail.com) on 2016-03-28T14:18:25Z No. of bitstreams: 1 Tese_Fernanda P. Gullo.pdf: 7327179 bytes, checksum: 0393cbeb07198f30f49ab07572fbb16f (MD5) / Rejected by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 12 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 12 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. 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Gullo.pdf: 7327179 bytes, checksum: 0393cbeb07198f30f49ab07572fbb16f (MD5) / Rejected by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 12 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 12 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. 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No. of bitstreams: 1 gullo_fp_dr_arafc.pdf: 7327179 bytes, checksum: 0393cbeb07198f30f49ab07572fbb16f (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) / Criptococose é uma importante micose sistêmica que acomete principalmente pacientes imunocomprometidos e é classificada como a infecção fúngica com maior mortalidade entre indivíduos portadores de HIV. Cryptococcus neoformans é uma levedura capsulada e o principal agente etiológico da criptococose; encontra-se dispersa no meio ambiente na forma de basidiósporos, os quais são responsáveis pela infecção em humanos e animais. As principais manifestações clínicas estão associadas à infecção pulmonar e meningite. A terapia se dá basicamente com a administração de anfotericina B (AMB) na terapia de ataque associada ou não a 5-fluocitosina e como manutenção é indicado ao longo do tratamento o fluconazol (FCZ). Apesar de esta terapêutica ser eficiente, é constatado elevado número de casos de reincidência e desenvolvimento de resistência aos azóis, além de problemas de toxicidade. Diante desta problemática, este estudo propõe o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para o tratamento da criptococose, visando duas abordagens distintas. A primeira, aplicando novo composto antifúngico e a segunda, o estudo de microRNAs (miRNAs) envolvidos na interação da levedura e células de glioblastoma humano (U87-MG), com a finalidade de usá-los como reguladores da infecção, sendo esta uma estratégia recentemente divulgada em uma variedade de doenças. Para tanto, inicialmente moléculas análogas de resveratrol foram avaliadas quanto a atividade antifúngica e o derivado orto,orto-HDZ (HDZ) mostrou forte atividade fungicida contra isolados de C. neoformans, com valores de concentração fungicida mínima (CFM) variando entre 0,97 a 7,81 µg/mL. A associação entre HDZ e FCZ mostrou sinergia com potencialização do efeito do FCZ em até 64 vezes para um isolado clínico resistente. Baixa toxicidade foi observada em ensaios in vitro e in vivo (Galleria mellonella e camundongos), apesar de mostrar alterações em embriões de Zebrafish. Além disso, este estudo mostrou a capacidade da associação HDZ + FCZ em inibir a interação da levedura e células hospedeiras (pneumócitos, macrófagos e glioblastoma) por citometria de fluxo e imunofluorescência. Ensaios in vivo (modelo murino) da atividade antifúngica de HDZ em combinação com FCZ mostrou que após 15 dias de tratamento houve redução significativa das unidades formadoras de colônias (UFC) no fígado, baço, cérebro, pulmões e lavado broncoalveolar, assim como o aumento da sobrevida dos animais em 198 dias e redução da morbidade, a qual foi avaliada por ensaio de comportamento (SHIRPA). Diante da segunda proposta deste trabalho, foram encontrados 10 miRNAs super-expressos na interação de C. neoformans e células U87-MG e foi observado que os miRNAs regulam principalmente vias de sinalização TGF-β, MAP quinase (MAPK) e interação receptor e matriz extracelular (MEC). Tais dados foram cruzados com transcritos que mostraram diferencialmente expressos na interação fungo-célula e as proteínas GTPase-3 e COP-1 foram selecionadas como importantes nesse processo. Tais proteínas estão associadas à via Rho-GTPase a qual é primordial para a ligação da levedura em células hospedeiras e mostrou aumento da expressão na infecção, assim como ligeira redução após o tratamento com HDZ. A indução da apoptose de células de glioblastoma por C. neoformans, foi observada através da técnica TUNEL e da expressão da proteína pró-apoptótica Bak e o tratamento com HDZ foi capaz de reverter esse processo. Nossos resultados indicam HDZ como uma interessante molécula para avançar nos estudos de desenvolvimento de um protótipo antifúngico contra C. neoformans e a inibição da expressão dos miRNAs durante a interação fungo-célula, pode ser interessante para controle da infecção fúngica, pois acreditamos que uma vez inibidos, podem reduzir a invasão da levedura em células hospedeiras, sendo então os miRNAs interessantes novos alvos terapêuticos e que o tratamento com HDZ são promissores para o desenvolvimento de um novo antifúngico. / Cryptococcosis is an important systemic mycosis that mainly affects immunocompromised patients and is classified as the fungal infection with higher mortality among individuals with HIV. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast and the main etiologic agent of cryptococcosis. This yeast is dispersed into the environment in the form of basidiospores, which are responsible for infection in humans and animals. The main clinical manifestations are associated with pulmonary infection and meningitis. The treatment is basically the administration of amphotericin B (AMB) as therapy consolidation with or without the use of 5-flucytosine and, for the maintenance therapy, fluconazole (FCZ) is indicated. Although this therapy is effective, it is observed high number of cases of relapses, development of resistance to azoles and toxicity problems. In front of these problems, this study proposes the development of new therapies for the treatment of cryptococcosis, targeting two distinct approaches. The first aims a new antifungal compound and the second the study microRNAs (miRNAs) involved in the interaction between yeast and human glioblastoma cells (U87-MG), in order to use them as regulators of infection, since this is a recently disclosed strategy in a variety of diseases. For this purpose, initially, analogs of resveratrol molecule were evaluated for antifungal activity and the derived ortho,ortho-HDZ (HDZ) showed a strong fungicidal activity against isolates of C. neoformans with values of minimum fungicidal concentration (MFC) ranging between 0.97 to 7.81 µg/mL. The association between HDZ and FCZ showed synergy with potentiation of the effect of FCZ in up to 64 times for a resistant clinical isolate to FCZ. Low toxicity was observed in in vitro and in vivo assays (Galleria mellonella and mice), despite showing changes in Zebrafish embryos. In vivo assay (murine model) of the antifungal activity of HDZ in combination with FCZ showed that after 15 days of treatment, a significant reduction in colony forming units (CFU) in the liver, spleen, brain, lungs and bronchoalveolar lavage was observed, as well as, increased survival of the animals in 198 days with the reduction of the morbidity, which was evaluated by behavioral assay (SHIRPA). Considering the second purpose of this study, 10 miRNAs were over-expressed during the interaction of C. neoformans and U87-MG cells and it was noted that these miRNAs regulate the signaling pathway of TGF-β, MAP kinase (MAPK) and the receptor and matrix extracellular components (MEC) interaction. These data was cross with transcripts that showed differentially expressed in fungus-cell interaction and the GTPase-3 and COP-1 protein were selected as important in this process. Such proteins are associated to Rho-GT pathway Rho-GTPase which is essential for the yeast adhesion into host cells and showed increased expression in infection, as well as a slight reduction after treatment with HDZ. Induction of apoptosis in glioblastoma cells by C. neoformans was observed by TUNEL technique and the expression of pro-apoptotic protein Bak and treatment with HDZ was able to reverse this process. Our results indicate HDZ as an interesting molecule to advance the development of studies of a prototype antifungal against C. neoformans and that the inhibition of expression of miRNAs during fungus-cell interaction, may be interesting to control fungal infection, because we believe that once inhibited, the yeast can reduce invasion of host cells, being the miRNAs interesting new therapeutic targets and the treatment with HDZ is promising for the development of a new antifungal drug. / CNPq: 403586/2012-7 / FCT: 345/13

A criopreservação de sêmen humano é de grande importância para a medicina reprodutiva, porém esse processo pode causar danos ao espermatozóide devido, entre outros aspectos, à produção de espécies reativas de oxigênio, as quais podem lesar as biomoléculas. Tanto o resveratrol quanto o ácido ascórbico são compostos com reconhecida capacidade antioxidante, porém ainda pouco estudados em relação à prevenção de criodanos em espermatozóides humanos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi analisar marcadores de danos oxidativos e parâmetros seminais antes e após a criopreservação de sêmen humano em presença e ausência de resveratrol e ácido ascórbico. Foram analisadas amostras de sêmen de 20 homens inférteis e 10 doadores com fertilidade comprovada. Indivíduos com azoospermia(ausência de espermatozoides), leucocitospermia (aumento da contagem de leucócitos seminais) ou sob uso de suplementação antioxidante foram excluídos do estudo. Os marcadores de estresse oxidativo incluíram a avaliação dos produtos reativos ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a atividade das enzimas superóxido dismutase (Sod) e catalase (Cat). Os danos ao DNA foram quantificados pelo ensaio Cometa. Após a análise seminal padrão as amostras foram divididas em alíquotas, quais sejam: sem a adição de antioxidantes (controle), com 0,1 mM, 1,0 mM, e 10,0 mM de resveratrol e 10,0 mM de ácido ascórbico. Após uma hora de incubação as alíquotas foram criopreservadas em nitrogênio líquido a - 196°C, empregando-se o TEST-Yolk buffer como agente crioprotetor. Paralelamente, foram avaliados, ainda, os parâmetros séricos para TBARS, Sod, Cat e níveis de ácido úrico em homens inférteis e férteis. Os resultados mostraram que o uso de ácido ascórbico e resveratrol não causou nenhuma alteração na concentração e morfologia dos espermatozóides, porém nenhum dos antioxidantes foi capaz de prevenir a diminuição da motilidade induzida pelo processo de criopreservação. A criopreservação induziu uma diminuição na atividade da Sod em indivíduos inférteis e um aumento nos níveis de TBARS nas amostras de homens férteis e inférteis. Observou-se uma correlação negativa entre motilidade espermática