Carrapatos da espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus causam enormes prejuízos à saúde e à produção animal. Sendo um ectoparasita hematófago, o carrapato espolia seu hospedeiro e transmite doenças. Seu parasitismo é mediado por sua saliva, que inibe as reações homeostáticas do hospedeiro à injúria local causada por sua picada. Seus hospedeiros montam respostas imunes contra esse parasita, incluindo a resposta imune mediada por anticorpos, indicando que o controle imunobiológico é possível. Contudo, o complexo farmacológico da saliva do parasita é composto por proteínas solúveis que são sabidamente pouco ou nada imunogênicos se não forem introduzidos no hospedeiro com adjuvante ou na foram agregada. Assim, dificilmente induziriam imunidade nos hospedeiros. Bovinos apresentam fenótipos contrastantes e herdáveis quanto à intensidade de infestações com carrapatos. Carrapatos alimentados em bovinos resistentes não completam a refeição de sangue, apresentando menor eficiência reprodutiva. É possível que esse desfecho seja devido à capacidade do hospedeiro resistente, mas não do suscetível, de produzir anticorpos que neutralizam componentes salivares do carrapato cruciais para realize a hematofagia. É necessário, portanto, examinar essa possibilidade. Os resultados obtidos também podem ajudar a identificar antígenos úteis para formular uma vacina anti-carrapato. Para estabelecer quais componentes salivares são reconhecidos pelos dois fenótipos de hospedeiros empregamos uma soroteca composta por soros obtidos de bovinos resistentes e suscetíveis ao carrapato em diferentes estágios do ciclo do parasito (larva, ninfa e adulto) e após uma, duas ou três ciclos de infestações. Os soros foram empregados individualmente e em forma de pools para imunodetecção por western blot de proteínas presentes em extrato de larvas não-alimentadas, saliva e glândulas salivares de fêmeas de R. microplus e separadas em uma e duas dimensões. Os resultados obtidos nos western blots 1D de saliva e de extrato de larvas não alimentadas mostraram que houve um reconhecimento diferencial dos antígenos parasitários pelos soros dos animais resistentes e suscetíveis. Os soros dos animais resistentes quando ainda eram livres de infestações (i.e., naïve) ou quando infestados com a forma larval reconheceram com maior freqüência e/ou exclusivamente certas bandas de proteínas. Resultados semelhantes foram vistos nos western blots de géis 2D de saliva e glândulas salivares de fêmeas, onde os soros dos animais resistentes ainda não infestados (i.e., naïve) reconheceram vários spots presentes nessas amostras e soros de animais resistentes infestados reconhecerem spots de forma exclusiva. Também foi observado que, apesar dos hospedeiros suscetíveis estarem expostos a grande quantidade de saliva, os soros desses animais não reconhecem um número maior de spots que os hospedeiros infestados resistentes. Por outro lado, a maioria das proteínas salivares não é reconhecida pelos hospedeiros infestados, sejam resistentes ou suscetíveis. Esses resultados indicam que os hospedeiros bovinos resistentes reconhecem de forma mais precoce que os bovinos suscetíveis certos componentes parasitários. Essa capacidade pode estar relacionada ao fenótipo de resistência ao carrapato / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, causes enormous losses to animal health and production. Since it is a hematophagous parasite the tick expoliates its hosts and transmits diseases. Parasitism by the tick is mediated by its saliva, which inhibits the hosts local homeostatic reactions to its bite. Hosts mount immune responses against this parasite, including antibody-mediated responses, indicating that the immunobiological control of ticks is possible. However, the pharmacological complex of saliva is composed of soluble proteins, which are known to be incapable of eliciting antibody responses if they are not introduced into the host with adjuvant or in aggregated form. Thus, salivary proteins may not be able to induce immunity in hosts. Bovines present contrasting, heritable phenotypes for tick infestations. Ticks fed on resistant hosts are unable to complete a blood meal and present a decrease in reproductive immunity. It is possible that this outcome is caused by an ability of the resistant host to produce antibodies that neutralize salivary components that are crucial to blood feeding. It is necessary, therefore, to examine this possibility. The results will also assist in the identification of protective antigens to formulate an anti-tick vaccine. In order to establish which salivary components are recognized by the two types of host phenotypes, a collection of sera derived from resistant and susceptible bovines infested one, two and three times with different developmental stages of the parasite (larvae, nymphs and adults) was employed to detect which proteins were recognized in western blots of saliva and extracts of salivary glands and unfed larvae. Western blots of tick proteins (saliva and extracts of unfed larvae) separated in one dimension showed that antigens were differentially recognized by resistant and susceptible bovines. Sera from resistant bovines still naïve or infested with larvae recognized certain protein bands exclusively or more frequently than similar sera from susceptible bovines. Similar results were seen in western blots of proteins from saliva and extracts of salivary glands separated in two dimensions, where sera from naïve, resistant bovines recognized several spots and sera from infested, resistant bovines recognized several spots exclusively. In spite of the fac that susceptible hosts are exposed to greater amounts of tick saliva, sera from these animals did not recognize a greater amount of spots than those from resistant bovines. On the other hand, the great majority of spots is not recognized by any of the different sera, be they from resistant or susceptible hosts. These results indicate that resistant bovines are able to recognize parasitic proteins earlier than susceptible bovines. This ability may, in turn, affect expression of salivary components that are crucial for the tick and may explain the phenotypes of tick infestations in bovines.

