Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.

Orientador: Alvimar José da Costa / Banca: Carolina Buzzulini / Banca: Welber Daniel Zanetti / Resumo: Considerando a grande importância do Rhipicephalus (Boophilus) microplus, na produção de bovinos, o presente estudo teve como objetivo avaliar a sazonalidade deste artrópode em bovinos mantidos em pastagem de Brachiaria decumbens. Para tanto, foi pesquisada a dinâmica populacional durante 12 meses no município de Formiga, Minas Gerais. Vinte e quatro bovinos com oito a 12 meses de idade foram submetidos à infestação natural pelo carrapato. Contagens de fêmeas parcialmente ingurgitadas, 4,5 a 8,0 mm (partenóginas), foram computadas do lado esquerdo de cada bovino, nos períodos -2,-1 e zero. Utilizando-se as médias das contagens de carrapatos nas referidas datas, efetuou-se a randomização, para obtenção de dois grupos com infestações equitativas, os quais foram mantidos em piquetes separados. Para estudo da sazonalidade, as contagens foram realizadas nos períodos 3, 7, 14, 21, 28, e a cada 14 dias, durante 12 meses. Para verificar a incidência ectoparasitária com os efeitos climáticos, foram colhidos do posto climatológico do município, os seguintes dados: temperatura máxima e mínima, precipitação pluvial e umidade relativa do ar. Tratamentos táticos foram realizados, via tópica (pulverização), com uma formulação contendo Cipermetrina 15% + Clorpirifos 25% + Butóxido de Piperonila 15 + Citronela 1%, em todas as datas nas quais as quantificações de carrapatos ultrapassavam 30 partenóginas, em média. Como coadjuvante ao projeto, foram, ainda, realizadas pesagens dos animais e colheitas de fezes para contagens de ovos por grama de fezes (OPG) a cada 28 dias, sendo os mesmos tratados, com Fosfato de Levamisole injetável, na dose de 4,7 mg/kg, atingindo média de OPG ≥ 300. A carga média parasitária por animal e os desvios padrões do grupo I foi de 18,7(±11,7) e para o grupo II de 25,9 (±22,6), sendo realizados 15 tratamentos carrapaticidas nos dois grupos. As contagens de OPG apresentaram-se mais... / Abstract: Considering the great importance of Rhipicephalus (Boophilus) microplus in cattle, the present study aimed to evaluate the seasonality of this arthropod in cattle maintained in pastures of Brachiaria decumbens. To that end, were investigated the population dynamics for 12 months in the city of Formiga, Minas Gerais. Twenty-four cattle with eight to 12 months of age were subjected to natural infestation by ticks. Counts of partially engorged females, from 4,5 to 8,0 mm (engorged), were computed on the left side of each animal, at times -2, -1 and zero. Using the mean on those dates tick counts, randomization was executed, to obtain two groups with fair infestations, which were kept in separate paddocks. To study of seasonality, the counts were recorded at 3, 7, 14, 21, 28, and every 14 days for 12 months. To check the ectoparasitic incidence with the climatic effects, were collected from the climatological station of the city, the following data: maximum and minimum temperature, rainfall and relative humidity. Tactical treatments were performed, topically (spray) with a formulation containing Cypermethrin 15 % + Chlorpyrifos 25% + Piperonyl butoxide 15 + Citronella 1% on all the dates on which tick measurements exceed 30 engorged on average. As an adjunct to the project, were also carried weights of animals and faeces samples for egg counts per gram of feces (EPG) every 28 days, and they are treated with injectable Levamisole Phosphate at a dose of 4,7 mg/kg, reaching average of EPG ≥ 300. The mean parasite load per animal and group I standard deviation was 18,7 (± 11,7) and group II 25,9 (± 22,6) and were performed 15 acaricide treatments in both groups. The EPG counts were more elevated in the months of December and May, and made two treatments in each group, a total of four anthelmintic treatments throughout the study. There was no statistical difference between the mean weight of the two analyzed groups (p>0,05), as well ... / Mestre