e os valores de TBARS em homens inférteis, tanto em amostras pré-congelamento (-0,868, p<0,05) quanto em amostras pós-congelamento (-0,897, p<0,05). A adição de resveratrol às amostras, previamente ao processo de criopreservação, preveniu a diminuição da atividade da Sod em indivíduos inférteis e diminuiu os níveis de TBARS tanto em homens férteis como em inférteis. O ácido ascórbico foi capaz de minimizar os danos oxidativos a lipídios causados pela criopreservação, porém somente em sêmen de homens inférteis. Observou-se ainda que a criopreservação induziu um significativo aumento de danos ao DNA (principalmente dos tipos 2, 3 e 4) em homens férteis e inférteis. A adição de ácido ascórbico ao espermatozóide reduziu os danos ao DNA em homens inférteis, mas não em homens férteis. Por outro lado, o resveratrol foi capaz de reduzir os danos ao DNA tanto em homens férteis como em inférteis. Salienta-se, ainda, que o uso de 10,0mM de resveratrol foi capaz de evitar todos os danos ao DNA induzidos pela criopreservação em homens inférteis. Observou-se, também, que os indivíduos inférteis apresentaram níveis séricos mais elevados de TBARS, ácido úrico e atividade de Sod. Embora outros estudos sejam necessários, os dados apresentados neste trabalho indicam a possibilidade da utilização do resveratrol e ácido ascórbico em procedimentos de criopreservação de sêmen humano, principalmente naqueles onde a motilidade não seja essencial para ocorrer a fecundação como, por exemplo, a ICSI (injeção intracitoplasmática de espermatozóide). / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-17T12:17:41Z No. of bitstreams: 1 Tese Márcia Esteves Silva Garcez.pdf: 2973862 bytes, checksum: e8fd732e0138084fef17eacaadbb9e22 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-17T12:17:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Márcia Esteves Silva Garcez.pdf: 2973862 bytes, checksum: e8fd732e0138084fef17eacaadbb9e22 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cryopreservation of human semen is very important in reproductive medicine, but it may cause damages to the spermatozoa, probably due to the production of reactive oxygen species (ROS), which may cause structural damage to the biomolecules. Resveratrol and ascorbic acid are important antioxidants, however, until now, there are only few studies about its use in cryopreservation process. Therefore, the aim of this study was to analyze the oxidative stress markers and seminal standard parameters before and after the cryopreservation of human semen with and without these antioxidants. Ejaculated semen from 20 infertile men and 10 fertile donors, with proven fertility, were examined. Individuals with azoospermia, leukocytospermia or under antioxidant supplementation were excluded from the study. Oxidative stress markers including the determination of the levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS) and the activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (Sod) and catalase (Cat). DNA damages were quantified by comet assay. After the evaluation of standard seminal assays, semen samples were divided into 5 aliquots, which were treated as follows: (a) without antioxidants; (b) with 0.1 mM of resveratrol; (c) with 1.0 mM of resveratrol; (d) with 10.0 mM of resveratrol and (e) with 10.0 mM of ascorbic acid. Samples were incubated for 1 hour and, then, they were cryopreserved in liquid nitrogen at -196°C. The TEST-Yolk buffer was used as cryoprotector agent in all the samples. Besides, it was evaluated, also, the seric values of TBARS, Sod, Cat and uric acid both in infertile and fertile men. The results showed that the use of ascorbic acid or resveratrol did not change the concentration and morphology of the spermatozoids. However, none of the antioxidants were able to prevent the decrease in the mobility induced by the cryopreservation process. Cryopreservation causes a decrease in Sod activity in infertile men and an increase of TBARS levels, both in infertile and fertile men. It was observed a negative correlation between spermatozoa motility and TBARS levels in infertile men, both before (-0, 868, p<0,05) and after (-0, 897, p<0,05) the cryopreservation process. Resveratrol was able to avoid the decrease in Sod activity in infertile men and the increase in TBARS levels both in infertile and fertile men samples. Ascorbic acid was able to reduce the oxidative lipid damages induced by cryopreservation only in infertile men. It was also observed that the cryopreservation process induced a significant increase of DNA damages (mainly types 2, 3 and 4) in infertile and fertile men. The addition of ascorbic acid reduces DNA damages only in infertile men. On the other hand, resveratrol was capable to reduce DNA damages both in infertile and fertile men. In fact, the use of 10.0mM of resveratrol was able to avoid all the DNA damages induced by the cryopreservation in infertile men. Infertile men showed high seric levels of TBARS, uric acid and Sod activity than the fertile men. Although other studies are necessary, the data presented in this work suggests the possibility to use resveratrol and ascorbic acid in human cryopreservation procedures, both for fertile and infertile men, at least, for ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection), as it does not need motile sperm for achieving pregnancy.