Rhipicephalus micropulus, conhecido como carrapato dos bovinos, é um dos parasitas mais importantes para a pecuária, pois causa enormes prejuízos ao produtor. Esses prejuízos se estendem desde a ação espoliativa que o carrapato exerce nos seus hospedeiros até a transmissão de uma diversidade de patógenos. Os carrapatos utilizam vários estímulos térmicos, sonoros, visuais, gustativos, táteis e olfativos na fase de busca pelo hospedeiro. Essas substâncias são conhecidas como semioquímicos e podem atuar em indivíduos de uma mesma espécie como os ferormônios ou entre indivíduos de espécies diferentes como os alomônios e cairomônios. Nos bovinos, já se sabe que uma de suas lipocalinas pode atrair insetos, porém não é sabido se essa atração ocorre para R. microplus. Já é sabido que o carrapato consegue distinguir odores liberados entre bovinos das raças Nelore e Holandês Preto e Branco (HPB), sendo mais atraído para bovinos da raça Holandês. A lipocalina por ser uma proteína globular e estar associada com o transporte de pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como odorantes e esteroides, e pode favorecer a atração do R. microplus, uma vez que essa proteína bovina pode ligar a odorantes e desempenhar um papel fundamental na liberação de odores para o ambiente, que por sua vez pode atrair, ou não, o R. microplus. Existem diferentes níveis de infestação de carrapatos entre bovinos das raças Nelore e Holandês, bem como entre os sexos da mesma raça. Além disso, o período do ciclo de vida do bovino também pode influenciar na susceptibilidade a infestação, por exemplo, as vacas no período de lactação são consideradas mais susceptíveis ao parasito. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o papel da lipocalina bovina na resistência e suscetibilidade ao carrapato, através da quantificação dessa proteína em líquidos corporais dos bovinos, tais como soro, saliva, urina, suor, secreção nasal e biopsia de pele obtidos de bovinos que apresentam fenótipos contrastantes de infestações, a saber: hospedeiros macho (touros) e fêmea (vacas em lactação) das raças resistentes (Bos indicus) e suscetíveis (Bos taurus). Os resultados deste trabalho tem demonstrado que a lipocalina bovina está presente em todos os fluídos investigados, exceto a urina, como observado por Western blot. Com os resultados deste trabalho podemos concluir que a bcOBP apresenta 9 diferença significativa nos fluidos de saliva e secreção nasal de touros e vacas em lactação da raça HPB quando comparados com touros e vacas em lactação da raça Nelore. Em amostras de biópsia de pele também ocorreu uma maior marcação da bcOBP na raça susceptível (HPB), demonstrando que a bcOBP possivelmente esta auxiliando na susceptibilidade destes bovinos ao carrapato, através do transporte de um maior número de odorantes que estariam atraindo um maior número de carrapatos. Ao analisar os fluidos entre bovinos da mesma raça, porém de sexo diferente, observou-se uma maior quantidade de bcOBP em vacas no período de lactação HPB nos fluidos de saliva e secreção nasal, visto que as vacas estão no período de lactação e são mais susceptíveis a infestações. Consequentemente, a bcOBP poderia estar colaborando para a sua maior susceptibilidade quando comparadas com touros HPB, e o mesmo ocorreu para biopsia de pele. Porém no fluído soro o aumento foi significativo para touro HPB quando comparado às vacas em lactação da raça HPB. Acredita-se que esse fenômeno ocorra devido ao período de lactação nas fêmeas uma vez que a produção da lipocalina bovina esta intimamente relacionada com a produção do leite. Os resultados deste trabalho demonstram que possivelmente a bcOBP na raça HPB está carreando odorantes para o ambiente os quais estariam atraindo mais carrapatos, e auxiliando na susceptibilidade destes bovinos. / Rhipicephalus micropulus, known as bovine tick, is one of the most important parasites for livestock, as they cause enormous damage to the producer. These demages extend from the spoliation action that the tick exerts on the skin of its hosts until the transmission of a diversity of pathogens. Ticks use various thermal, sound, visual, gustatory, tactile and olfactory stimuli in the search phase to the host. These substances are known as semiochemicals and can act within individuals of the same species as the pheromones or among individuals of different species such as alomones and cairomones. In the cattle, it is known that the lipocalin protein may attract insects, but this attraction is not known to influence the R. microplus. It is known that the tick can distinguish released odors between Nelore and Holstein cattle, being more attracted to cattle of the Holstein breed. Lipocalin, being a globular protein and associated with the transport of small hydrophobic molecules, such as odorants and steroids, can favor the attraction of R. microplus, since this bovine protein can bind to odorants and play a key role in the release of odors into the environment, which in turn may or may not attract R. microplus. There are different levels of tick infestation among cattle of the Nelore and Holstein breeds, as well as between the sexes of the same breed. In addition, the life cycle period of the bovine can also influence the susceptibility to infestation. For example, cows in the lactation period