A oviposição é um estágio vulnerável do ciclo de vida de carrapatos. Rhipicephalus microplus, como todos Ixodidae e Argasidae, possui uma glândula especializada, o órgão de Gené, que produz uma cera que é depositada na superfície do ovo durante a oviposição. Além de restringir a perda excessiva de água, a cera atua como uma barreira contra o ataque de organismos invasores. Em R.microplus, como em outros carrapatos, há poucos estudos demonstrando atividade antimicrobiana em ovos. Ainda mais, não há na literatura relato de atividade antibiofilme em ovos de carrapatos e nem mesmo em qualquer outro artrópode. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese da existência de mecanismos de defesa em ovos de R. microplus contra biofilmes bacterianos. O extrato água/metanol da cera dos ovos apresentou atividade contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa sem afetar a sua viabilidade. Esse extrato também demonstrou efeito antibiótico contra Staphylococcus epidermidis. Nós identificamos a molécula com ambas atividades (antibiofilme e antibiótica) como N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucina (boophiline). Na busca por possíveis mecanismos responsáveis pelo efeito antibiofilme de boophiline contra P. aeruginosa, 14 genes foram analisados por qRT-PCR. Boophiline inibe a expressão de fliC (flagelo) e cdrA (componente estrutural da matriz), cujos produtos são necessários para a formação do biofilme de P. aeruginosa. Monosfosfato de guanosina dimérico cíclico (c-di-GMP) é um importante segundo mensageiro característico de bactérias Gram-negativas. Altos níveis intracelulares de c-di-GMP promovem o estilo de vida séssil enquanto baixos níveis induzem o comportamento móvel. De acordo com essa afirmação, nós encontramos que boophiline aumenta a motilidade swarming de P. aeruginosa. Desta forma, nos questionamos se o mecanismo de ação de boophiline estaria envolvido com c-di-GMP já que o sistema quorum sensing não foi afetado pela molécula. Interessantemente, quando os níveis de c-di-GMP foram aumentados pela superexpressão de uma diguanilato ciclase, boophiline não inibiu efetivamente a formação de biofilme. Uma explicação para esse resultado é que boophiline interfere em uma via específica regulada por c-di-GMP, o que explicaria não termos obtido um decréscimo no nível total deste segundo mensageiro. Contrariamente, boophiline foi bactericida contra S. epidermidis. Mudanças morfológicas significativas foram observadas em células tratadas com a molécula, as quais foram severamente danificadas. Boophiline levou a formação anormal de septo, rompimento da membrana bacteriana e extravasamento do material intracelular. Adicionalmente avaliamos o potencial antibiofilme e anti-protozoário de filtrados de cultura obtidos de bactérias isoladas de tecidos de R. microplus. Quatorze filtrados de cultura bacteriano apresentaram notável atividade contra o biofilme de P. aeruginosa e S. epidermidis e foram citotóxicos contra Tritrichomonas foetus. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de proteção contra biofilmes em ovos de carrapatos bem como de bactérias associadas a carrapatos como produtoras de moléculas bioativas. Além disso, nós demonstramos que boophiline é uma nova molécula antibiofilme, sendo a primeira vez relatado na literatura que um composto age inibindo cdrA. Os dados obtidos em nosso estudo poderiam estimular novas abordagens em áreas como fisiologia e controle de artrópodes, genética e fisiologia de microrganismos e controle de biofilmes. / The oviposition is a vulnerable stage of the tick life cycle. Rhipicephalus microplus, as all Ixodidae and Argasidae, has a specialized gland, the Gene’s organ, which produce a wax that is smeared on egg surface during oviposition. In addition to restricting excessive water loss, wax acts as a barrier to attack by invading organisms. In R. microplus, as in other ticks, there are few studies showing antimicrobial activity in eggs. Moreover, there is no report of antibiofilm activity in tick eggs nor in any other arthropod. The objective of our study was to evaluate the hypothesis of the existence of defense mechanisms against bacterial biofilms in R. microplus eggs. The eggs wax water/methanol extract showed activity against Pseudomonas aeruginosa biofilm without affecting its viability. This extract also presented an antibiotic effect against Staphylococcus epidermidis. We have identified the molecule anti-biofilm and antibiotic as N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucine (boophiline). In the search for possible mechanisms responsible by antibiofilm effect of boophiline against P. aeruginosa, 14 genes were evaluated by qRT-PCR. We showed that boophiline inhibits the expression of fliC (flagellum) and cdrA (matrix structural component), whose products are necessary for biofilm formation in P. aeruginosa. Bis-(3’–5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is an important second messenger, characteristic of Gram-negative bacteria. High intracellular levels of c-di-GMP promote a sessile mode of growth, while low levels promote motile behavior. In line with this, we found that boophiline increases swarming motility, which raised the question whether it acts by altering c-di-GMP levels. Interestingly, when c-di-GMP levels were increased by overexpression of a diguanilate cyclase, boophiline no longer inhibited biofilm formation. One explanation for these results is that boophiline interferes with a specific c-di-GMP-regulated pathway, which would explain we have not obtained a decrease in the total level of this second messenger. Conversely, boophiline had a bactericidal effect against S. epidermidis. Significant morphological changes were observed in the boophiline-treated cells, which appeared to be severely damaged. Boophiline was found to cause abnormal septum formation, bacterial membrane disruption, and extravasation of intracellular material. Additionally, our work also aimed to evaluate the potential antibiofilm and anti-protozoa of culture filtrates obtained from bacteria isolated of R. microplus tissues. Fourteen bacterial culture filtrates showed remarkable activity against of P. aeruginosa and S. epidermidis biofilms, and were cytotoxic against Tritrichomonas foetus. Our work is pioneer in demonstrating the existence of protection mechanisms in tick eggs against biofilms, and ticks-associated bacteria as producers of bioactive molecules. Furthermore, we demonstrated that boophiline is a new antibiofilm molecule, and is the first reported in the literature that a molecule inhibits cdrA. The data obtained in our study could stimulate new approaches in areas such as the physiology and control of arthropods, the genetics and physiology of microorganisms, and biofilm control.

Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que parasitam vertebrados e transmitem uma grande variedade de agentes infecciosos para o homem e animais domésticos. Cobaias, diferentemente de cães e camundongos, são capazes de desenvolver resistência a carrapatos Rhipicephalus sanguineus após sucessivas infestações. Ao comparar o tipo de resposta imune desenvolvida por cobaias e cães frente a carrapatos observou-se que cobaias re-infestadas desenvolvem uma pequena reação de hipersensibilidade imediata e uma forte reação de hipersensibilidade tardia à inoculação cutânea com antígenos de carrapatos. Já em cães e camundongos, é notada somente uma forte reação de hipersensibilidade imediata. Também foi verificado que células dos linfonodos de cobaias infestadas três vezes com carrapatos (resistentes) proliferam intensamente na presença de saliva de carrapatos, diferentemente do que ocorre com células de cães e camundongos re-infestados (suscetíveis) que não proliferam. Esses achados sugerem o envolvimento de um padrão Th1 de resposta imune na aquisição de resistência, no entanto essa hipótese ainda não foi confirmada. Assim sendo, no atual trabalho procurou-se verificar a expressão de mRNA de citocinas na pele e linfonodos de cobaias infestadas e re-infestadas com carrapatos. Para tal foram delineados primers e padronizadas reações de PCR para detectar a expressão de mensagem das citocinas IL-12p40, IFN-gama e TNF-alfa, pertencentes a um padrão Th1, e IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-beta, pertencentes a um padrão Th2 de resposta imune. Os resultados obtidos demonstraram que cobaias sucessivamente infestadas apresentaram um aumento significativo na intensidade de mensagem para IL-12p40 nos linfonodos, tanto comparado com animais uma vez infestados (aumento de 2,6 vezes), quanto comparado com os controles (aumento de 13 vezes). Embora a análise estatística não tenha apontado uma diferença significativa houve elevação consistente na intensidade de mRNA para IFN-gama nos linfonodos de cobaias re-infestadas comparadas às infestadas apenas uma vez (aumento de 2,4 vezes). Também foi observado um aumento significativo na intensidade da mensagem para IL-5 nos linfonodos de cobaias infestadas uma vez quando comparadas aos controles (aumento de 5 vezes). Não foi detectada expressão de mensagem para IL-4 e IL-10 nas amostras analisadas. Já a expressão de mensagem para TGF-beta foi observada em todos os animais (experimentais ou controles), sugerindo que essa citocina possa ter uma expressão constitutiva em cobaias. Tomados em conjunto, os resultados sugerem o envolvimento predominante de um perfil de citocinas de padrão Th1 na aquisição de resistência em cobaias a carrapatos. Nossos resultados poderão auxiliar o desenvolvimento de novas abordagens para o controle de carrapatos, como, por exemplo, sugerir adjuvantes mais adequados a serem utilizados em vacinas anti-carrapatos. O conhecimento gerado não se restringe à indução de proteção contra carrapatos como também a possibilidade de aumentar a resistência de hospedeiros a patógenos transmitidos por carrapatos que poderiam ser controlados por uma resposta tipo Th1. / Ticks are hematophagous arthropods of cosmopolitan distribution and are significant vectors of several diseases for humans and animals. Guinea pigs, unlike dogs and mice, develop resistance to Rhipicephalus sanguineus ticks after successive infestations. When the immune reaction between tick-infested guinea pigs and dogs/mice are compared, guinea pigs develop both immediate and strong delayed type hypersensitivity reactions while dogs and mice develop only a strong immediate reaction. Additionally was shown that lymph node cells from tick-infested guinea pigs (resistant hosts) proliferate intensely when cultured with tick saliva, differently to what is observed with cells from tick-infested dogs and mice (susceptible hosts). These findings propose the contribution of a Th1 cytokine pattern on the acquired immune response to ticks; however this hypothesis still has to be tested. This being so, in this study we investigated the expression profile of genes coding for selected cytokines on R. sanguineus infested guinea-pigs. Messenger RNA for IL-12-p40, IFN-gamma and TNF-alfa (Th1 cytokine pattern) and IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-beta (Th1 cytokine pattern) was measured in skin and lymph nodes biopsies from tick-infested guinea pigs. Our results demonstrated that repeatedly tick-infested guinea pigs presented a significant increase on the intensity of message for IL-12p40 in the lymph nodes compared to both, one time tick-infested guinea pigs (raise of 2.6 times) or controls (raise of 13 times). Although the statistical analysis did not point out differences, there was a consistent increase on the mRNA intensity for IFN-gamma on the lymph nodes from re-infested guinea pigs compared to one time tick-infested animals (raise of 2.4 times). In addition, a significant enhance on the intensity of message for IL-5 on the lymph nodes from one time tick-infested guinea pigs compared to the controls (raise of 5 times). No message for IL-4 and IL-10 was detected on the analyzed tissues. In contrast, TGF-beta was detected on tissues collected from all animals (experimental or controls), suggesting a spontaneous production of this cytokine in guinea pigs. Taken together, these data suggest that a T helper 1-type pattern of cytokine production might be associated with the resistance expressed by guinea-pigs to ticks. Moreover, our results can provide new approaches to control ticks, i.e. suggest adjuvants to be added to anti-tick vaccines that preferably induce a Th1-type of response.