Glioblastomas são os tumores mais agressivos do Sistema Nervoso Central (SNC). Caracterizam-se por sua alta invasibilidade, proliferação, altos índices de recorrência e morte, assim como quimio e radiorresistência. Tumores sólidos apresentam uma organização hierárquica, em que há uma pequena população de células tronco tumorais (CSCs) ou células iniciadoras de tumor (CICs). Essas células são capazes de repopular o tumor, que leva à recorrência. CSCs caracterizam-se por realizar também a mitose assimétrica, na qual parte das células continuam como CSCs e a outra parte sofre diferenciação. Essas células diferenciadas são incapazes de repopular o tumor, uma vez que perderam a sua capacidade tronco. CSCs mostraram ser relativamente resistentes as terapias anticâncer tradicionais como quimio e/ou radioterapia. Doxorrubicina (Doxo) é um agente anticâncer usado em diversos tipos de tumor e atua formando adutos no DNA e também inibindo a ação da topoisomerase II. Dependendo da concentração utilizada de Doxo, diferentes efeitos são observados; por exemplo, baixas doses (100 nM) levam à senescência celular, enquanto que altas doses (10 μM) levam à apoptose. Temozolomida (Tmz) é um anti-tumoral utilizado na terapia de diversos tumores, inclusive gliomas. Resveratrol (Rsv) é um polifenol encontrado em diversas plantas, como a uva, e possui efeitos como: neuroproteção, antiinflamatório, anti-oxidante, proteção cardíaca, entre outros. Nosso objetivo foi avaliar a influência do efeito dessas três drogas nas CSCs derivadas de glioblastoma humano. Realizou-se o ensaio de formação de esferas, um indicador da presença de CSCs, citometria de fluxo para Oct4 e Nanog e ensaio de senescência. Nossos ensaios utilizaram a linhagem U87 e dois tipos diferentes de meio de cultura. O primeiro continha DMEM Low Glucose com SFB e o segundo, um meio de cultura para células tronco (SCM), contendo DMEM F12 suplementado com FGF (fator de crescimento fibroblástico), EGF (fator de crescimento epidermal), LIF (fator inibidor de leucemia) e B27. Os tratamentos realizados utilizaram Doxo 1 e 10 nM; Tmz 5 μM e Rsv 1, 10 e 30 μM. O número de esferas formadas foi reduzido tanto em Doxo 1 quanto em 10 nM quando SFB foi utilizado. Doxo 1 não alterou o número de células Oct4 e Nanog positivas enquanto que Doxo 10 nM reduziu. Ambas as doses induziram senescência. Tmz reduziu o número de esferas formadas e também a porcentagem de células Oct4 e Nanog positivas. Usando SCM, observamos que Doxo e Tmz reduziram o número de esferas e a porcentagem de células Nanog e Oct4 positivas. Rsv 10 μM reduziu o número de esferas formadas enquanto que Rsv 30 μM reduziu o número de células positivas para CD133 e Oct4 com meio com SFB. Nossos resultados sugerem que Doxo 10 nM possui um melhor efeito nas CSCs do que Doxo 1 nM. Doxo 10 nM, além de reduzir o número de esferas, reduziu a porcentagem dos marcadores de CSCs e também induziu senescência celular na presença de SFB. Tmz e Rsv apresentaram resultados semelhantes à Doxo 10 nM. / Glioblastomas are the most aggressive tumors of the central nervous system (CNS). They are characterized by their high invasiveness, proliferation, high rates of recurrence and death, as well as chemo and radioresistance. Solid tumors have a hierarchical organization, in which there is a small tumor stem cell population (CSCs) or tumor initiator cells (CICs). These cells are able to repopulate the tumor, which leads to recurrence. CSCs are characterized by also performing asymmetric mitosis, in which the cells remain as CSCs and the other part undergoes differentiation. These differentiated cells are unable to repopulate the tumor, since they have lost their stem cell capacity. CSCs showed to be relatively resistant to traditional anti-cancer therapies such as chemo and / or radiotherapy. Doxorubicin (Doxo) is an anticancer agent used in several tumor types and acts by forming DNA adducts as well as inhibiting the action of topoisomerase II. Depending on the concentration of Doxo used, different effects was observed, for example, low doses (100 nM) lead to cellular senescence, whereas high doses (10 μM) lead to apoptosis. Temozolomide (Tmz) is an anti-tumor therapy used in many tumors, including gliomas. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol found in various plants, such as grapes, and has effects such as neuroprotective, antiinflammatory, anti-oxidant, cardiac protection, among others. Our objective was to evaluate the effects of these three drugs on CSCs derived from human glioblastoma. We performed the sphere formation assay, an indicator of the presence of CSCs, flow cytometry for Oct4 and Nanog and senescence assay. Our experiments used the cell line U87 and two different types of culture medium. The first contained DMEM Low Glucose with FBS and the second, a culture medium for stem cells (SCM), containing DMEM F12 supplemented with FGF (fibroblastic growth factor), EGF (epidermal growth factor), LIF (leukemia inhibitor factor) and B27. The tests were performed using Doxo 1 and 10 nM, Tmz 5 μM and Rsv 10 and 30 μM. The number of spheres formed was reduced in both doses of Doxo when FBS was used. Doxo 1 nM did not alter the number of Oct4 and Nanog positive cells while Doxo 10 nM reduced. Both doses induced senescence. Tmz reduced the number of spheres formed and also the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Using SCM, we saw that Doxo and Tmz reduced the number of spheres and the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Rsv 10 μM reduced the number of spheres formed while Rsv 30 μM reduced the number of CD133 and Oct4 positive cells with medium supplemented with FBS. Our results suggest that Doxo 10 nM has a better effect in the CSCs than Doxo 1 nM. Doxo 10 nM besides reducing the number of spheres also decreased the percentage of CSCs markers, and induced cellular senescence in the presence of FBS. Tmz and Rsv had similar effects as Doxo 10 nM.