are considered more susceptible to the parasite. Thus, the objective of the present study was to evaluate the role of bovine lipocalin in the resistance and susceptibility to tick by quantifying that protein in bovine body fluids such as serum, saliva and urine, sweat, nasal secretions and skin biopsies obtained from resistant (Bos indicus) and susceptible (Bos taurus) cattle breeds. The results of this work have demonstrated that bovine lipocalin is present in all investigated fluids except urine, as observed by Western Blot. With the results of this work we can conclude that bcOBP presents a significant difference in fluids saliva and nasal secretion of bulls and cows in lactation breed HPB when compared to bulls and lactating cows of the Nelore breed. In skin biopsy specimens, there was also a greater labeling of bcOBP in the susceptible strain (HPB), which could then aid in the susceptibility of these cattle to the 11 tick, by transporting a larger number of odorants that would be attracting a greater number of ticks. When analyzing the fluids between bovines of the same breed, but of different sex, a greater amount of bcOBP was observed in cows during the period of HPB lactation in the fluids saliva and nasal secretion, since the cows are in the lactation period and are more susceptible to infestations. Consequently, bcOBP could be contributing to its greater susceptibility when compared to HPB bulls, and the same was done for skin biopsy. However, in the fluid serum, the increase was significant for the bull when compared to the lactating cows of the HPB race. It is believed that this phenomenon occurs due to the lactation period in females since the production of bovine lipocalin is closely related to milk production. The results of this work demonstrate that possibly Lipocalin in Holstein cattle is carrying odorants to the environment which would be attracting more ticks, and enhancing in the susceptibility of these cattle.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-16T18:15:18Z No. of bitstreams: 1 valeriademello.pdf: 1398962 bytes, checksum: 8f98bff81bd61634bb2f3b2081f6a2db (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T12:40:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 valeriademello.pdf: 1398962 bytes, checksum: 8f98bff81bd61634bb2f3b2081f6a2db (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T12:40:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 valeriademello.pdf: 1398962 bytes, checksum: 8f98bff81bd61634bb2f3b2081f6a2db (MD5) Previous issue date: 2014-07-21 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O carrapato dos bovinos, Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini 1887) é responsável por sérios prejuízos à pecuária brasileira, considerando-se os custos do controle, perda de receita devido a menor produção de leite e carne, danos ao couro, além da transmissão de doenças. A utilização de plantas medicinais é considerada uma alternativa a resistência recorrente aos produtos químicos. Diante da necessidade de alternativas eficazes e com menores impactos ambientais o objetivo desse estudo foi desenvolver formulações de contato contendo os óleos essenciais das plantas Citronela-de-Java (Cymbopogon winterianus), Cravo-da-índia (Syzygium aromaticum) e Alecrim-da-horta (Rosmarinus officinalis) e avaliar in vitro os efeitos acaricidas em diferentes etapas do ciclo do carrapato. Para tanto foram utilizadas concentrações que variaram de 0,5 – 15,0% dos óleos essenciais incorporados nas formulações. Os carrapatos provenientes de diferentes regiões geográficas foram tratados com as formulações e avaliados os efeitos das mesmas sobre o índice de produção de ovos, a eclosão larval e a eficácia carrapaticida. Os resultados obtidos foram comparados com produtos acaricidas comerciais. Após o 20º dia do tratamento as formulações contendo o óleo essencial de citronela tiveram eficácia acaricida entre 2,09 – 55,51%, com o óleo essencial de cravo-da-índia, 92,47 - 100% e 26,44 - 40,78% com o óleo essencial de alecrim. Na associação dos óleos essenciais obteve-se eficiência de 84,68 – 90,73% para a associação do cravo-da-índia com o óleo essencial de citronela e 30,54 – 64,25% na associação de citronela com o alecrim. Os resultados demonstraram a atividade carrapaticida das formulações testadas, quando comparadas com os produtos químicos utilizados pelos produtores. Estudos in vivo necessitam ser realizados para validar a eficiência das formulações em condições de campo, visando a utilização desses produtos como uma alternativa para o controle do carrapato bovino. / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini 1887) is responsible for serious losses to Brazilian cattle, considering the costs of control, loss of revenue due to lower production of milk and meat, leather damage, beyond the transmission of diseases. The use of medicinal plants is considered an alternative to the applicant chemical resistance. Facing the necessity to effective alternatives with lower environmental impacts, the objective of this study was to develop contacts´ formulations containing essential oils of Citronella (Cymbopogon winterianus), Clove (Syzygium aromaticum) and Rosemary (Rosmarinus officinalis) plants and evaluate in vitro acaricidal effects on different stages of the cycle of the