Orientador: Henrique Nunes de Oliveira / Coorientador: Márcia Cristina de Sena Oliveira / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Banca: Rodrigo Giglioti / Resumo: A bovinocultura é um setor com importante destaque no agronegócio brasileiro. O carrapato Ripicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas significativas aos pecuaristas e é vetor de hemoparasitoses como Anaplasma spp e Babesia spp. Sabe-se que os bovinos Bos taurus taurus são mais susceptíveis à infestação por carrapatos do que Bos taurus indicus. Acredita-se que o mesmo ocorra para a infecção por Babesia bovis. Neste trabalho, foram avaliados, em duas colheitas, 355 bovinos da raça Angus, pertencentes a uma fazenda de Uruguaiana-RS, nos quais foram realizadas contagens de carrapatos e colheitas de amostras de sangue para quantificação de B. bovis, pela técnica de qPCR, e genotipagem com chip de 150.000 marcadores SNP. Para qPCR utilizaram-se sequências iniciadoras que flanqueiam um fragmento do gene do citocromo B (mt-cytB), como oligonucleotídeos iniciadores. Após genotipagem dos bovinos com o chip Gene Seek Genomic Profiler™ (GGP-HD) da Illumina Infinium®, foi realizado imputação de genótipos, para recuperação de genótipos faltantes, e controle de qualidade. Foi realizada análise de associação genômica ampla (GWAS), para cada uma das características, infecção por B. bovis e resistência a carrapatos, através do método denominado "Single Step Genomic BLUP" (ssGBLUP). Todos os animais apresentaram infestação por carrapatos e infecção por B. bovis, determinada pela qPCR, e altos valores médios para ambas as características. Algumas regiões cromossômicas ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cattle industry is a sector with importance in the Brazilian agribusiness. The Ripicephalus (Boophilus) microplus is responsible for economic losses and is a vector for hemoparasitoses, such as Anaplasma spp and Babesia spp. It is known that the Bos tauros animals are more susceptible to infestation by ticks when compared with infestation in Bos indicus animals. It is believed that the same behavior keeps for infection by Babesia bovis. They were evaluated, in two collections, 355 Angus cattle, from a farm in Uruguaiana city, estate of Rio Grande do Sul, where were performed tick counts, quantification of B. bovis by qPCR and genotyping with a 150K chip. Were used as primers, in the qPCR, sequences that flanking the fragment of the cytochrome b gene. The technique was standardized and optimized using specimens of isolates of B. bovis. After genotyping, imputation was carried out, for recovery of missing genotypes, and quality control. Genome association analysis was performed (GWAS), to each of the characteristics, through the method called "Single Step Genomic BLUP" (ssGBLUP). All animals showed tick infestation and infection by B. bovis and high average values for both characteristics. Some regions on chromosomes were identified as significant to the characteristics tick infestation and infection by B. bovis, and seven chromosomes, identified in the present study, were already described in other studies. The present study agrees with other results indicating that the qP... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by PATRICIA MARTINEZ ÉVORA null (patievora@hotmail.com) on 2017-02-13T00:31:17Z No. of bitstreams: 1 tese_Patricia_Martinez_Evora.pdf: 3202311 bytes, checksum: bdd0b7d86607bed23a99de4afecc5b35 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-02-15T19:06:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 evora_pm_dr_jabo.pdf: 3202311 bytes, checksum: bdd0b7d86607bed23a99de4afecc5b35 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-15T19:06:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 evora_pm_dr_jabo.pdf: 3202311 bytes, checksum: bdd0b7d86607bed23a99de4afecc5b35 (MD5) Previous issue date: 2017-01-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O controle de carrapatos à base de acaricidas químicos tem levado a seleção de ectoparasitos resistentes além de contaminação ambiental e de produtos de origem animal. Frente a isso, há crescente incentivo na busca por alternativas de controle do ectoparasito, como o