Os gliomas representam a maioria dos tumores do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma o mais maligno entre eles. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente e a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente um ano após o diagnóstico. A remoção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia é o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel mais importante, uma vez que possibilita a ativação de mecanismos endógenos antitumorais, como senescência celular. Este mecanismo possui potencial de induzir a perda irreversível da capacidade da divisão de células tumorais. O resveratrol e a quercetina, dois polifenóis naturais, induzem senescência em diferentes linhagens tumorais, incluindo os glioblastomas. Ambos têm efeitos pleiotrópicos e induzem a ativação de vários alvos moleculares, sendo SIRT1, um desses alvos. SIRT1 é uma histona desacetilase (HDAC) associada ao desenvolvimento de vários tipos de tumores. Por este motivo, foi avaliada a indução de senescência em células de glioblastomas pelo resveratrol e quercetina combinados com butirato de sódio, um inibidor de HDAC classe I e II. Os resultados mostram um efeito combinado do butirato de sódio e estes polifenóis para induzir a senescência nas linhagens celulares U87 e C6, mas não em astrócitos normais de ratos. Os co-tratamentos induzem perda de capacidade proliferativa e aumento do número de células positivas para β-galactosidase, um marcador de senescência. Estes resultados foram acompanhados de parada no ciclo celular na fase G2 na linhagem U87, mas nenhum efeito foi observado sobre o ciclo de células C6. A análise por Western Blot sugere o aumento do supressor tumoral p21 após co-tratamentos. Além disso, o co-tratamento com quercetina e butirato de sódio aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, mas não os níveis de gama-H2AX (um marcador de dano). Estes dados sugerem que o butirato de sódio em combinação com os polifenóis tem potencial terapêutico para a supressão de glioblastomas. Por outro lado, um dos problemas em biologia e medicina é entender como células pré-cancerosas e cancerosas entram em senescência ou conseguem evitá-la. A chave para a compreensão da indução da senescência e do seu bypass é a ativação da enzima telomerase (TERT), presente em 85 % dos tumores. Na segunda parte desta tese, ferramentas de biologia de sistemas foram utilizadas para projetar uma rede câncer e senescência humana com o objetivo de estudar a relação entre senescência e câncer (incluindo glioblastoma). Os resultados mostram uma interação direta entre TERT e oncogenes como MYC, E2F1, AKT1 e ABL1, que podem induzir a senescência. Além disso, uma associação metabólica forte entre estes oncogenes e sua capacidade de induzir senescência foi mostrada através de análise por ontologia gênica. Estes oncogenes também atuam como reguladores da transcrição e/ou pós-transcrição da subunidade catalítica de TERT. Resultados obtidos a partir da análise de centralidade da rede juntamente com dados de microarranjos derivados de tumores foram utilizados para conceber um modelo dinâmico da regulação de TERT em câncer. Com base nestes resultados, foi gerado um modelo hipotético no qual a expressão de TERT pode ser transitória ou induzida por espécies reativas de oxigênio, aumentando a sobrevivência de diferentes tipos de tumores, como o glioblastoma. Este estudo fornece novas evidências para a relação entre senescência e câncer. Além disso, esta hipótese, se verificada experimentalmente, pode permitir a formulação de novas abordagens quimioterapêuticas para o tratamento de gliobastomas. / Gliomas are the majority of central nervous system tumours, being glioblastoma the most malign among them. The treatment for these tumors is still inefficient and survival average of patients is approximately one year after diagnosis. Surgical removal, if possible, followed by radiotherapy and chemotherapy is the standard treatment. The trend is that chemotherapy assumes a greater role, since it allows the activation of antitumour mechanisms, such as cellular senescence. This mechanism has potential to induce irreversible loss of division ability in tumor cells. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, are able to induce senescence in different cancer models, including glioblastoma. Resveratrol and quercetine are molecules with pleiotropic effects and leads to SIRT1 activation. SIRT1 is a histone deacetylase (HDAC) which has been linked positively to cancer development. Therefore, we analyzed the ability of sodium butyrate, a HDAC class I and II inhibitor combined with resveratrol or quercetin to induce senescence in glioblastoma cell lines. Results show a combined effect of sodium butyrate and these polyphenols to induce senescence in U87 and C6 cell lines, but not in normal rat astrocytes. Co-treatments induce a loss of proliferative capacity and increase the number of positive cells for β-galactosidase, a senescence marker. These results were accompanied with cell cycle arrest in G2 checkpoint in U87, but no effect on cell cycle phase‟s distribution in C6 was observed. Western blott analysis suggests that these arrests are result of tumour suppressor p21 increase. Moreover, co-treatments increased reactive oxygen species, but not gamma-H2AX levels (a damage marker). The data underline that tumor cells can be driven towards cellular senescence by sodium butyrate combined with polyphenols, which may further arise as a possibility for tumor suppression. On the other hand, one of the challenging problems in biology and medicine is to understand how pre-cancerous or cancer cells enter in senescence or can avoid it. The key to understanding senescence induction and its bypass is the telomerase (TERT), which is present in 85 % of tumors. In a second part of this thesis, system biology tools were used to design a human cancer-senescence network with the aim to study the relationship between senescence and cancer (included glioblastoma). The results show a direct interaction between TERT and oncogenes such as MYC, E2F1, AKT1 and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Results obtained from centrality analysis and microarray data derived from tumors were used to design a dynamic model for TERT regulation in cancer. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches to glioblastoma treatment. and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches.

Os gliomas representam a maioria dos tumores do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma o mais maligno entre eles. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente e a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente um ano após o diagnóstico. A remoção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia é o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel mais importante, uma vez que possibilita a ativação de mecanismos endógenos antitumorais, como senescência celular. Este mecanismo possui potencial de induzir a perda irreversível da capacidade da divisão de células tumorais. O resveratrol e a quercetina, dois polifenóis naturais, induzem senescência em diferentes linhagens tumorais, incluindo os glioblastomas. Ambos têm efeitos pleiotrópicos e induzem a ativação de vários alvos moleculares, sendo SIRT1, um desses alvos. SIRT1 é uma histona desacetilase (HDAC) associada ao desenvolvimento de vários tipos de tumores. Por este motivo, foi avaliada a indução de senescência em células de glioblastomas pelo resveratrol e quercetina combinados com butirato de sódio, um inibidor de HDAC classe I e II. Os resultados mostram um efeito combinado do butirato de sódio e estes polifenóis para induzir a senescência nas linhagens celulares U87 e C6, mas não em astrócitos normais de ratos. Os co-tratamentos induzem perda de capacidade proliferativa e aumento do número de células positivas para β-galactosidase, um marcador de senescência. Estes resultados foram acompanhados de parada no ciclo celular na fase G2 na linhagem U87, mas nenhum efeito foi observado sobre o ciclo de células C6. A análise por Western Blot sugere o aumento do supressor tumoral p21 após co-tratamentos. Além disso, o co-tratamento com quercetina e butirato de sódio aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, mas não os níveis de gama-H2AX (um marcador de dano). Estes dados sugerem que o butirato de sódio em combinação com os polifenóis tem potencial terapêutico para a supressão de glioblastomas. Por outro lado, um dos problemas em biologia e medicina é entender como células pré-cancerosas e cancerosas entram em senescência ou conseguem evitá-la. A chave para a compreensão da indução da senescência e do seu bypass é a ativação da enzima telomerase (TERT), presente em 85 % dos tumores. Na segunda parte desta tese, ferramentas de biologia de sistemas foram utilizadas para projetar uma rede câncer e senescência humana com o objetivo de estudar a relação entre senescência e câncer (incluindo glioblastoma). Os resultados mostram uma interação direta entre TERT e oncogenes como MYC, E2F1, AKT1 e ABL1, que podem induzir a senescência. Além disso, uma associação metabólica forte entre estes oncogenes e sua capacidade de induzir senescência foi mostrada através de análise por ontologia gênica. Estes oncogenes também atuam como reguladores da transcrição e/ou pós-transcrição da subunidade catalítica de TERT. Resultados obtidos a partir da análise de centralidade da rede juntamente com dados de microarranjos derivados de tumores foram utilizados para conceber um modelo dinâmico da regulação de TERT em câncer. Com base nestes resultados, foi gerado um modelo