tick. For this purpose, concentrations were used ranging from 0.5 - 15.0% of essential oils incorporated into the formulations. Ticks from different geographic regions were treated with the formulations and their effects on the rate of egg production, larval hatching and its efficiency on ticks were evaluated. The results were compared with chemistry acaricidal products. After the 20th day of treatment formulations containing the citronella´s essential oil had acaricidal efficacy between 2.09 to 55.51 %, with the clove´s essential clove, 92.47 to 100% and 26.44 to 40,78 % with rosemary´s essential oil. The association of clove essential oil with citronella essential oil obtained efficiency from 84.68 to 90.73% and for the association of citronella oil with rosemary oil, was 30.54 to 64.25%. The results showed the acaricidal activity of the tested formulations when compared to the chemicals acaricidal products. In vivo studies need to be conducted to validate the efficiency of the formulations under field conditions in order to use these products as an alternative for the control of cattle tick.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-13T14:16:38Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Elen Regozino Muniz - 2015.pdf: 5452848 bytes, checksum: 01e704bb99491be79de20d410d521a0f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-13T14:18:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Elen Regozino Muniz - 2015.pdf: 5452848 bytes, checksum: 01e704bb99491be79de20d410d521a0f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-13T14:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Elen Regozino Muniz - 2015.pdf: 5452848 bytes, checksum: 01e704bb99491be79de20d410d521a0f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-04-01 / Rhipicephalus microplus, known as tick of the cattle, cause great economic losses each year in Brazil. Entomopathogenic fungi stand out as an alternative to the exclusive control and indiscriminate use of the chemical. However, ambient temperature above the threshold considered optimal for these organisms can interfere with your biology, and compromise their development and effectiveness. In the present study evaluated biological parameters seven strains of Metarhizium spp. (IP1, IP34, IP46, IP60, IP119, IP125 and IP146) originated from the Central Brazil, incubated at 32 ± 0.5°C or 27 ± 1°C. In addition, the virulence was assessed for each strain of R. microplus engorged females. IP119, Metarhizium anisopliae s.s., was selected among the other isolates for virulence tests against R. microplus submitted with stressful temperature condition (32 ± 0.5°C) or low relative humidity (RH = 75%) to present considerable heat tolerance and virulence in the screening tests. Tests with conidia formulated in oil-water emulsion (liquid vaseline 5%), carboxymethylcellulose gel or emulgel 5% were conducted to evaluate the conidial thermotolerance when exposed to 45°C for 4 hours or 6 hours, and to test the efficacy of formulated to control engorged female R. microplus the stressful conditions of temperature (32°C) and low humidity (RH = 75%). It was concluded that a constant temperature of 32°C or exposure for a few hours at 45°C is stressful condition for the isolates. The conidia IP119 when bathed in liquid vaseline jelly were more tolerant of exposure to 45°C for 4 hours. IP119 was shown to be virulent for engorged female R. microplus, being the oil-water emulsion 5% of the most effective formulation. / Rhipicephalus microplus, conhecido como carrapato-dos-bovinos, causa grandes percas econômicas por ano no Brasil. Fungos entomopatogênicos se destacam como controle alternativo ao uso exclusivo e indiscriminado do químico. Contudo, a temperatura ambiente acima do limiar considerado ótimo para estes organismos pode interferir na sua biologia, e comprometer seu desenvolvimento e eficácia. No presente estudo foram avaliados parâmetros biológicos de sete linhagens de Metarhizium spp. (IP1, IP34, IP46, IP60, IP119, IP125 e IP146), originados do cerrado do Centro-Oeste brasileiro, incubados a 32±0,5°C ou 27±1°C. Além disso, foi avaliada a virulência de cada linhagem para fêmeas ingurgitadas de R. microplus. Metarhizium anisopliae s.s., IP119, foi selecionado dentre os demais isolados para os testes de virulência contra R. microplus submetidos a com condição de temperatura estressante (32±0,5°C) ou em baixa umidade relativa (UR=75%) por apresentar notável tolerância ao calor e virulência nos testes de triagem. Testes com os conídios formulados em emulsão óleo-água (vaselina líquida 5%), gel carboximetilcelulose ou emulgel 5% foram realizados para avaliar a termotolerância dos conídios quando expostos a 45°C por 4 ou 6 horas, e testar a eficácia dos formulados para o controle de fêmeas ingurgitadas de R. microplus nas condições estressantes de temperatura (32°C) e umidade baixa (UR=75%). Concluiu-se que a constante temperatura de 32°C ou a exposição por poucas horas a 45°C foi condição estressante para os isolados estudados. Os conídios de M. anisopliae s.s. (IP119) quando banhados em emulsão óleo-água 5% foram mais tolerantes em exposição a 45°C por 4 horas. M. anisopliae s.s. (IP119) mostrou ser virulento para fêmeas ingurgitadas de R. microplus, tendo sido a emulsão óleo-água 5% a formulação mais eficaz.