Infestações com Rhipicephalus microplus, o carrapato dos bovinos, causam enormes prejuízos econômicos para a pecuária. Os carrapatos estão desenvolvendo resistência aos carrapaticidas que, além dessa desvantagem, deixam resíduos em carne e leite. Vacinas anticarrapato representam uma alternativa sustentável de controle de infestações, mas as atualmente disponíveis têm efeitos parciais e transitórios. Surge, assim, a necessidade de identificar novos antígenos vacinais. Para alcançar esse objetivo este trabalho explora o fato de que bovinos apresentam fenótipos contrastantes e herdáveis de infestações que são específicos de certas raças. Além disso, o nível de imunidade do hospedeiro afeta a transcrição de genes de glândulas salivares do carrapato, órgão que produz proteínas que medeiam o parasitismo. A hipótese de trabalho é a que os diferentes níveis da imunidade anticarrapato do hospedeiro afetam, também, a composição salivar do parasita. Assim, em carrapatos alimentando-se em hospedeiros resistentes as proteínas que são cruciais ao parasitismo poderão estar ausentes ou deficientes na sua saliva e por isso os carrapatos não terminam sua refeição de sangue. A neutralização dessas mesmas proteínas pela imunidade humoral pode ter o mesmo efeito e por isso, essas proteínas constituem bons antígenos vacinais. Assim, o objetivo do trabalho foi identificar novos antígenos vacinais em saliva de fêmeas e glândulas salivares de ninfas, machos e fêmeas de carrapatos alimentados em hospedeiros resistentes e suscetíveis, bem como em larvas não alimentadas oriundas de ovos de fêmeas alimentadas nestes mesmos hospedeiros. Para isso, foram empregadas abordagens de sequenciamento de nova geração \"RNA-Seq\" (454) e abordagens proteômicas, como análise diferencial em gel (DIGE) e Western Blots (imunoproteoma) seguido de sequenciamento de massa, além da tecnologia de identificação de proteínas multidimensionais (ou Multidimensional Protein Identification Technology, MudPIT) para descrever o proteoma das glândulas salivares e da saliva de fêmeas. A análise transcriptômica resultou no sequencimanto de 1.999.086 reads que permitiu identificar e classificar 11.676 sequências codificadoras (CDS), muitas das quais (3.600 CDS) contêm peptídeo sinal que é indicativo de secreção, portanto podendo estar presente na saliva e Resumo Gustavo Rocha Garcia apresentar função importante na hematofagia. Por meio de MudPIT, identificamos 321 proteínas salivares diferentes, além de 126 proteínas no DIGE e 266 proteínas nos imunoproteomas. Muitas dessas proteínas podem ser consideradas antígenos potenciais por estarem associadas com a hematofagia/parasitismo, tais como proteases, nucleases, inibidores de proteases, peptídeos antimicrobianos, proteínas de fixação, entre outros, inclusive proteínas ainda não caracterizadas. A maioria dos genes codificantes dessas proteínas está mais expressa em carrapatos alimentados em hospedeiros suscetíveis, principalmente em carrapatos machos. Além disso, muitas dessas proteínas não são reconhecidas por soros bovinos, inclusive soros de bovinos infestados, embora soros de bovinos infestados e resistentes ao carrapato apresente a maioria das reatividades. O conjunto dos resultados sugere que em nível de proteína a composição da saliva também é afetada pelos diferentes níveis de imunidade dos hospedeiros, além de variar com o ciclo de vida do carrapato. Desse modo, concluímos que as estratégias de investigação empregadas foram satisfatórias para identificar um conjunto de antígenos salivares do carrapato R. microplus que representam proteínas alvos para compor vacinas multicomponentes anticarrapato. / Infestation with Rhipicephalus microplus, the cattle tick, causes huge economic losses to livestock. Ticks are developing resistance to acaricides that, besides this disadvantage, leave residues in meat and milk. The anti tick vaccines represent a sustainable alternative of the infestations control, but the currently available has partial and transient effects. Thus arises the need to identify new vaccine antigens. To achieve this goal, this work explores the fact that cattle exhibit contrasting phenotypes and inheritable of infestations that are specific to certain breeds. Furthermore, the level of immunity of the host affects gene transcription tick salivary gland, organ that produces proteins that mediate the parasitism. The working hypothesis is that different levels of anti tick immunity of host affect also the salivary composition of the parasite. So in ticks feeding on resistant hosts the proteins that are crucial to parasitism may be absent or deficient in their saliva, and by this the ticks do not finish your meal blood. The neutralization of these same proteins by humoral immunity can have the same effect and by this, these proteins are good vaccine antigens. So, the aim of the study was to identify new vaccine antigens in saliva from females and salivary glands of nymphs, males and females of ticks fed on resistant and susceptible hosts as well as in unfed larvae originating from eggs of females fed on these same hosts. To this, were employed sequencing approaches of new generation \"RNA-Seq\" (454) and proteomic approaches, such as differential analysis in gel (DIGE) and Western Blots (immunoproteomics) followed by sequencing mass, besides the Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) to describe the proteome of the salivary glands and saliva of females. The transcriptomics analysis identified 11,676 coding sequences (CDS), many of which (3,600 CDS) contain predicted signal peptide indicative of secretion, therefore may be present in saliva and provide an important function in blood feeding. Through MudPIT, we identify 321 different salivary proteins, besides 126 proteins in DIGE and 266 proteins in immunoproteomics. Many of these proteins may be considered as potential antigens to be associated with the blood meal/ parasitism, such as proteases, nucleases, protease inhibitors, antimicrobial peptides, proteins of attachment, among Abstract Gustavo Rocha Garcia others, including proteins not yet characterized. Most of the genes encoding of these proteins are more expressed in ticks fed on susceptible hosts, especially in male ticks. Moreover, many of these proteins are not recognized by bovine sera, including sera from infested hosts, although sera from infested and resistant host to tick present the most reactivities. The overall results suggest that in protein level, the composition of saliva is also affected by the different levels of immunity of the host, besides vary with the tick life cycle. Thus, we conclude that the research strategies employed were satisfactory to identify a set of tick salivary antigens from R. microplus that represent target proteins for composing anti tick multicomponent vaccines.

