DNA-Restriktions und -Modifikationssysteme sind in Prokaryoten weit verbreitet und stellen einen wirksamen Schutz gegen das Eindringen mobiler genetischer Elemente dar. Sie kodieren für eine Restriktionsendonuklease (REase) und eine DNA-Methyltransferase (MTase) gleicher Nukleotidsequenz Spezifität. Die MTase methyliert die zelluläre DNA und schützt sie durch diesen epigenetischen Marker vor der Wirkung der REase. Die REase verhindert die Aufnahme fremder, unmethylierter DNA durch sequenzspezifische Spaltung. EcoRII ist eine REase, die für die effiziente DNA-Spaltung mindestens zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz benötigt. Untersuchungen der EcoRII-Struktur und -Funktion offenbarten, dass das Protein aus zwei stabilen Domänen aufgebaut ist, wobei die N-terminale Domäne wie ein Repressor die C-terminale Domäne sterisch blockiert und deren katalytische Aktivität verhindert. Dieser als Autoinhibition bezeichnete und von eukaryotischen Proteinen gut bekannter Regulationsmechanismus wurde erstmals für eine REase vorgeschlagen. In dieser Arbeit konnten wir die Regulation der EcoRII-Enzymaktivität durch Autoinhibition auf molekularer Ebene beweisen. Wir identifizierten ß-Strang 1 (B1: 18YFVYIKR24) und a-Helix 2 (H2: 26SANDT30) als essenzielle inhibitorische Elemente der N-terminalen Domäne des EcoRII-Moleküls. Die Deletion von B1 oder H2 führte zu einer vollständigen Aufhebung der Autoinhibition. Darüber hinaus ist es uns gelungen, die 3D-Röntgenkristallstruktur von EcoRII mit 1,9 Å zu lösen und mit Hilfe von Computermodellen neue Interaktionen des Enzyms mit der DNA „minor groove“ zu beschreiben sowie eine Mg2+-Bindungstasche zu charakterisieren. Die Untersuchung der EcoRII-MTase durch limitierte Proteolyse zeigte, dass das Enzym in Abhängigkeit von der DNA-Sequenz und von seinen Kofaktoren, DNA auf unterschiedliche Weise binden kann. Kristallisierungsversuche der EcoRII-MTase in Anwesenheit der hemi-methylierten DNA-Erkennungssequenz ergaben erste diffraktierende Kristalle, deren Qualität optimiert werden muss und zur Strukturlösung führen soll. / Restriction and modification systems are wide spread among prokaryotes and pre-sent an efficient protection against invasion of mobile genetic elements. In general, they code for a restriction endonuclease (REase) and a DNA-methyltransferase (MTase) of the same DNA specificity. The MTase methylates the cellular DNA and by this epigenetic marker protects it against the action of the REase. The REase pre-vents the entry of foreign unmethylated DNA by site-specific cleavage. EcoRII is an REase which needs at least two copies of the recognition sequence for efficient cleavage. Investigations of the EcoRII structure and function revealed that the pro-tein is composed of two stable domains: the N-terminal domain acts as a repressor by sterically blocking the C-terminal domain and thereby inhibiting its catalytic activity. This regulatory mechanism is known as autoinhibition and has been often described for eukaryotic proteins, but for the first time was proposed for a REase. In this work, we verified the regulation of the EcoRII enzyme activity by autoinhibition at the molecular level. We identified ß-strand 1 (B1: 18YFVYIKR24) and a-helix 2 (H2: 26SANDT30) as essential inhibitory elements of the N-terminal domain. Deletion of B1 or H2 caused a complete abolishment of the autoinhibition. Fur-thermore, we were able to solve the 3D-X-ray crystal structure of EcoRII at 1.9 Å. Based on computer modelling we discovered new interactions between EcoRII and the DNA minor groove and defined the position of the Mg2+ binding pocket. Investigations of the EcoRII MTase by limited proteolysis showed that the enzyme binds DNA depending on DNA sequence and cofactors in different manners. Crystallography experiments with EcoRII MTase in the presence of hemimethylated recognition site DNA showed for the first time diffracting crystals which need further optimisation to create high quality crystals which allow structure solution.