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-07-12T17:47:16Z No. of bitstreams: 2 Carla_Fernandez2014.pdf: 1291543 bytes, checksum: 6cd6209240711c8d9c664256a72280c8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-12T17:47:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Carla_Fernandez2014.pdf: 1291543 bytes, checksum: 6cd6209240711c8d9c664256a72280c8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-12-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Laurus nobilis L. is a tree belonging to the family Lauraceae, native to Asia and cultivated in the South and Southeast of Brazil as an ornamental plant, popularly known as laurel. The essential oil was extracted by hydrodistillation in a Clevenger apparatus for 2 hours. The essential oil was fractionated in a chromatographic column to obtain the fractions. The essential oil and fractions were identified by GC/MS. Was mensured the content of phenolic compounds of essential oil and fractions, and antioxidant activity by the DPPH sequestration method, antimicrobial activity against the strains: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 and ATCC 70603, Proteus mirabilis ATCC 7002, Pseudomonas aeruginosa 27853 and Staphylococcus aureus ATCC 25923, yeasts Candida albicans ATCC 18804, Candida krusei ATCC 20298, Candida parapsilosis ATCC 20019, Candida tropicalis ATCC 750, Cryptococcus gattii L21 / 01 and Cryptococcus neoformans H99, and the filamentous fungi Aspergillus niger IC (clinical isolate), Aspergillus flavus IMI 190443, Aspergillus fumigatus ATCC 16913 by the diffusion test on agar. The minimal inhibitory concentration (MIC) of the sensitive strains was determined by the broth dilution method. And the acaricidal activity against Rhipicephalus microplus by the test of immersion of females and larval, the larvicidal activity against Aedes aegypti by the test of larval immersion. Twenty compounds were identified in the essential oil with 99.01% of the identified peak areas. The major component of the essential oil was the 1.8-cineole with 34.01%. The essential oil of laurel presented 17.57 μg of gallic acid / mg of essential oil of phenolic compounds and showed antioxidant activity by the DPPH method with IC50 of 15.52 mg/mL and the fractions CH2Cl2:C6H14 (8: 2) 9, 96 mg/mL and CH2Cl2: C6H14 (7: 3) 3.65 mg/mL. The essential oil and the CH2Cl2: AcOEt (9:1) fraction showed antibacterial activity against the bacteria Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Proteus mirabilis and antifungal activity against strains of Candida albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis and Cryptococcus gattii and C. neoformans with minimum inhibitory concentration (MIC) values between 10.00 and 0.31 mg/mL. In relation to the acaricide activity, the immersion test of engorged females of R. microplus had a decrease in egg mass, egg production index and egg viability were affected in the different concentrations of essential oil in relation to the control group. On the larvae of the tick, the essential oil presented LC50 of 3.52 μL/mL and LC99 of 5.94 μL/mL, among the fractions to CH2Cl2: AcOEt (8:2) was the most active with LC50 of 0.13 μL/mL and LC99 of 0.51 μL/mL and the essential oil presented on larvae of A. aegypti LC50 of 0.38 μL/mL and LC99 of 0.48 μL/mL. Therefore, it can be concluded that the essential oil has antioxidant, antimicrobial, acaricidal and larvicidal action on R. microplus and A. aegypti, and that the fractionation was of great importance for the identification of compounds with biological activity. / O Laurus nobilis L. é uma árvore pertencente à família Lauraceae, nativa da Ásia e cultivado no Sul e Sudeste do Brasil como uma planta ornamental, conhecido popularmente como louro. O óleo essencial foi extraído por hidrodestilação em aparelho de Clevenger por 2 horas. O óleo essencial foi fracionado em coluna cromatográfica para a obtenção das frações. O óleo essencial e as frações foram identificados por CG/EM. Foi mensurado o teor de compostos fenólicos do óleo essencial e das frações, e atividade antioxidante pelo método de sequestro do DPPH, atividade antimicrobiana frente as cepas: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e ATCC 70603, Proteus mirabilis ATCC 7002, Pseudomonas aeruginosa 27853 e Staphylococcus aureus ATCC 25923, as leveduras Candida albicans ATCC 18804, Candida krusei ATCC 20298, Candida parapsilosis ATCC 20019, Candida tropicalis ATCC 750, Cryptococcus gattii L21/01 e Cryptococcus neoformans H99, e os fungos filamentosos Aspergillus niger IC (isolado clínico), Aspergillus flavus IMI 190443, Aspergillus fumigatus ATCC 16913 de pelo teste de difusão em ágar. Foi determinada da concentração mínima inibitória (CIM) das cepas sensíveis pelo método de diluição em caldo. E a atividade acaricida frente ao Rhipicephalus microplus pelo teste de imersão de fêmeas e larval, a atividade larvicida frente ao Aedes aegypti pelo teste de imersão larval. Foram identificados 20 compostos do óleo essencial com 99,01% das áreas dos picos identificados. O composto majoritário do óleo essencial foi o 1.8-cineol com 34,01%. O óleo essencial de louro apresentou 17,57μg equivalentes de ácido gálico/mg de óleo essencial de compostos fenólicos e mostrou atividade antioxidante pelo método DPPH com IC50 de 15,52 mg/mL e as frações CH2Cl2:C6H14(8:2) 9,96 mg/ mL e CH2Cl2:C6H14(7:3) 3,65 mg/mL. O óleo essencial e a fração CH2Cl2:AcOEt (9:1) mostraram atividade antibacteriana contra as bactérias Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis e atividade antifúngica contras cepas de Candida albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis e Cryptococcus gattii e C. neoformans com valores de concentração mínima inibitória (CIM) entre 10,00 e 0,31mg/mL. Em relação a atividade acaricida, o teste de imersão das fêmeas ingurgitadas de R. microplus houve redução da massa dos ovos, índice de produção de ovos e a viabilidade dos ovos foram afetados nas diferentes concentrações do óleo essencial em relação ao grupo controle. Sobre as larvas do carrapato o óleo essencial apresentou LC50 de 3,52 μL/mL e LC99 de 5,94 μL/mL, dentre as frações a CH2Cl2:AcOEt (8:2) foi a mais ativa com LC50 de 0,13 μL/mL e LC99 de 0,51 μL/mL E o óleo essencial apresentou sobre as larvas de A. aegypti LC50 de 0,38 μL/mL e LC99 de 0,48 μL/mL. Portanto, pode concluir que o óleo essencial possui ação antioxidante, antimicrobiana, acaricida e larvicida sobre o R. microplus e A. aegypti, e que o fracionamento foi de grande importância para a identificação de compostos com atividade biológica.