A oviposição é um estágio vulnerável do ciclo de vida de carrapatos. Rhipicephalus microplus, como todos Ixodidae e Argasidae, possui uma glândula especializada, o órgão de Gené, que produz uma cera que é depositada na superfície do ovo durante a oviposição. Além de restringir a perda excessiva de água, a cera atua como uma barreira contra o ataque de organismos invasores. Em R.microplus, como em outros carrapatos, há poucos estudos demonstrando atividade antimicrobiana em ovos. Ainda mais, não há na literatura relato de atividade antibiofilme em ovos de carrapatos e nem mesmo em qualquer outro artrópode. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese da existência de mecanismos de defesa em ovos de R. microplus contra biofilmes bacterianos. O extrato água/metanol da cera dos ovos apresentou atividade contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa sem afetar a sua viabilidade. Esse extrato também demonstrou efeito antibiótico contra Staphylococcus epidermidis. Nós identificamos a molécula com ambas atividades (antibiofilme e antibiótica) como N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucina (boophiline). Na busca por possíveis mecanismos responsáveis pelo efeito antibiofilme de boophiline contra P. aeruginosa, 14 genes foram analisados por qRT-PCR. Boophiline inibe a expressão de fliC (flagelo) e cdrA (componente estrutural da matriz), cujos produtos são necessários para a formação do biofilme de P. aeruginosa. Monosfosfato de guanosina dimérico cíclico (c-di-GMP) é um importante segundo mensageiro característico de bactérias Gram-negativas. Altos níveis intracelulares de c-di-GMP promovem o estilo de vida séssil enquanto baixos níveis induzem o comportamento móvel. De acordo com essa afirmação, nós encontramos que boophiline aumenta a motilidade swarming de P. aeruginosa. Desta forma, nos questionamos se o mecanismo de ação de boophiline estaria envolvido com c-di-GMP já que o sistema quorum sensing não foi afetado pela molécula. Interessantemente, quando os níveis de c-di-GMP foram aumentados pela superexpressão de uma diguanilato ciclase, boophiline não inibiu efetivamente a formação de biofilme. Uma explicação para esse resultado é que boophiline interfere em uma via específica regulada por c-di-GMP, o que explicaria não termos obtido um decréscimo no nível total deste segundo mensageiro. Contrariamente, boophiline foi bactericida contra S. epidermidis. Mudanças morfológicas significativas foram observadas em células tratadas com a molécula, as quais foram severamente danificadas. Boophiline levou a formação anormal de septo, rompimento da membrana bacteriana e extravasamento do material intracelular. Adicionalmente avaliamos o potencial antibiofilme e anti-protozoário de filtrados de cultura obtidos de bactérias isoladas de tecidos de R. microplus. Quatorze filtrados de cultura bacteriano apresentaram notável atividade contra o biofilme de P. aeruginosa e S. epidermidis e foram citotóxicos contra Tritrichomonas foetus. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de proteção contra biofilmes em ovos de carrapatos bem como de bactérias associadas a carrapatos como produtoras de moléculas bioativas. Além disso, nós demonstramos que boophiline é uma nova molécula antibiofilme, sendo a primeira vez relatado na literatura que um composto age inibindo cdrA. Os dados obtidos em nosso estudo poderiam estimular novas abordagens em áreas como fisiologia e controle de artrópodes, genética e fisiologia de microrganismos e controle de biofilmes. / The oviposition is a vulnerable stage of the tick life cycle. Rhipicephalus microplus, as all Ixodidae and Argasidae, has a specialized gland, the Gene’s organ, which produce a wax that is smeared on egg surface during oviposition. In addition to restricting excessive water loss, wax acts as a barrier to attack by invading organisms. In R. microplus, as in other ticks, there are few studies showing antimicrobial activity in eggs. Moreover, there is no report of antibiofilm activity in tick eggs nor in any other arthropod. The objective of our study was to evaluate the hypothesis of the existence of defense mechanisms against bacterial biofilms in R. microplus eggs. The eggs wax water/methanol extract showed activity against Pseudomonas aeruginosa biofilm without affecting its viability. This extract also presented an antibiotic effect against Staphylococcus epidermidis. We have identified the molecule anti-biofilm and antibiotic as N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucine (boophiline). In the search for possible mechanisms responsible by antibiofilm effect of boophiline against P. aeruginosa, 14 genes were evaluated by qRT-PCR. We showed that boophiline inhibits the expression of fliC (flagellum) and cdrA (matrix structural component), whose products are necessary for biofilm formation in P. aeruginosa. Bis-(3’–5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is an important second messenger, characteristic of Gram-negative bacteria. High intracellular levels of c-di-GMP promote a sessile mode of growth, while low levels promote motile behavior. In line with this, we found that boophiline increases swarming motility, which raised the question whether it acts by altering c-di-GMP levels. Interestingly, when c-di-GMP levels were increased by overexpression of a diguanilate cyclase, boophiline no longer inhibited biofilm formation. One explanation for these results is that boophiline interferes with a specific c-di-GMP-regulated pathway, which would explain we have not obtained a decrease in the total level of this second messenger. Conversely, boophiline had a bactericidal effect against S. epidermidis. Significant morphological changes were observed in the boophiline-treated cells, which appeared to be severely damaged. Boophiline was found to cause abnormal septum formation, bacterial membrane disruption, and extravasation of intracellular material. Additionally, our work also aimed to evaluate the potential antibiofilm and anti-protozoa of culture filtrates obtained from bacteria isolated of R. microplus tissues. Fourteen bacterial culture filtrates showed remarkable activity against of P. aeruginosa and S. epidermidis biofilms, and were cytotoxic against Tritrichomonas foetus. Our work is pioneer in demonstrating the existence of protection mechanisms in tick eggs against biofilms, and ticks-associated bacteria as producers of bioactive molecules. Furthermore, we demonstrated that boophiline is a new antibiofilm molecule, and is the first reported in the literature that a molecule inhibits cdrA. The data obtained in our study could stimulate new approaches in areas such as the physiology and control of arthropods, the genetics and physiology of microorganisms, and biofilm control.

