Die Telomere sind spezialisierte DNA-Protein-Komplexe, die sich an den Enden der Chromosomen der eukaryotischen Zellen befinden. Die Telomerase ist ein Ribonukleoprotein, welches für die vollständige Replikation der Telomere bei den meisten Eukaryoten verantwortlich ist. Die katalytische Untereinheit des Enzyms (hTERT beim Menschen) besitzt Reverse-Transkriptase-Aktivität, und nutzt eine integrierte RNA (hTR beim Menschen) als Template, um Telomer-Wiederholungssequenzen an den Enden der Chromosomen zu synthetisieren. Die Telomerase ist in den meisten normalen humanen somatischen Zellen unterdrückt. In den meisten Krebszellen jedoch, stellt die Reaktivierung der Telomerase zur Beibehaltung der Telomerlänge eine Voraussetzung für deren unbegrenztes Wachstumspotential dar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein neuer, einfacher und selektiver Assay für den Nachweis der humanen Telomerase entwickelt werden. In dem neuen Assay sollten die beiden Kernkomponenten des Enzyms, die Protein-Untereinheit und die RNA, die Targets sein. Der Test ist in seiner Grundstruktur wie folgt aufgebaut : 1. Immobilisierung der Telomerase über die hTERT an eine Festphase, beschichtet mit Phosphorothioat-modifizierten (PS) Oligonukleotiden oder Heparin. Zusammen mit der Telomerase werden bei diesem Schritt die Heparin-bindenden Proteine, die in der Probe enthalten sind, an die Festphase gebunden. 2. Spezifischer Nachweis der hTR. Zur Detektion der hTR wird ein Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA) oder eine Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) eingesetzt. In der optimierten Endversion wurde zur Immobilisierung des Enzyms eine Festphase, beschichtet mit PS-Oligonukleotiden, verwendet. Die hTR wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Mit dem neuen Assay wurden erfolgreich 75 Tumorzellen detektiert. / Telomeres are specialized DNA-Protein structures located at the ends of linear eukaryotic chromosomes. Telomerase is a ribonucleoprotein, which is responsible for the complete replication of the telomeres in most eukaryotes. The catalytic reverse transcriptase protein subunit (hTERT in humans) of the nucleoprotein uses an integral RNA (hTR in humans) as a template for the addition of telomeric repeat sequences to the ends of chromosomes. Telomerase is repressed in most normal human somatic cells, while the reactivation of telomerase to maintain telomere length is necessary for the unlimited growth potential of most human cancer cells. The aim of this work was the development of a new, simple and selective assay for the detection of human telomerase. The targets of the new assay were the two core subunits of the enzyme : hTERT and hTR. The test comprises two principal steps : 1. Immobilization of the telomerase via the hTERT subunit on a solid phase, coated with heparin or phosphorothioate-modified (PS) oligonucleotides. In this step telomerase is bound together with the heparin-binding proteins of the analysed sample to the surface. 2. Specific detection of the hTR. For the detection of the hTR an oligonucleotide ligation assay (OLA) or a reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was used. In the optimized final version of the assay a PS-coated solid phase was used for the immobilization of the enzyme. Reverse transcriptase PCR was applied for detection of the hTR. 75 tumor cells were successfully detected with the new assay.