hipotético no qual a expressão de TERT pode ser transitória ou induzida por espécies reativas de oxigênio, aumentando a sobrevivência de diferentes tipos de tumores, como o glioblastoma. Este estudo fornece novas evidências para a relação entre senescência e câncer. Além disso, esta hipótese, se verificada experimentalmente, pode permitir a formulação de novas abordagens quimioterapêuticas para o tratamento de gliobastomas. / Gliomas are the majority of central nervous system tumours, being glioblastoma the most malign among them. The treatment for these tumors is still inefficient and survival average of patients is approximately one year after diagnosis. Surgical removal, if possible, followed by radiotherapy and chemotherapy is the standard treatment. The trend is that chemotherapy assumes a greater role, since it allows the activation of antitumour mechanisms, such as cellular senescence. This mechanism has potential to induce irreversible loss of division ability in tumor cells. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, are able to induce senescence in different cancer models, including glioblastoma. Resveratrol and quercetine are molecules with pleiotropic effects and leads to SIRT1 activation. SIRT1 is a histone deacetylase (HDAC) which has been linked positively to cancer development. Therefore, we analyzed the ability of sodium butyrate, a HDAC class I and II inhibitor combined with resveratrol or quercetin to induce senescence in glioblastoma cell lines. Results show a combined effect of sodium butyrate and these polyphenols to induce senescence in U87 and C6 cell lines, but not in normal rat astrocytes. Co-treatments induce a loss of proliferative capacity and increase the number of positive cells for β-galactosidase, a senescence marker. These results were accompanied with cell cycle arrest in G2 checkpoint in U87, but no effect on cell cycle phase‟s distribution in C6 was observed. Western blott analysis suggests that these arrests are result of tumour suppressor p21 increase. Moreover, co-treatments increased reactive oxygen species, but not gamma-H2AX levels (a damage marker). The data underline that tumor cells can be driven towards cellular senescence by sodium butyrate combined with polyphenols, which may further arise as a possibility for tumor suppression. On the other hand, one of the challenging problems in biology and medicine is to understand how pre-cancerous or cancer cells enter in senescence or can avoid it. The key to understanding senescence induction and its bypass is the telomerase (TERT), which is present in 85 % of tumors. In a second part of this thesis, system biology tools were used to design a human cancer-senescence network with the aim to study the relationship between senescence and cancer (included glioblastoma). The results show a direct interaction between TERT and oncogenes such as MYC, E2F1, AKT1 and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Results obtained from centrality analysis and microarray data derived from tumors were used to design a dynamic model for TERT regulation in cancer. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches to glioblastoma treatment. and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches.

A criopreservação de sêmen humano é de grande importância para a medicina reprodutiva, porém esse processo pode causar danos ao espermatozóide devido, entre outros aspectos, à produção de espécies reativas de oxigênio, as quais podem lesar as biomoléculas. Tanto o resveratrol quanto o ácido ascórbico são compostos com reconhecida capacidade antioxidante, porém ainda pouco estudados em relação à prevenção de criodanos em espermatozóides humanos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi analisar marcadores de danos oxidativos e parâmetros seminais antes e após a criopreservação de sêmen humano em presença e ausência de resveratrol e ácido ascórbico. Foram analisadas amostras de sêmen de 20 homens inférteis e 10 doadores com fertilidade comprovada. Indivíduos com azoospermia(ausência de espermatozoides), leucocitospermia (aumento da contagem de leucócitos seminais) ou sob uso de suplementação antioxidante foram excluídos do estudo. Os marcadores de estresse oxidativo incluíram a avaliação dos produtos reativos ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a atividade das enzimas superóxido dismutase (Sod) e catalase (Cat). Os danos ao DNA foram quantificados pelo ensaio Cometa. Após a análise seminal padrão as amostras foram divididas em alíquotas, quais sejam: sem a adição de antioxidantes (controle), com 0,1 mM, 1,0 mM, e 10,0 mM de resveratrol e 10,0 mM de ácido ascórbico. Após uma hora de incubação as alíquotas foram criopreservadas em nitrogênio líquido a - 196°C, empregando-se o TEST-Yolk buffer como agente crioprotetor. Paralelamente, foram avaliados, ainda, os parâmetros séricos para TBARS, Sod, Cat e níveis de ácido úrico em homens inférteis e férteis. Os resultados mostraram que o uso de ácido ascórbico e resveratrol não causou nenhuma alteração na concentração e morfologia dos espermatozóides, porém nenhum dos antioxidantes foi capaz de prevenir a diminuição da motilidade induzida pelo processo de