Os carrapatos são artrópodes hematófagos, vetores de doenças. Vacinas são uma alternativa para o seu controle, já que esses parasitas durante a infestação, estimulam as respostas imunes do hospedeiro, as quais são implicadas em sua rejeição. As glândulas salivares do parasita são importantes para permitir a alimentação e para mediar os mecanismos de escape às defesas do hospedeiro. Diversas evidências indicam que ocorre reatividade cruzada entre espécies de carrapatos e que reações de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH) são correlacionadas com resistência ao carrapato. A possibilidade de vacinar cachorros que são parasitados pelo R. sanguineus com antígenos do carrapato do boi, o R microplus, foi investigada por meio da análise in silico de 45 GIs de R microplus clonados em vetor plasmidial (TOPO VR2001), dentre os quais 14 Gls de R microplus se revelaram mais similares a sequências do R sanguineus, e foram empregados para avaliar: 1) A capacidade em elicitar reações cutâneas tardias em cobaias imunes a carrapatos por meio de infestações prévias com R sanguineus. 2) A capacidade de vacinas contendo GIs individuais em afetar infestações de camundongos com adultos de R sanguineus. 3) a capacidade do GI induzir anticorpos específicos após vacinação em camundongos. Dos 14 GIs testados, apenas dois não induziram reações cutâneas, quatro não afetaram nenhum parâmetro parasitológico da infestação, e três não induziram a produção de anticorpos nesses animais. Dentre os GIs, sete foram escolhidos para compor uma vacina multigênica contra o carrapato do cão R sanguineus. A vacina foi capaz de induzir resistência á infestação por R sanguineus em camundongos e em cachorros vacinados evidenciadoa pela diminuição do número de fêmeas que conseguiram colocar ovos, do peso médio da massa de ovos produzidos por essas fêmeas, do índice reprodutivo dessas fêmeas, e da taxa de eclosão das larvas, demonstrando que GIs de R microplus podem ser alvos para formulação de uma vacina contra o carrapato R sanguineus. / Ticks are arthropod vectors of disease. Vaccines are an alternative to chemicals for controlling ticks because during infestations these parasites stimulate host immune responses such as delayed hypersensitivity skin reactions (DTH), which are involved in their rejection and are correlated with resistance to ticks. Tick salivary glands are important for the parasite to acquire blood meals because their products mediate escape mechanisms from host defenses. The possibility of vaccinating dogs against infestations with the brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus, with antigens derived from salivary glands of the cattle tick, R. microplus, was investigated by in silica analysis of 45 genes from R. microplus. These genes were targeted because of their putative biological function and had been cloned into the plasmid vector TOPO VR2001. Of them, 14 were chosen to be evaluated in a vaccine because their sequences were the most similar to several genes expressed in salivary glands of R. sanguineus. The plasmids containing the genes of interest (GIs) were used to assess: 1) The ability of the product of the genes to elicit delayed skin reactions in guinea pigs immune to ticks by previous infestations with R sanguineus. 2) The ability of individual GIs delivered as DNA vaccines to affect infestations of mice with adult R sanguineus. 3) The ability of the genes to induce specific antibodies after vaccination in mice. Only two of the 14 genes delivered to guinea pigs via intradermal injection of DNA did not elicit delayed skin reaction, four used in a vaccine did not affect any parameter of tick infestations, and three did not induce production of antibodies in these animals after DNA vaccination. Of the 14 genes, seven were chosen to formulate a multigene vaccine against the dog tick R. sanguineus. The vaccine was able to significantly affect several parameters of infestations by R sanguineus in vaccinated dogs and mice. This was reflected in the reduction of the number of females that were able to lay eggs, of the average weight of the egg mass produced by these females, of the reproductive rate of these females, and of hatching rate of larvae, demonstrating that GIs from R microplus may be targets for development of a vaccine against the tick R sanguineus.