Objective: The aim of this study was to develop an immunomagnetic/real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) assay and assess its clinical value for the molecular detection of circulating tumor cells (CTCs) in peripheral blood of pancreatic cancer patients. Methods: The presence of CTCs was evaluated in 34 pancreatic cancer patients before systemic therapy and in 40 healthy controls, through immunomagnetic enrichment, using the antibodies BM7 and VU1D9 [targeting mucin 1 and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), respectively], followed by real-time RT-PCR analysis of the genes KRT19, MUC1, EPCAM, CEACAM5 and BIRC5. Results: The developed assay showed high specificity, as none of the healthy controls were found to be positive for the multimarker gene panel. CTCs were detected in 47.1% of the pancreatic cancer patients before the beginning of systemic treatment. Shorter median progression-free survival (PFS) was observed for patients who had at least one detectable tumor-associated transcript, compared with patients who were CTC negative. Median PFS time was 66.0 days [95% confidence interval (CI) 44.8–87.2] for patients with baseline CTC positivity and 138.0 days (95% CI 124.1–151.9) for CTC-negative patients (p = 0.01, log-rank test). Conclusion: Our results suggest that in addition to the current prognostic methods, CTC analysis represents a potential complementary tool for prediction of outcome in pancreatic cancer patients. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Das Harnblasenkarzinom (BCa) ist die zweithäufigste bösartige urologische Tumorerkrankung sowie die siebthäufigste tumorbedingte Todesursache bei Männern. Zur Senkung des erheblichen Rezidiv- und Progressionsrisikos oberflächlicher BCa kommen lokale Immun- oder Chemotherapeutika zum Einsatz, die jedoch starke Nebenwirkungen verursachen können bzw. ungenügende langfristige Effekte bewirken. Eine neuartige Therapieoption besteht in der gezielten Expressionshemmung von Genen, die den Tumorzellen einen Wachstumsvorteil vermitteln. Hierfür eignen sich besonders synthetische Nukleinsäuren wie Antisense-Oligodesoxynukleotide (AS-ODN) und small interfering RNAs (siRNAs). In der vorliegenden Arbeit wurde die Expressionshemmung des potenziellen Targetgens hTERT (humane Telomerase Reverse Transkriptase) mit AS-ODN und siRNAs in BCa-Zellen untersucht. Die Tumorspezifität der hTERT-mRNA-Expression konnte zunächst an tumor- und tumorfreien Gewebeproben von BCa-Patienten gezeigt werden. Die verwendeten AS-ODN reduzierten die hTERT-mRNA-Expression auf bis zu 40%, womit eine Verringerung der Telomeraseaktivität einherging. Die AS-ODN-Behandlung bewirkte des Weiteren eine konzentrationsabhängige Viabilitätsreduktion verschiedener BCa-Zelllinien sowie eine verminderte Zellkoloniebildungsrate. Diese antiproliferativen Effekte waren auf eine Apoptoseinduktion zurückzuführen. Durch eine Vorbehandlung von vier BCa-Zelllinien mit hTERT-AS-ODN konnten die zytotoxischen Effekte der für das BCa relevanten Chemotherapeutika Cisplatin, Mitomycin C und Gemcitabin signifikant verstärkt werden. Nach Untersuchung der AS-ODN-Wirkung in vitro erfolgte die Etablierung eines subkutanen Xenotransplantantmodells der Nacktmaus. Die Eignung einer intraperitonealen Applikation wurde mit fluoreszenzmarkierten AS-ODN belegt. In weiteren Zellkulturexperimenten kamen hTERT-siRNAs, als alternative Methode der Geninhibition, zum Einsatz. Die Reduktion der hTERT-mRNA-Expression auf 50% war mit der durch AS-ODN bewirkten Inhibition vergleichbar. Im Gegensatz zur AS-ODN-Behandlung induzierten siRNAs keine unmittelbare Apoptose. Eine Kombination der siRNAs mit Cisplatin und Mitomycin C bewirkte jedoch eine Verdopplung der Apoptoserate. Um die molekularen Mechanismen der Wirkung der nukleinsäurebasierten hTERT-Inhibitoren und den Einfluss targetunabhängiger Effekte zu untersuchen, wurden transkriptomweite Expressionsanalysen mittels Oligonukleotid-Microarrays durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die AS-ODN-Behandlung vorwiegend zu einer gesteigerten Expression von Genen führte, die mit