criopreservação. A criopreservação induziu uma diminuição na atividade da Sod em indivíduos inférteis e um aumento nos níveis de TBARS nas amostras de homens férteis e inférteis. Observou-se uma correlação negativa entre motilidade espermática e os valores de TBARS em homens inférteis, tanto em amostras pré-congelamento (-0,868, p<0,05) quanto em amostras pós-congelamento (-0,897, p<0,05). A adição de resveratrol às amostras, previamente ao processo de criopreservação, preveniu a diminuição da atividade da Sod em indivíduos inférteis e diminuiu os níveis de TBARS tanto em homens férteis como em inférteis. O ácido ascórbico foi capaz de minimizar os danos oxidativos a lipídios causados pela criopreservação, porém somente em sêmen de homens inférteis. Observou-se ainda que a criopreservação induziu um significativo aumento de danos ao DNA (principalmente dos tipos 2, 3 e 4) em homens férteis e inférteis. A adição de ácido ascórbico ao espermatozóide reduziu os danos ao DNA em homens inférteis, mas não em homens férteis. Por outro lado, o resveratrol foi capaz de reduzir os danos ao DNA tanto em homens férteis como em inférteis. Salienta-se, ainda, que o uso de 10,0mM de resveratrol foi capaz de evitar todos os danos ao DNA induzidos pela criopreservação em homens inférteis. Observou-se, também, que os indivíduos inférteis apresentaram níveis séricos mais elevados de TBARS, ácido úrico e atividade de Sod. Embora outros estudos sejam necessários, os dados apresentados neste trabalho indicam a possibilidade da utilização do resveratrol e ácido ascórbico em procedimentos de criopreservação de sêmen humano, principalmente naqueles onde a motilidade não seja essencial para ocorrer a fecundação como, por exemplo, a ICSI (injeção intracitoplasmática de espermatozóide). / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cryopreservation of human semen is very important in reproductive medicine, but it may cause damages to the spermatozoa, probably due to the production of reactive oxygen species (ROS), which may cause structural damage to the biomolecules. Resveratrol and ascorbic acid are important antioxidants, however, until now, there are only few studies about its use in cryopreservation process. Therefore, the aim of this study was to analyze the oxidative stress markers and seminal standard parameters before and after the cryopreservation of human semen with and without these antioxidants. Ejaculated semen from 20 infertile men and 10 fertile donors, with proven fertility, were examined. Individuals with azoospermia, leukocytospermia or under antioxidant supplementation were excluded from the study. Oxidative stress markers including the determination of the levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS) and the activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (Sod) and catalase (Cat). DNA damages were quantified by comet assay. After the evaluation of standard seminal assays, semen samples were divided into 5 aliquots, which were treated as follows: (a) without antioxidants; (b) with 0.1 mM of resveratrol; (c) with 1.0 mM of resveratrol; (d) with 10.0 mM of resveratrol and (e) with 10.0 mM of ascorbic acid. Samples were incubated for 1 hour and, then, they were cryopreserved in liquid nitrogen at -196°C. The TEST-Yolk buffer was used as cryoprotector agent in all the samples. Besides, it was evaluated, also, the seric values of TBARS, Sod, Cat and uric acid both in infertile and fertile men. The results showed that the use of ascorbic acid or resveratrol did not change the concentration and morphology of the spermatozoids. However, none of the antioxidants were able to prevent the decrease in the mobility induced by the cryopreservation process. Cryopreservation causes a decrease in Sod activity in infertile men and an increase of TBARS levels, both in infertile and fertile men. It was observed a negative correlation between spermatozoa motility and TBARS levels in infertile men, both before (-0, 868, p<0,05) and after (-0, 897, p<0,05) the cryopreservation process. Resveratrol was able to avoid the decrease in Sod activity in infertile men and the increase in TBARS levels both in infertile and fertile men samples. Ascorbic acid was able to reduce the oxidative lipid damages induced by cryopreservation only in infertile men. It was also observed that the cryopreservation process induced a significant increase of DNA damages (mainly types 2, 3 and 4) in infertile and fertile men. The addition of ascorbic acid reduces DNA damages only in infertile men. On the other hand, resveratrol was capable to reduce DNA damages both in infertile and fertile men. In fact, the use of 10.0mM of resveratrol was able to avoid all the DNA damages induced by the cryopreservation in infertile men. Infertile men showed high seric levels of TBARS, uric acid and Sod activity than the fertile men. Although other studies are necessary, the data presented in this work suggests the possibility to use resveratrol and ascorbic acid in human cryopreservation procedures, both for fertile and infertile men, at least, for ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection), as it does not need motile sperm for achieving pregnancy.