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O uso de plantas medicinais e de seus derivados com ação carrapaticida é considerado um excelente recurso frente a formação de resistência aos produtos químicos. Diante da necessidade de alternativas mais eficazes e com menores impactos ambientais o objetivo desse estudo foi avaliar a ação carrapaticida in vitro do eugenol, do óleo essencial e do hidrolato de Syzygium aromaticum (cravo-da-índia). Adicionalmente, também foi investigada a atividade carrapaticida do óleo essencial e do eugenol quando incorporados em uma formulação. O óleo essencial e o hidrolato de cravo-da-índia foram obtidos pelo processo de hidrodestilação dos botões florais secos da planta. A caracterização química do óleo essencial de cravo-da-índia por CG/EM revelou a presença dos componentes majoritários eugenol (83,97%), cariofileno (3,04%), humuleno (0,42%) e acetato de eugenol (12,58%). Os carrapatos provenientes de diversas regiões geográficas foram tratados com os compostos em estudo em diferentes etapas de seu ciclo. No teste de pacote de larvas foi avaliada a mortalidade com concentrações de eugenol, óleo essencial e hidrolato que variaram de 0,1 à 2,0%. O índice de produção de ovos, a eclosão larval e a eficácia carrapaticida foram avaliados através do teste de imersão de fêmeas ingurgitadas, em que foram utilizadas concentrações de eugenol e óleo essencial de 1,25 a 10%. O eugenol e o óleo essencial promoveram 100% de mortalidade em larvas a partir das concentrações de 0,25 e 0,5%, respectivamente. O hidrolato não apresentou atividade carrapaticida nas concentrações testadas. No teste de imersão de fêmeas o eugenol e o óleo essencial apresentaram resultado de eficácia superior a 95% a partir da concentração de 5,0%, inibindo completamente a eclosão larval na concentração de 10%. O uso do eugenol, substância purificada (99-100%) não proporcionou superioridade significativa nas eficácias de tratamento em relação ao óleo essencial de cravo, o que reforça o potencial do uso do óleo essencial de cravo como carrapaticida, uma vez que o mesmo é uma alternativa de fácil acesso, baixo custo e com alto rendimento no processo extrativo. A formulação desenvolvida não promoveu melhores eficácias de tratamento quando comparada a solução etanólica, o que sugere que novas pesquisas deverão ser realizadas sob a perspectiva de testar o óleo essencial de cravo em outras formulações que possam melhorar sua atividade. Além disso, testes in vivo são recomendados para validação da eficiência do ativo em condições de campo. / Ticks are important vectors of diseases in animals and humans. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) has caused serious harm to livestock raising in Brazil, considering the costs of controlling it, revenue loss as a result of a smaller production of milk and meat, and leather damage, in addition to transmitting diseases. The use of medicinal plants and their derivatives with acaricide action is considered an alternative against the formation of chemicals resistance. Due to the need for more efficient alternatives with less environmental impact, this study aims to evaluate the acaricide action in vitro of eugenol, essential oil and hydrolate of Syzygium aromaticum (clove). Additionally, it has also investigated the acaricide activity of the essential oil and eugenol when incorporated into a formulation. The extraction of the essential oil and hydrolate was performed by steam distillation of dried flower buds of the plant. The chemical characterization of clove essential oil by GC/MS revealed the presence of the major components eugenol (83.97%), caryophyllene (3.04%), humulene (0.42%), and eugenol acetate (12.58%). The ticks from different geographical areas were treated with the test compounds in different stages of the tick cycle. In the larval packet test, mortality was assessed at concentrations of eugenol, essential oil and hydrolate ranging from 0.1 to 2.0%. The eggs production levels, the larvae hatching, and their efficiency on ticks were assessed using the adult immersion test, in which eugenol and essential oil were used at concentrations of 1.25 to 10%. The eugenol and the essential oil caused 100% mortality of larvae, starting at 0.25 and 0.5%, respectively. The test with hydrolate showed no activity at the concentrations tested. In the adult immersion test, the eugenol and the essential oil showed results greater than 95% efficacy at concentrations of 5.0%, completely inhibiting the larvae hatching at 10%. The use of eugenol, purified substance (99-100%), gave no significant superiority in efficacy of treatment with the clove essential oil, which strengthens the potential use of clove essential as an acaricide, being it a low cost and accessible alternative, with high yield in the extraction process. The formulation developed did not promote better efficacies of treatment when compared to ethanol solutions, which suggests that further research should be conducted from the perspective of testing the essential oil of cloves in other formulations that can improve their activity. Furthermore, in vivo tests are recommended for an active efficiency in field conditions validation.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_anibal_torres.pdf: 438835 bytes, checksum: d43cf21b0af9852e79231f87a87e06ea (MD5) Previous issue date: 2010-02-22 / The equine theileriosis, caused by Theileria equi, is an endemic disease of south of Rio Grande do Sul Brazil. There are signs that tick Rhipicephalus boophilus microplus still transmit that disease and in few time, some studies had experimental demonstrated it. The purpose of the first study of this paper was to demonstrate the tick infestation and the role of it in the transmission of the disease. In equines with contact directly with cattle, the serum incidence of the disease was 81,8% and in this group, 31,8% of this horses had tick infestation. In the equines that didn t have contact with cattle, the incidence of the disease was 12% and no tick was found in this horses. The most efficient drug in the treatment of the disease is imidocarb dipropionate. Many studies had demonstrated different doses and protocols of treatment of the disease and the toxicity of it was obvious. No study had show the sterile of T. equi with this drug, but it s a way to treat the acute disease and to control the chronic theileriosis. The acute form