desenvolvimento de vacinas. O presente estudo teve como objetivo avaliar a utilização de uma proteína recombinante da aquaporina do Rhipicephalus (Boophilus) microplus como antígeno em uma vacina contra R. sanguineus, em cães domésticos. A investigação foi realizada em cooperação científica com o United States Department of Agriculture/Agricultural Research Service (USDA/ARS). Os efeitos da vacina foram avaliados nos diferentes estádios do ectoparasito em cães previamente vacinados com o antígeno + adjuvante (Montanide) (G1) e em animais de um grupo controle inoculados apenas como adjuvante (G2). Foram avaliados: i. potencial biótico (parâmetros biológicos) dos carrapatos; ii. Título de anticorpos séricos (IgG) de cães por meio do ensaio imunoenzimático indireto (Teste ELISA) pós imunização; iii. Avaliação histopatológica do sitio de fixação dos carrapatos em diversos momentos pós-fixação na pele dos hospedeiros, incluindo a contagem de células inflamatórias migradas para o foco inflamatório; iv. Histologia do ovário dos carrapatos para observação de possíveis danos causados pela ação do imunógeno; v. locais de ação do antígeno no corpo do carrapato por meio de ensaio imunohistoquímico. Os principais resultados obtidos foram: 1) O período de ingurgitamento das fêmeas adultas do grupo imunizado foi 12% menor que o do grupo controle; 2) as larvas do grupo imunizado apresentaram período de ingurgitamento 8,7% maior que as do grupo controle e pesaram 7,2% menos; 3) as ninfas do grupo imunizado apresentaram período de ingurgitamento 4,5% menor e pesaram 3,6% menos que as do grupo controle; 4) apesar de os animais apresentarem um aumento na titulação de anticorpos pós-segunda imunização, estes títulos rapidamente diminuíram; 5) As alterações histopatológicas gerais observadas incluíram espessamento da epiderme (hiperplasia), infiltração celular inflamatória, edema de derme e neovascularização, dentre outros, o que representa aspectos inespecíficos presentes em uma reação inflamatória; 6) processo inflamatório moderado foi observado nos animais do grupo imunizado em todos os tempos avaliados; 7) O infiltrado inflamatório presente no tegumento dos cães era composto majoritariamente por linfócitos, plasmócitos e macrófagos, seguido de neutrófilos, observando-se também a presença esporádica de eosinófilos e de raros mastócitos ainda íntegros, não degranulados; 8) Histologia dos ovários de fêmeas alimentadas em cães imunizados demonstrou maior quantidade de vacuolização em ovócitos II e III, e maior número de deformações em ovócitos IV e V em relação ao grupo controle; 9) Ensaio imunohistoquímico em carrapatos adultos mostrou resultado negativo, ou seja, nenhuma marcação foi evidenciada no tecido do ectoparasito. Os resultados, analisados em conjunto, indicam um baixo potencial imunogênico do RmAQP1 contra carrapatos R. sanguineus adultos na dose testada e possível, ainda que baixa, eficácia contra larvas e ninfas. Sugere-se que novos estudos sejam desenvolvidos com dose maior de RmAQP1 para observação de seu potencial imunogênico contra R. sanguineus em cães. / FAPESP: 2013/09792-7

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008- Eliana Mattos Piranda.pdf: 1406016 bytes, checksum: c9a77c6cc1de7bc1adde1a6eb06a7a84 (MD5) Previous issue date: 2008-02-29 / Funda??o de Amparo a Pesquisa do Estado de S?o Paulo / The bacterium Rickettsia rickettsii is the etiological agent of an acute, severe human disease called Rocky Mountain Spotted Fever in the United States or Brazilian Spotted Fever in Brazil. The infection occurs through the tick bite. Reports of clinical illness on dogs due to this agent have been restricted to the United States. The brown dog tick or kennel tick, Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) is the most widespread tick species throughout the tropics and subtropics. Biological studies on ticks are very important to the tick-borne pathogens transmission knowledge. For this purpose, the present study evaluated experimental infection of dogs with a Itaia?u (Mogi das Cruzes/ S?o Paulo, Brasil) strain of R. rickettsii and some biological aspects of Rhipicephalus sanguineus. Initially, dogs were infected with R. rickettsii its susceptibility and the role of R. sanguineus as a vector was verified. In the second part the viability of adults ticks (R. sanguineus) on three different temperatures were tested. Ticks were maintained under the controlled conditions of 18 ? 