La babésiose canine est une maladie parfois mortelle due a des protozoaires des genres Babesia et Theileria transmis par des tiques dont Rhipicephalus sanguineus. Malgré la présence soutenue de R. sanguineus dans le Sud de la France, son rôle dans la transmission de la maladie dans cette région reste incertain. D'autre part, le statut taxonomique de R. sanguineus reste confus et mérite d'être clarifié. Les objectifs de ce travail ont été de caractériser (i) les tiques R. sanguineus s.l. parasitant les chiens dans différentes régions du Sud de la France, (ii) les espèces des genres Babesia/Theileria potentiellement transmises par ces tiques et (iii) l'impact des variations génétiques et/ou des co-infections sur la compétence vectorielle. Au total 140 sangs de chien et 242 tiques R. sanguineus s.l. ont été récoltées et analysées entre 2010 et 2012 par PCR, PCR-RFLP et séquençage. De l'ADN de B. vogeli et B. canis a été détecté dans 13,6% et 12,9% des chiens et dans 10,7% et 1,7% des tiques respectivement avec, parfois, des prévalences significativement différentes entre les régions. Un seul chien a été détecté porteur d'ADN de T. annae. Des comparaisons phylogénétiques et phylogéographiques de séquences de R. sanguineus (ADNr-mt 12S et 16S) et B. vogeli (ARNr 18S) à l'échelle mondiale ont confirmé l'affiliation des tiques de France aux R. sanguineus des régions « tempérées » et suggèrent l'existence d'une coévolution entre le protozoaire et son vecteur. Ce travail apporte de nouvelles connaissances sur la babésiose canine en France et supporte l'existence d'au moins deux populations au sein du groupe sanguineus pouvant présenter des compétences vectorielles différentes / Study on Rhipicephalus sanguineus sensu lato ticks and their potential role in the transmission of canine babesiosis in France: prevalence of parasite infections, vector genetic diversity and epidemiology. Canine babesiosis is a potentially fatal disease caused by protozoa of the genera Babesia and Theileria transmitted by ticks including Rhipicephalus sanguineus. Although R. sanguineus is a major tick species in southern France, its role in the transmission of the disease in this area remain unknown. Moreover, the taxonomic status of R. sanguineus is controversial and needs to be clarified. The aims of this work were to characterize (i) the ticks R. sanguineus s.l. that parasitize dogs in different areas of southern France, (ii) the Babesia/Theileria species potentially transmitted by these ticks in this area and (iii) the impact of genetic variations and/or co-infections on vector competence. A total of 140 dog bloods and 588 R. sanguineus s.l. were collected from 2010 to 2012 from which all dogs bloods and 242 ticks were screened using specific PCR, PCRRFLP and sequencing. B. vogeli and B. canis DNA were evidenced in 13.6% and 12.9% of dogs and in 10.7% and 1.7% of R. sanguineus ticks respectively with sometimes significant prevalence differences between areas. A single case of T. annae infection was detected in a dog. Phylogenetic and phylogeographic analyzes performed at a global scale on 12S and 16S mt-rDNA for ticks and 18S rDNA for B. vogeli confirmed the affiliation of R. sanguineus from France with “temperate” species and suggested the existence of a coevolution process between the pathogen and its vector. This work provides new information on the epidemiology of canine babesiosis in France and supports the existence of at least two populations in the R. sanguineus group in the world with possible different vector competences

L’Afrique de l’Ouest subit l'invasion rapide de la tique du bétail associée aux plus fortes pertes économiques au monde : Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Cette tique a été accidentellement introduite au Bénin et en Côte d’Ivoire en 2006. En 2011, des éleveurs burkinabés se plaignent de l’impossibilité de contrôler de très fortes infestations de leurs troupeaux par des tiques (entrainant morbidité et perte de poids du bétail) : il s’agit de R. microplus. Cette thèse poursuit deux objectifs clefs pour la détermination de mesures de protection de la santé du bétail. Le premier consiste à comprendre les mécanismes mis en jeu dans cette invasion par les outils de génétique des populations (e.g. tests de l’existence de couloirs d’invasions privilégiés; structure génétique des populations de tiques, estimations de tailles de populations entre zones d’introduction et front d’invasion ; distance de flux géniques par génération de tique). Le couplage de ces informations avec celles des niveaux de résistances aux acaricides utilisables en élevage permettront d’évaluer les stratégies de contrôles les plus à mêmes d’enrayer cette invasion. Le second consiste à anticiper l’impact de cette invasion sur l’épidémiologie de pathogènes vectorisés par les tiques du bétail. Il s’agira d’abord ici d’évaluer l’impact de la présence/absence de R. microplus (vectrice entre autres de Babesia bovis, B. bigemina ou Anaplasma marginale) sur la communauté autochtone de tiques du bétail. / West Africa is undergoing fast spread of the cattle tick associated with highest economic losses worldwide: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, which was accidentally introduced in Benin and Côte d'Ivoire in early 2000s. In 2011, Burkinabe farmers complain about the impossibility of controlling very large infestations of their cattle by ticks (causing morbidity and loss of livestock weight): results of R. microplus infestation. This thesis has two key objectives for the determination of animal health protection measures. The first is to understand the mechanisms involved in this invasion by population genetic tools (e.g. tests of the existence of privileged invasions corridors, genetic structure of tick populations, population size estimates between introduction areas and invasion front, distance of gene flow by tick generation). Coupling these informations with those of resistance to the common acaricides used in farming will allow assessing of the most control strategies to stop current invasion. The second is to anticipate the impact of the invasion on the epidemiology of pathogens vectored by cattle ticks. It will be here first to assess the impact of the presence / absence of R. microplus (vector of Babesia bovis, B. bigemina and Anaplasma marginale) on the native cattle ticks’ communities.