of the disease is seemed with fever, icteric and death. The chronic kind of it is seemed with covered coat, hyporexia, low performance in athlete horses and loss of weight. The goal of the second study of this paper was to show the toxicity and the metabolic effects of imidocarb dipropionate drug into two protocols of treatment ( two groups, 2 and 4mg/kg) in serum positive horses to theileriosis. It was seemed through hepatic and renal profile that 2mg/kg of the drug have low toxicity. Horses infected with T. equi keep with the disease for the rest of your lives, and the drug control with imidocarb dipropionate is necessary. The goal of the third study of this paper was to demonstrated, through immunologic test and clinic examination that 2mg/kg of imidocarb dipropionate monthly can control the chronic disease even in stress situations. One group received monthly, through 6 mouths, 2mg/kg of imidocarb dipropionate and the other group, once, in the beginning of it, 4mg/kg. The conclusion of this paper is that the incidence of equine theileriosis have a directly relation with the catle contact because it cause the tick Rhipicephalus Boophilus mircoplus infestation. Mensal dosis with 2mg/kg of imidocarb dipropionate is efficient in the disease control and it had demonstrated that it is not toxic for equine. / A theileriose equina, causada pelo hemoprotozoário Theileria equi, é uma doença endêmica na região da campanha do Rio Grande do Sul. Há indícios de que o carrapato Rhipicephalus Boophilus microplus transmita também a theileriose equina e, há pouco tempo, estudos demonstraram experimentalmente esta transmissão. O objetivo do primeiro trabalho foi demonstrar a infestação de carrapatos Rhipicephalus Boophilus microplus e o papel importante deste parasita na transmissão de theileriose equina. Em cavalos com contato direto com bovinos, a incidência sorológica da doença foi de 81,8%, sendo que em 31,8% destes animais se encontrou carrapatos Rhipicephalus Boophilus microplus. Nos equinos sem contato com bovinos, a incidência sorológica foi de 12% e não se encontrou carrapatos. Diversos estudos têm demonstrado a eficiência no tratamento da doença com dipropionato de imidocarb em diferentes doses, porém a toxicidade deste fármaco se manifesta em alguns animais. A forma aguda é caracterizada por febre, icterícia e morte. A forma crônica é descrita por pêlo arrepiado, hiporexia, queda no desempenho em animais atletas e perda de peso. O objetivo do segundo trabalho foi demonstrar a toxicidade e os efeitos metabólicos do dipropionato de imidocarb em duas doses terapêuticas (2 e 4mg/kg). Foi sugerido, através do perfil hepático e renal, após a administração da droga, que 2mg/kg deste fármaco tem uma toxicidade leve e temporária no período de metabolização da droga. Uma vez infectados com a T. equi, os equinos permanecem a vida toda positivos para a doença. Com isso o controle da enfermidade depende da utilização do dipropionato de imidocarb. O objetivo do terceiro trabalho foi demonstrar, através do teste de imunofluorescência indireta e exame clínico, que doses mensais de dipropionato de imidocarb á 2 mg/kg são eficazes para se manter a parasitemia e a clínica da doença controladas, mesmo que os animais sejam submetidos á situações de estresse. Um grupo recebeu mensalmente, por seis meses, 2mg/kg de dipropionato de imidocarb e o outro grupo, 4mg/kg apenas uma vez no primeiro mês. A conclusão desta dissertação é que a incidência da theileriose equina tem relação direta com a convivência com bovinos por facilitar a infestação destes com o carrapato Rhipicephalus Boophilus microplus; e que, doses mensais de dipropionato de imidocarb, à 2mg/kg, são eficazes no controle da parasitemia da doença mesmo em situações de estresse e não se demonstram tòxicas para os equinos.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_felipe_geraldo_pappen.pdf: 1221798 bytes, checksum: 72f7cef0d47255d268dc994513126704 (MD5) Previous issue date: 2011-09-21 / Practices of Rhipicephalus (Boophilus) microplus control are problematic in many livestock production systems and have worldwide increased. In the south region of Rio Grande do Sul State, Brazil, where beef cattle are breed, dip baths are the main option for acaricide treatments. Thus, the aim of this study consist in: (i) to know the epidemiological aspects of dip baths use for R. (B.) microplus control in south of Brazil, (ii) to evaluate chemical sensibility of R. (B.) microplus in beef farms with cattle dip baths, (iii) to evaluate dip baths structure and maintenance conditions, and (iiii) to evaluate tick control handlings procedures. An epidemiologic inquiry was applied to 110 beef farmers holding plunge cattle dips, which were located in eight tows in the south region. The obtained results showed that dip baths were unable on 27.3% (30/110) of the properties,mainly due to the presence of resistance to most of the acaricide classes (40% - 12/30). Dip baths have been active in 72.7% (80/110) and amitraz is the most used acaricide in 82.5% (66/80) of these farms, followed by associations of pyrethroids and organophosphates in 16.2% (13/80), and nonassociated pyrethroids in 1.3% (1/80) of properties. Suitable number of engorged female ticks to laboratory sensibility test were obtained in 17.5% (14/80) of farms, demonstrating that 42.9% (6/14) of tick populations were sensible to amitraz, while 85.7% (12/14) were susceptible to associations, and none was sensible to pyrethroids. Moreover, in vitro tests revealed that dip baths solutions were only efficient in 35.7% (5/14) of them. Although the dip baths presents a mean age of 35 years, most farmers have no claims of physical infrastructure issues. The main criterion for the decision of the immersion baths application is the visualization of the immature ticks on cattle in 66% (53/80) of the properties and five or more applications per year were performed in 65% (52/80) of them. Moreover, the simultaneous use of other acaricides on injectable forms and pour-on, and the extension of the parasitism period to the winter months suggested that tick control in the region is reason for concern. It was also concluded that pyrethroids have been replaced by amitraz in last years, and nowdays this acaricide is being replaced by associations of pyrethroids with organophosphates, a viable alternative for most of the farms according to the in vitro tests. / O