Die Therapie der HIV Infektion besteht aus Kombination mehrerer antiretroviraler Substanzen und birgt ein erhöhtes Risiko an Arzneimittelwechselwirkungen. Das bekannte Problem der Virusresistenz kann zudem durch Enzyminduktion begünstigt werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit lag in Untersuchungen zu Einflüssen der Virustatika auf die Expression von Cytochrom P450 Enzymen: 1A1, 1B1, 3A4 sowie der P-Glykoproteins (MDR1) an immortalisierten Zellsystemen. Die Protease Inhibitoren Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir und Saquinavir induzierten die Regulation der mRNA Expression über den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR) und den Pregnan-X-Rezeptor (PXR) dosisabhängig und signifikant. Die Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren Zalcitabin, Zidovudin und Lamivudin sowie der Nicht-Nukleosidische Inhibitor Nevirapin zeigten induktive Eigenschaften nur für die AhR Zielgene CYP1A1 und CYP1B1. Amprenavir und Efavirenz aktivierten die PXR-Regulation. Die möglichen Auswirkungen der Induktion der untersuchten Gene wurden ausführlich diskutiert. Die molekularen Grundlagen der interindividuell variierenden Aktivität von CYP3A wurden in einer Probandenstudie untersucht. Es wurden die mRNA Expression in den Leukozyten, die Aktivität des Enzyms und einige bekannte Polymorphismen unter Einwirkung von Rifampicin untersucht und diskutiert. / The therapy of HIV infection requires a combination of several antiretroviral substances accompanying risk factors for drug-drug interactions. Moreover, virus resistance can be promoted by enzyme induction caused by antiretroviral drugs. The aim of the study was to investigate the influences of antiretroviral substances on the expression of cytochrome P450 enzymes: 1A1, 1B1, 3A4 and p-glycoprotein (MDR1) using immortalized cell systems. The protease inhibitors indinavir, nelfinavir, ritonavir and saquinavir induced significantly the regulation of mRNA expression through the aryl hydrocarbon receptor (AhR) and the pregnane-x-receptor (PXR) in a concentration-dependent manner. The nucleoside reverse transcriptase inhibitors zalcitabine, zidovudine and lamivudine and the non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor nevirapine showed inductive properties only for the AhR target genes CYP1A1 and CYP1B1.Amprenavir and efavirenz activated the PXR target genes. Potentially effects of the described induction are discussed. In a second part of the work, the molecular mechanisms of the individual varying activity of the CYP3A enzyme were investigated applying an in vivo study. CYP3A4 mRNA expression and rifampicin mediated induction in leucocytes were correlated with systemic enzyme activity under induction and known polymorphisms.

Aus den frühen Bindungsstudien des globalen Regulators AbrB mit der ausgedehnten phyC-Promotorregion von Bacillus amyloliquefaciens FZB45 konnte ein mehrstufiger kooperativer Bindungsprozess abgeleitet werden. Dabei verlangt die AbrB-vermittelte Repression von phyC nach Integrität zweier großer Bindungsstellen, ABS1 und ABS2, die 162 bp voneinander entfernt liegen. In der vorliegenden Arbeit wurden die ersten Echtzeitkinetiken zur DNA-AbrB-Interaktion mittels der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) gemessen und analysiert. AbrB zeigte hohe Affinitäten zu den 40 bp langen Oligonukleotiden, die den beiden Bindungsstellen entstammen. Dabei verursachten alle Oligonukleotide der ABS2 und nur eine kurze Region innerhalb der ABS1 bei der Bindung von AbrB Konformationsänderungen im Protein und in der DNA (CD - Zirkulardichroismusspektroskopie) und wiesen eine Kooperativität von 2 / In previous binding studies it could be demonstrated that a global regulator AbrB and the extensive phyC promoter region of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 interact in a complex manner. AbrB binding is a multistep cooperative process. The integrity of both binding sites, ABS1 and ABS2, which are separated by 162 bp, is crucial for the AbrB-mediated repression of phyC. This work presents the first real-time binding kinetics of the AbrB-DNA interaction using surface plasmon resonance (SPR). AbrB exhibited high affinities to all analyzed 40-bp oligonucleotides that were derived from the ABSs of phyC. All parts of the ABS2, but only a small region within ABS1, were bound cooperatively to AbrB with a stoichiometry of 2 DNA to 1 AbrB tetramer and with 2