1◦C, 27 ? 1◦C e 32 ? 1◦C e 80 ? 5% (temperature ? humidity) for different times without feed. The dogs were susceptible to R. rickettsii infection. R. sanguineus was able to acquire the pathogen and to transmit R. rickettsii to guinea pigs. Based on the second part s results, R. sanguineus viability is affected by both, temperature and unfed time. / A bact?ria Rickettsia rickettsii ? o agente etiol?gico de uma doen?a aguda e severa em humanos denominada Rocky Mountain Spotted Fever nos Estados Unidos e Febre Maculosa Brasileira no Brasil. A infec??o se d? pela picada de carrapatos. Relatos da doen?a cl?nica nos c?es s?o restritos aos EUA. O carrapato marrom do c?o ou carrapato dos canis, Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806), ? a esp?cie de carrapato mais freq?ente nos tr?picos e subtr?picos. Estudos da biologia de carrapatos s?o de grande import?ncia para o entendimento da transmiss?o de biogentes. O objetivo do presente trabalho ? avaliar experimentalmente a infec??o nos c?es com R. rickettsii cepa Itaia?u (Mogi das Cruzes/ S?o Paulo, Brasil) e aspectos da biologia de Rhipicephalus sanguineus. Na primeira etapa, c?es foram infectados com R. rickettsii e avaliou-se a susceptibilidade dos animais a infec??o e o comportamento de R. sanguineus como vetor. No segundo experimento, adultos de R. sanguineus tiveram a viabilidade de infestar novos hospedeiros analisada. Os carrapatos foram mantidos a18 ? 1◦C, 27 ? 1◦C e 32 ? 1◦C e 80 ? 5% UR por tr?s per?odos de jejum. Observou-se que os c?es s?o suscept?veis a infec??o por R. rickettsii cepa Itaia?u. Foi verificado que R. sanguineus se infectam com R. rickettsii e s?o capazes de transmitir o agente a cobaias. Baseado nos resultados do segundo experimento, concluem-se que R. sanguineus tem a viabilidade influenciada pela temperatura e tempo de jejum.

Con el objetivo de comparar la eficacia de dos formulaciones de ivermectinas de diferente concentración, y una de ellas con adición de vitaminas ADE, 24 bovinos naturalmente infestados con garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus, fueron distribuidos en tres grupos de ocho animales cada uno. Los bovinos fueron animales de la zona de Tarapoto (San Martín) y en su mayoría cruzados (cruce de Bos taurus con Bos indicus). Para el trabajo experimental se usó una fórmula en base a Ivermectina al 1% en un grupo, en comparación a otros dos grupos, uno tratado con Ivermectina al 1,8% adicionada con 3 vitaminas y grupo control, los animales de los tres grupos fueron asignados aleatoriamente entre animales de similares edades y condiciones entre sí, para que sean grupos lo más homogéneos posibles y sometidos a las mismas condiciones de manejo durante el experimento. Se realizó un conteo de teleoginas al principio del estudio y luego a los días 5, 11, 15, 19, 24, 28, 32 y 40 para determinar la eficacia de los productos y el grado de infestación natural del grupo control. Los resultados mostraron una infestación natural en el grupo control que se incrementó hasta un 262% al día 40 de la prueba, mientras que el grupo tratado con Ivermectina al 1% tuvo una respuesta baja al lograr una menor infestación recién entre los días 11 y 15 hasta que se produjo una reinfestación masiva en el día 24. Por su parte el grupo tratado con Ivermectina al 1.8% demostró un control de la infestación entre los días 11 y 32 del estudio. Se concluye que existen diferencias entre el grupo control y los tratados, así como también entre grupos tratados a la prueba de t de Student. Palabras clave: Rhipicephalus microplus, Garrapatosis, Ivermectina, Ganado lechero, Selva baja. / In order to compare the efficacy of two different formulations of ivermectin concentration, and one with addition of vitamins A, D and E, 24 cattle naturally infested with ticks Rhipicephalus (Boophilus) microplus were divided into three groups of eight animals each. The cattle were animals in the area of Tarapoto (San Martin) and in the majority where crossings (Bos taurus crossing with Bos indicus). For the experimental work was used a formula based on Ivermectin 1% in a group, compared to two other groups, one treated with Ivermectin 1.8% added with 3 vitamins and control group. The animals of the three groups were randomize between animals of similar age and condition to be as homogeneous as possible during the experiment. A counting of Teleogines was performed at baseline and then at day 5, 11, 15, 19, 24, 28, 32 and 40 to determine the efficacy of the products and the degree of natural infestation in the control group. The results showed a natural infestation in the control group increased to 262% at day 40 of the trial, while treated with Ivermectin 1% group had a low response to achieve a lower infestation newly between 11 and 15 until there was a massive reinfestation on day 24. For his part, treated with Ivermectin 1.8% control group showed infestation between days 11 and 32 of the study. We conclude that there are differences between the control group and treated group, as well as between groups treated with the t of Student test. Keywords: Rhipicipephalus microplus, Tickness, Ivermectin, Dairy cattle, Low jungle. / Tesis

Thesis (MSc (Veterinary Tropical Diseases, Veterinary Science))--University of Pretoria, 2008. / Includes bibliographical references. Also available in print format.

O extrato n-hexano de Calea serrata demonstrou atividade acaricida contra larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus e R. sanguineus. A enzima acetilcolinesterase (AChE), responsável por hidrolisar a acetilcolina nas sinapses colinérgicas, tem sido alvo de pesticidas e sua inibição pelos organofosforados levam à paralisia e morte de artrópodes. O uso intensivo de acaricidas / inseticidas tem provocado resistência em artrópodes, a qual pode estar relacionada com maior atividade de enzimas de detoxicação, como a glutationa-S-transferase (GST). O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade acaricida do componente isolado do extrato n-hexano, o precoceno II, e do óleo essencial de C. serrata, assim como, determinar a composição química do referido óleo. Com intuito de compreender o mecanismo de ação acaricida do extrato n-hexano de C. serrata, foi investigado o efeito deste extrato sobre a atividade in vitro da AChE em larvas de R. microplus e em estruturas cerebrais de ratos Wistar machos, bem como sobre a modulação da atividade da GST em larvas de R. microplus. O óleo essencial e o precoceno II, o composto isolado, mostraram atividade larvicida. O óleo essencial apresentou diferentes sesquiterpenos em sua constituição química, além de precoceno II. O extrato nhexano de C. serrata inibiu significativamente a atividade in vitro da AChE em larvas de R. microplus e em estruturas cerebrais de ratos. O extrato n-hexano de C. serrata inibiu significativamente a atividade in vitro da GST. Compostos do extrato n-hexano de C. serrata podem ser potenciais inibidores de AChE e de GST, os quais podem contribuir para a sua toxicidade para os carrapatos. Considerando que o aumento da atividade da GST poderia reduzir a eficiência de carrapaticidas, é possível supor que C. serrata possa ser usada como um adjuvante no controle de R. microplus. Os resultados obtidos também suportam a possibilidade de que a inibição da acetilcolinesterase seja um possível mecanismo de ação do extrato n-hexano de C. serrata. / It has been demonstrated that the n-hexane extract of Calea serrata had acaricidal activity against larvae of R. microplus and R. sanguineus. Acetylcholinesterase (AChE), an enzyme that hydrolyses acetylcholine at cholinergic synapses, is a target for pesticides and its inhibition by organophosphates leads to paralysis and death of arthropods. Extensive uses of acaricides/inseticides have induced resistance in arthropods, which can be related to higher activity of detoxification enzymes, such as glutathione-S-transferase (GST).The aims of the present study were to