controle do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é problemático em vários sistemas de criação, estando disseminados os casos de resistência por todo o mundo. A situação também é preocupante na região sul do Rio Grande do Sul, que por sua vez utiliza o banheiro de imersão como principal método de aplicação de acaricidas em propriedades de criação de bovinos de corte. Assim, o presente trabalho teve os seguintes objetivos: (i) conhecer os aspectos relacionados à utilização dos banheiros de imersão para o controle do carrapato R. (B.) microplus; (ii) avaliar a sensibilidade de R. (B.) microplus destas propriedades; (iii) avaliar as características e condições de estrutura física dos banheiros de imersão; e (iiii) avaliar itens de manejo relativos ao controle do carrapato. Para tanto, um questionário epidemiológico foi aplicado em 110 propriedades de criação de bovinos de corte com banheiro de imersão, distribuídos em oito municípios da região de estudo. Constatou-se que em 27,3% (30/110) delas, o banheiro carrapaticida encontra-se desativado, principalmente em virtude do surgimento de resistência aos princípios ativos disponíveis (40% - 12/30). Naquelas em que o banheiro de imersão está carregado (72,7% - 80/110), o amitraz é o ingrediente ativo mais utilizado (82,5% - 66/80), seguido das associações de piretróides com organofosforados (16,2% - 13/80) e dos piretróides não associados (1,3% - 1/80). Obteve-se número suficiente de teleóginas para a avaliação de sensibilidade em laboratório em 17,5% (14/80) das propriedades, constatando-se que 42,9% (6/14) das populações eram sensíveis ao amitraz, 85,7% (12/14) às associações de piretróides com organofosforados, e, nenhuma aos piretróides não associados. Os testes in vitro também revelaram que as caldas utilizadas eram eficazes em apenas 35,7% (5/14) dos casos. Embora os banheiros de imersão da região possuam, em média, 35 anos de existência, e alguns problemas conservação tenham sido constatados, a maioria dos proprietários alega possuir estrutura física adequada. O critério para a realização dos banhos é a visualização de formas imaturas do carrapato sobre o bovino em 66% (53/80) das propriedades e são realizadas cinco ou mais aplicações em 65% (52/80) delas. Além disso, a utilização simultânea de outros ingredientes ativos nas formas injetável e pour-on, e a extensão do período de parasitismo aos meses de inverno sugerem que a situação do controle do carrapato na região está se agravando. Também conclui-se que os piretróides foram ao longo dos últimos anos substituídos pelo amitraz, que por sua vez vem dando lugar às associações de piretróides com organosfosforados, uma alternativa viável para a maioria das propriedades segundo os testes in vitro.

Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Coorientador: Flávio Politi / Banca: Ilio Montanari Junior / Banca: Luis Vitor do Sacramento / Resumo: O Brasil é um dos maiores exportadores de carne bovina do mundo, entre 2003 e 2008 a receita com exportações cresceu de um bilhão para mais de cinco bilhões de dólares. Apesar disso, o setor enfrenta perdas consideráveis devido à ocorrência de infestações massivas de ectoparasitas como os carrapatos da espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Ainda dentro do agronegócio, outra produção que se encontra em amplo crescimento e demonstrando grande potencial de ganho de espaço no mercado internacional é a ovinocultura, com rebanho estimado em 14 milhões de animais, colocando o Brasil em 18º lugar no ranking mundial de exportações. Porém, existem grandes perdas econômicas devido à existência de infestações com endoparasitas, como o nematódeo gastrintestinail da espécie Haemonchus contortus. Em paralelo à preocupação com os prejuízos financeiros no agronegócio, outra espécie de carrapato, Rhipicephalus sanguineus, desperta interesse dos pesquisadores por ser o vetor de microrganismos causadores de importantes doenças em cães nas regiões tropicais e subtropicais. Devido ao mau uso, acaricidas e nematicidas sintéticos tem ocasionado o fenômeno de resistência, com isso a busca por novas substâncias a partir de espécies vegetais configura-se numa alternativa muito promissora para o controle desses parasitas. A espécie Achyrocline satureioides (Lam.) D.C. (Asteraceae), popularmente conhecida como macela, possui em sua composição compostos fenólicos, sobretudo flavonóis e flavanonas, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Brazil is one of the largest beef exporter in the world and between 2003 and 2008, revenue from exports grew from one billion to more than five billion dollars. Nevertheless, the sector is facing considerable losses due to the occurrence of massive infestations of ectoparasites such as tick species of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. In the agribusiness, another production that is in ample growth and showing great potential for space gain in the international market is the sheep industry, with herd estimated at 14 million animals, placing Brazil in 18th position in the world exports ranking. However, there are great economic losses due to the infestations of endoparasites, such as the gastrointestinal nematodes species of Haemonchus contortus. In parallel to the concern about the financial losses in agribusiness, other tick species, Rhipicephalus sanguineus, arouses interest of researchers for being the vector of microorganisms that causes major diseases to dogs in tropical and subtropical regions. Due to misuse of synthetic antiparasitic, which causes the phenomenon of resistance to them, the search for new substances from plant species sets up a very promising alternative for the biological control. The species Achyrocline satureioides (Lam.) DC (Asteraceae), popularly known as macela, has in its composition phenolic compounds, particularly flavonols and flavanones in the inflorescences. Based on the aspects, this study aimed to analyze the effectiveness of extractives of the first Brazilian cultivar of A. satureoides developed in the CPQBA on ticks R. (B.) microplus and R. sanguineus, as well as on the nematode H. contortus, using in vitro assays. The essential oil and the extracts of inflorescences of macela have shown that this plant has high activity on engorged females of R. (B.)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Sergio Daishi Sasaki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013