Diversas linhagens de células de carrapatos já foram estabelecidas em outras regiões do mundo para isolamento de patógenos. O objetivo deste estudo é obter cultivos de células de Rhipicephalus sanguineus para testar o crescimento de alguns bioagentes. O primeiro capítulo trata do estabelecimento da linhagem celular e o segundo, do uso da linhagem como substrato para infecção de patógenos. Ovos de R. sanguineus foram preparados em meio L-15B e mantidos à 30 °C. Quando as células se tornaram confluentes, as culturas foram propagadas e criopreservadas. O descongelamento foi bem sucedido a partir da terceira passagem e a identidade celular foi confirmada por sequenciamento utilizando o fragmento 16S rDNA mitocondrial. As células foram infectadas com Erhlichia canis, Leishmania infantum chagasi e Trypanosoma cruzi, sendo eficientes somente para E. canis. / Several lines of embryonic cells of ticks already been established in other regions of the world, and are used to isolate and propagate pathogens. The aim of this study, is to obtain cell cultures from Rhipicephalus sanguineus to test the growth of some bioagents.The first addressing consists of the establishment of the cells and the second, using the cell lineage as a substrate for the pathogens infection. The egg masses of R. sanguineus were prepared in L-15B medium and cultures were maintained at 30 °C. When a confluent cellular monolayer was obtained, the cultures were passaged and frozen. Defrosting of cryopreserved cultures from the third passage was successful. Cell identity was confirmed by sequencing using 16S rDNA gene fragment. Cells were infected with Erhlichia canis, Leishmania infantum chagasi and Trypanosoma cruzi. Only for E. canis the cells of R. sanguineus were effective as a substrate for growth of this pathogen.

O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal vetor da riquétsia Anaplasma marginale, o agente etiológico da anaplasmose, uma doença que acomete os rebanhos e causa sérios prejuízos econômicos à pecuária no Brasil. Estabelecemos em nosso laboratório o cultivo da linhagem de células BME26 que são originárias do R. (B.) microplus e também a infecção dessas células por A. marginale, um patógeno que é naturalmente transmitido pelo carrapato. Detectamos que a expressão gênica da defensina e da ixodidina nas células é aumentada frente à infecção por A. marginale, embora nenhuma alteração da expressão gênica da microplusina foi constatada. As células foram expostas a microorganismos inativados por calor e LPS, sendo que a expressão gênica da microplusina é aumentada frente a todos os estímulos. Na exposição das células BME26 com a bactéria Microccocus luteus, a expressão gênica da defensina e da ixodidina não foi alterada e no estimulo com leveduras a expressão gênica da ixodidina foi reprimida. Frente à infecção por A. marginale detectamos, aumento expressão da defensina e ixodidina. Os genes da microplusina e defensina foram silenciadas por RNAi em células infectadas por A. marginale, mas não houve alteração no número de riquétsias / The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of the rickettsia Anaplasma marginale, the etiological agent of anaplasmosis, a disease that affects cattle and causes serious economic losses to the Brazilian cattle industry. We established in our laboratory the embryonic cell culture line BME26 from R. (B.) microplus and infection by A. marginale, a pathogen naturally transmitted by R. (B.) microplus. We verified that defensin and ixodidin gene expression increased in these cells after an infection by A. marginale and no alteration in microplusin gene expression was detected. The BME26 cells were exposed to heat-inactivated microorganims or to LPS, microplusin gene expression increased after all stimuli. After exposure of BME26 cells to Micrococcus luteus, expression levels of defensin and ixodidin did not change and ixodidin gene expression reduced after exposure of these cells to yeast. In the infection by A. marginale we detected defensin and ixodidin gene expression. Also, microplusin and defensin genes were silenced by RNA interference (RNAi) in A. marginale-infected BME26 cells, but we did not observe alteration in the number of MSP4 rickettsias

Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que parasitam vertebrados e transmitem uma grande variedade de agentes infecciosos para o homem e animais domésticos. Cobaias, diferentemente de cães e camundongos, são capazes de desenvolver resistência a carrapatos Rhipicephalus sanguineus após sucessivas infestações. Ao comparar o tipo de resposta imune desenvolvida por cobaias e cães frente a carrapatos observou-se que cobaias re-infestadas desenvolvem uma pequena reação de hipersensibilidade imediata e uma forte reação de hipersensibilidade tardia à inoculação cutânea com antígenos de carrapatos. Já em cães e camundongos, é notada somente uma forte reação de hipersensibilidade imediata. Também foi verificado que células dos linfonodos de cobaias infestadas três vezes com carrapatos (resistentes) proliferam intensamente na presença de saliva de carrapatos, diferentemente do que ocorre com células de cães e camundongos re-infestados (suscetíveis) que não proliferam. Esses achados sugerem o envolvimento de um padrão Th1 de resposta imune na aquisição de resistência, no entanto essa hipótese ainda não foi confirmada. Assim sendo, no atual trabalho procurou-se verificar a expressão de mRNA de citocinas na pele e linfonodos de cobaias infestadas e re-infestadas com carrapatos. Para tal foram delineados primers e padronizadas reações de PCR para detectar a expressão de mensagem das citocinas IL-12p40, IFN-gama e TNF-alfa, pertencentes a um padrão Th1, e IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-beta, pertencentes a um padrão Th2 de resposta imune. Os resultados obtidos demonstraram que cobaias sucessivamente infestadas apresentaram um aumento significativo na intensidade de mensagem para IL-12p40 nos linfonodos, tanto comparado com animais uma vez infestados (aumento de 2,6 vezes), quanto comparado com os controles (aumento de 13 vezes). Embora a análise estatística não tenha apontado uma diferença significativa houve elevação consistente na intensidade de mRNA para IFN-gama nos linfonodos de cobaias re-infestadas comparadas às infestadas apenas uma vez (aumento de 2,4 vezes). Também foi observado um aumento significativo na intensidade da mensagem para IL-5 nos linfonodos de cobaias infestadas uma vez quando comparadas aos controles (aumento de 5 vezes). Não foi detectada expressão de mensagem para IL-4 e IL-10 nas amostras analisadas. Já a expressão de mensagem para TGF-beta foi observada em todos os animais (experimentais ou controles), sugerindo que essa citocina possa ter uma expressão constitutiva em cobaias. Tomados em conjunto, os resultados sugerem o envolvimento predominante de um perfil de citocinas de padrão Th1 na aquisição de resistência em cobaias a carrapatos. Nossos resultados poderão auxiliar o desenvolvimento de novas abordagens para o controle de carrapatos, como, por exemplo, sugerir adjuvantes mais adequados a serem utilizados em vacinas anti-carrapatos. O conhecimento gerado não se restringe à indução de proteção contra carrapatos como também a possibilidade de aumentar a resistência de hospedeiros a patógenos transmitidos por carrapatos que poderiam ser controlados por uma resposta tipo Th1. / Ticks are hematophagous arthropods of cosmopolitan distribution and are significant vectors of several diseases for humans and animals. Guinea pigs, unlike dogs and mice, develop resistance to Rhipicephalus sanguineus ticks after successive infestations. When the immune reaction between tick-infested guinea pigs and dogs/mice are compared, guinea pigs develop both immediate and strong delayed type hypersensitivity reactions while dogs and mice develop only a strong immediate reaction. Additionally was shown that lymph node cells from tick-infested guinea pigs (resistant hosts) proliferate intensely when cultured with tick saliva, differently to what is observed with cells from tick-infested dogs and mice (susceptible hosts). These findings propose the contribution of a Th1 cytokine pattern on the acquired immune response to ticks; however this hypothesis still has to be tested. This being so, in this study we investigated the expression profile of genes coding for selected cytokines on R. sanguineus infested guinea-pigs. Messenger RNA for IL-12-p40, IFN-gamma and TNF-alfa (Th1 cytokine pattern) and IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-beta (Th1 cytokine pattern) was measured in skin and lymph nodes biopsies from tick-infested guinea pigs. Our results demonstrated that repeatedly tick-infested guinea pigs presented a significant increase on the intensity of message for IL-12p40 in the lymph nodes compared to both, one time tick-infested guinea pigs (raise of 2.6 times) or controls (raise of 13 times). Although the statistical analysis did not point out differences, there was a consistent increase on the mRNA intensity for IFN-gamma on the lymph nodes from re-infested guinea pigs compared to one time tick-infested animals (raise of 2.4 times). In addition, a significant enhance on the intensity of message for IL-5 on the lymph nodes from one time tick-infested guinea pigs compared to the controls (raise of 5 times). No message for IL-4 and IL-10 was detected on the analyzed tissues. In contrast, TGF-beta was detected on tissues collected from all animals (experimental or controls), suggesting a spontaneous production of this cytokine in guinea pigs. Taken together, these data suggest that a T helper 1-type pattern of cytokine production might be associated with the resistance expressed by guinea-pigs to ticks. Moreover, our results can provide new approaches to control ticks, i.e. suggest adjuvants to be added to anti-tick vaccines that preferably induce a Th1-type of response.