evaluate the acaricide activity of isolated constituent of n-hexane extract, the precocene II, and the essential oil of C.serrata, in addition to determine the chemical composition of essential oil. In order to understand the mechanism of the acaricidal action of C. serrata n-hexane extract, we investigated the effect of this extract on in vitro anticholinesterase activity of larvae from R. microplus and in brain structures of male Wistar rats, as well as, we investigated the effect of C. serrata on GST activity of larvae from R. microplus.The essential oil and the isolated compound, precocene II, showed larvicidal action. Several sesquiterpenes were detected in the essential oil of C. serrata. The n-hexane extract significantly inhibited in vitro acetylcholinesterase activity in R. microplus larvae and rat brain structures. The n-hexane extract of C. serrata inhibited significantly GST activity. Compounds of n-hexane extract from C. serrata may be potential inhibitors of AChE and GST, which may contribute to its tick toxicity. Considering that higher GST activities would reduce the efficiency of the pesticides, we can also suppose that C. serrata may be at least used as an adjuvant in tick control. The results support that inhibition of acetylcholinesterase is a possible mechanism of action of hexane extract at C. serrata.

Os carrapatos estão distribuídos por todo mundo e impactam tanto a saúde animal quanto humana. A espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal parasita que afeta a bovinocultura nas regiões tropicais e subtropicais do globo, causando grandes prejuísos econômicos. Os métodos de controle estão baseados no uso de acaricidas químicos, o que resulta na seleção de populações resistentes e no risco de poluição do meio ambiente e dos alimentos. As vacinas têm-se mostrado um método de controle factível, e representam uma alternativa ao uso de acaricidas químicos. No entanto, dez anos após a disponibilização da primeira vacina comercial contra carrapatos, ainda não foi encontrada uma formulação capaz de alcançar a proteção necessária para dispensar o uso de agentes químicos. Sendo assim, estudar a biologia do parasita e conhecer mecanismos de importância fisiológica pode ser uma boa estratégia para encontrar moléculas alvo que possam ser usadas como antígenos no desenvovimento de uma vacina eficaz. Com este objetivo, nesta tese foi estudada a reprodução em carrapatos e avaliada a eficácia de uma enzima evolvida neste processo como antígeno vacinal. Foram abordados os processos de vitelogênese e de embriogênese. Em uma primeira etapa, usando carrapatos da espécie Amblyomma hebraeum como modelo, foi investigada a atuação do hormônio 20- hidroxiecdisona (20E) e de fatores adicionais, presentes na hemolinfa, na captação de vitelogenina (Vg) pelos oócitos. Neste trabalho, verificamos que existem diferentes estratégias de controle da captação de Vg pelo ovário nos carrapatos Ixodide, e que para que ocorra capatação de Vg pelos oócitos de A. hebraeum é necessaário um fator adicional presente na hemolinfa das fêmeas. Uma vez que o desenvolvimento do embrião depende da disponibilidade do material do vitelo estocado nos oócitos, a segunda parte da tese explorou uma cisteíno endopeptidase envolvida na degradação de vitelina (Vt) em ovos do carrapato R. microplus denominada Vitellin Degrading Cysteine endopeptidase (VTDCE). As enzimas da classe das cisteíno endopeptidases estão amplamente distribuidas nas fêmeas deste carrapato. Os estudos com VTDCE mostraram que esta é uma enzima de origem materna, com provável síntese extraovariana e transporte pela hemolinfa, até ser internalizada pelos oócitos. A VTDCE está presente durante todo o desenvolvimento embrionário, assim como em larvas. Interessantemente, esta cisteíno endopeptidase apresenta a propriedade de se associar a Vt por um outro sítio, além do sítio ativo. A VTDCE é a enzima mais eficiente na degradação de vitelina (Vt) em ovos de R. microplus, e devido a sua importância fisiológica, a VTDCE foi testada como antígeno em experimento de vacinação de bovinos e desafio com larvas de R. microplus. Os