einer zellulären Stressantwort assoziiert sind (u.a. ATF3, EGR1, GADD45). Diese Expressionsmuster stimmten in hohem Maße mit denen überein, die durch Transfektion mit AS-ODN gegen andere Targets erhalten wurden. Diese Ergebnisse deuten auf eine, zumindest teilweise, durch off-Targeteffekte ausgelöste Wachstumshemmung hin. Die siRNA-Behandlungen gegen unterschiedliche Targets zeigten relativ geringe Übereinstimmungen in den Expressionsmustern und somit eine höhere Spezifität. Außerdem wurde erstmalig gezeigt, dass eine hTERT-Inhibition mit siRNAs zur trankriptionellen Hemmung der Onkogene EGFR und FOSL1 führt. Diese Daten sowie die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen deuten auf einen wechselseitigen Zusammenhang zwischen hTERT und EGFR in der Regulation der EGFR-stimulierten Proliferation von BCa-Zellen hin. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass hTERT als tumorspezifisch exprimierter und funktionell relevanter Faktor ein hervorragendes Target für eine nukleinsäurebasierte BCa-Therapieoption darstellt. Im Vergleich zu AS-ODN wirken siRNAs grundsätzlich targetspezifischer. Die therapeutische Wertigkeit der lokal applizierten Inhibitoren, insbesondere in Kombination mit herkömmlichen Chemotherapeutika, sollte in nachfolgenden Experimenten im Rahmen eines orthotopen BCa-Xenotransplantatmodells untersucht werden.

Die Therapie der HIV Infektion besteht aus Kombination mehrerer antiretroviraler Substanzen und birgt ein erhöhtes Risiko an Arzneimittelwechselwirkungen. Das bekannte Problem der Virusresistenz kann zudem durch Enzyminduktion begünstigt werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit lag in Untersuchungen zu Einflüssen der Virustatika auf die Expression von Cytochrom P450 Enzymen: 1A1, 1B1, 3A4 sowie der P-Glykoproteins (MDR1) an immortalisierten Zellsystemen. Die Protease Inhibitoren Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir und Saquinavir induzierten die Regulation der mRNA Expression über den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR) und den Pregnan-X-Rezeptor (PXR) dosisabhängig und signifikant. Die Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren Zalcitabin, Zidovudin und Lamivudin sowie der Nicht-Nukleosidische Inhibitor Nevirapin zeigten induktive Eigenschaften nur für die AhR Zielgene CYP1A1 und CYP1B1. Amprenavir und Efavirenz aktivierten die PXR-Regulation. Die möglichen Auswirkungen der Induktion der untersuchten Gene wurden ausführlich diskutiert. Die molekularen Grundlagen der interindividuell variierenden Aktivität von CYP3A wurden in einer Probandenstudie untersucht. Es wurden die mRNA Expression in den Leukozyten, die Aktivität des Enzyms und einige bekannte Polymorphismen unter Einwirkung von Rifampicin untersucht und diskutiert. / The therapy of HIV infection requires a combination of several antiretroviral substances accompanying risk factors for drug-drug interactions. Moreover, virus resistance can be promoted by enzyme induction caused by antiretroviral drugs. The aim of the study was to investigate the influences of antiretroviral substances on the expression of cytochrome P450 enzymes: 1A1, 1B1, 3A4 and p-glycoprotein (MDR1) using immortalized cell systems. The protease inhibitors indinavir, nelfinavir, ritonavir and saquinavir induced significantly the regulation of mRNA expression through the aryl hydrocarbon receptor (AhR) and the pregnane-x-receptor (PXR) in a concentration-dependent manner. The nucleoside reverse transcriptase inhibitors zalcitabine, zidovudine and lamivudine and the non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor nevirapine showed inductive properties only for the AhR target genes CYP1A1 and CYP1B1.Amprenavir and efavirenz activated the PXR target genes. Potentially effects of the described induction are discussed. In a second part of the work, the molecular mechanisms of the individual varying activity of the CYP3A enzyme were investigated applying an in vivo study. CYP3A4 mRNA expression and rifampicin mediated induction in leucocytes were correlated with systemic enzyme activity under induction and known polymorphisms.