parâmetros mais afetados nos carrapatos alimentados em bovinos vacinados, com relação aos controles, foram o peso das fêmeas ingurgitadas (19,3 %) e a fertilidade dos ovos (17,6 %). Relacionado os parâmetros análisados, vimos que este antígeno confere uma proteção de 21% aos animais imunizados quando infestados por R. microplus. A proteção parcial alcançada pela VTDCE pode ser complementar a de outros antígenos no desenvolvimento de um coquetel antigênico contra carrapatos, uma vez que nenhum antígeno encontrado até o momento foi capaz de oferecer a proteção necessária para ser empregado individualmente na composição de uma vacina. Estudos como os realizados nesta tese contribuem para o melhor entendimento da biologia dos carrapatos, assim como para o desenvolvimento de novos e melhores métodos de controle desses parasitas. / Ticks are distributed worldwide impacting human and animal health. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main parasite that affects livestock in tropical and subtropical regions of world, causing large economical losses. Tick control methods are based on the application of chemical acaricides, which has resulted in selection of resistant ticks and a potential risk of environmental pollution and food contamination. Vaccines have been shown to be a feasible tick control method that offers a cost-effective, environmentally friendly alternative to chemical control. However, ten years after the commercialization of the first vaccine against ticks, to identify tickprotective antigens remains a limiting step in the development of an efficient formulation that would avoid the use of chemical acaricides. In face of this situation, to study the parasite biology and understanding physiological important mechanisms could be a good strategy to find new targets to be used in an efficient vaccine. In order that, this thesis subject was to investigate the reproduction process in ticks and to evaluate the efficiency of an enzyme involved in this process as vaccinal antigen. The process of vitellogenesis and embryogenesis were studied. In the first part, using Amblyomma hebraeum ticks as model, the role of 20- hydroxiecdisone and additional hemolymph borne factors in vitellogenin (Vg) uptake by oocytes were investigated. Our findings showed that there are different strategies to control Vg uptake by ovary in Ixodide ticks. Additionally, for Vg uptake in A. hebraeum ovaries, a vitellogenin uptake factor (VUF) present in female hemolymph is required. As embryo development depends on the availability of yolk material stored into the oocytes, in the second part we studied a cysteine endopeptidase involved in Vt digestion in R. microplus eggs, named vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE). Cysteine endopeptidase enzymes are widely distributed in these tick females. Studies with VTDCE demonstrate that it is a maternal derived endopeptidase involved in a route including extraovarian synthesis, transport, and ovary uptake, before internalization by oocytes. VTDCE is present during all tick development, as well as in larva. Interestingly, this cysteine endopeptidase is able to associate with Vt in another site than the active site. VTDCE showed to be the most efficient Vt hydrolytic enzyme in R. microplus eggs. So, supported by its physiological role, VTDCE was used as antigen in bovine vaccination and R. microplus challenge experiment. The most affected biological parameters in ticks fed on vaccinated animals were weight of engorged ticks (19.3 %), and egg fertility (17.6 %). Relating the biological parameters analyzed, bovine vaccination with VTDCE as antigen resulted in an overall protection of 21%. Therefore, this partial protection could be complementary in the formulation of an antigenic cocktail against tick, once there is not one single protein that achieves the protection level necessary for an efficient and practical vaccine development. Studies like that contribute to the better understanding of tick biology, as well as to the development of new and more efficient methods of control.

Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.