Lichens are defined as symbiotic associations composed of a fungal partner, the mycobiont, and one or more photosynthetic partners, the photobiont (1). A currently employed method for the identification of photobionts is the culture of photobiont from the lichen, but this method employs a labor intensive and long cultivation period, thus identification has been neglected. Out of the approximatelyl4,000 lichen described, only about 4% oflichen photobionts have been identified to species (1). In this study we investigated the feasibility of developing a polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) identification system for rapidly identifying lichen algae of the genus Trebouxia (In this study we consider Pseudo-Trebouxia part of the genus Trebouxia). DNA was isolated and purified from cultures of each Trebouxia species. A 1300 hp fragment of the 5' region of the nuclear-encoded large subunit (26S) ribosomal RNA genes was amplified by PCR (2). This 5'region of the 26S region is considered to be a byper-variable region because it differs amongst Trebouxia (2) making it a good candidate for RFLP. The sequences were then analyzed with restriction analysis software to determine restriction maps and individual virtual RFLP patterns. Patterns were constructed using the program SPR Opt (SNP and PCR-RFLP Optimization) allowing each Trebouxia species to be identified by a distinctive restriction pattern. We were unable to validate the key due to contamination of materials, which lead to inconclusive data. Future experiments aim to validate the key by comparing the virtual RFLP patterns to the actual patterns obtained for each type culture of each species.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2005. / Härtill 4 uppsatser.

L'excision de la méthionine N-terminale (NME) est la première modification se produisant au N-terminal des protéines (NPM). Les peptides déformylases (PDF) sont les enzymes impliquées dans ce processus co-traductionnel essentiel et conservé. Les PDFs suppriment le groupe formyle lié à la méthionine initiatrice (iMet) présente au début de toutes les chaînes procaryotes naissantes. Les PDFs agissent au niveau du tunnel de sortie des ribosomes, plaque tournante de nombreux facteurs de biogénèse des protéines associées aux ribosomes (PRB), impliqués non seulement sur les MNP, mais également dans le repliement et la translocation des protéines. La déformylation N-terminale implique 95% du protéome bactérien et contribue directement à la stabilité des protéines. Le récent séquençage à haut débit de milliers de génomes a révolutionné notre perception de la distribution des PDFs dans les différents règnes, révélant des PDFs putatives dans tous les organismes, y compris les virus. En particulier, les études concernant les virus présents dans les échantillons microbiens océaniques ont permis d’identifier des gènes inhabituels de PDF chez les phages, constituant la famille la plus abondante de protéines auxiliaires conservées de ces génomes. La comparaison des séquences identifiées révèle que les PDF virales présentent une forte conservation des trois motifs constituant le site catalytique. Cependant, ces PDFs virales ne présentent pas d'extension C-terminale, région réputée importante des PDFs des autres organismes. Sachant que cette extension est impliquée dans la liaison de la PDF d’E. coli au ribosome et est requise pour son activité déformylase in vivo, il était incertain que les PDFs de phage découvertes avaient une activité déformylase classique. Ainsi, la découverte de ces PDFs virales soulève un certain nombre de questions parmi lesquelles: a) Ces PDFs virales présentent-elles une activité déformylase classique? b) Ces PDFs sont-elles capables de se lier aux ribosomes ? c) Pourquoi autant de virus portent-ils une ou plusieurs déformylases ? Dans ce contexte, l’objectif de ma thèse a été d’entreprendre la caractérisation de ces PDFs de phages marins et en particulier la PDF de Vp16 provenant de bactériophages isolés à l’origine de la souche 16 de Vibrio parahaemolyticus. Nos études révèlent que ces PDFs de phages présentent une activité déformylase à la fois in vitro et in vivo, avec une spécificité de substrat similaire à celle des autres PDFs bactériennes. D'autre part, nous avons montré par des études biochimiques et structurales, combinées à des analyses par mutagenèse dirigée, que les propriétés de la PDF de Vp16 diffèrent significativement de celle des autres PDFs caractérisées précédemment. Il faut aussi noter que l'expression de la PDF Vp16 dans les souches d'E. Coli, même à de faibles concentrations, montre un effet bactéricide marqué à une température inférieure à 37 °C. L’effet bactéricide de la PDF Vp16 est indépendant de la présence de la PDF endogène bactérienne et repose strictement sur son activité déformylase. La caractérisation de ce phénotype a révélé que la létalité induite par Vp16 PDF montrait un lien génétique fort avec des gènes codants pour des facteurs cellulaires impliqués dans le ciblage et le repliement précoce des protéines (Trigger Factor et Sec). Contrairement à ce qui a été montré pour les PDFs bactériennes, Vp16 PDF a une forte affinité pour le ribosome bactérien d’E. coli en cours de traduction, interagissant avec une région ribosomale chevauchant celles des facteurs impliqués dans le transit des protéines vers les voies de sécrétion. Une compétition au niveau du ribosome entre Vp16 PDF et ces RPBs pourrait contribuer à la lyse cellulaire de l’hôte. Mon travail suggère un nouveau mécanisme utilisé par les bactériophages permettant de contrôler la viabilité de l'hôte. / N-terminal Methionine Excision (NME) is the first occurring N-terminal Protein Modification (NPMs). Peptide deformylases (PDFs) are the enzymes involved in this essential and conserved co-translational process. PDFs remove the formyl group bound to the iMet present at the beginning of all prokaryotic nascent chains. PDFs act on the nascent chain at the level of the ribosome exit tunnel, a central hub for a number of Ribosome-associated Protein Biogenesis factors (RPBs) involved not only on NPMs but also in protein folding and translocation. Deformylation involves 95% of bacterial proteome and it is suggested to directly contribute to protein stability. Recent high-throughput sequencing of thousands of genomes has strongly contributed to revolutionizing our perception of the distribution of PDFs among kingdoms, revealing putative PDFs in all organisms, including viruses. In particular, studies of viruses within oceanic microbial samples retrieved unusual PDFs genes as the most abundant family in most of phage genomes. Sequence comparisons reveal that viral PDFs show high conservation in the three motifs that build the catalytic site; however, viral PDFs do not display a C-terminal extension when compared to the different active PDFs from other organisms. Since this C-terminal extension was shown to be important for PDF-ribosome binding and is required for the in vivo deformylase activity of E. coli PDF, it was unclear whether the discovered phage PDFs might support a classical deformylase activity. Thus, the discovery of these viral PDFs raises a number of questions among which: a) Have these viral PDFs a classical deformylase activity? b) Are these PDFs able to still bind to the ribosomes? c) Why so many viruses carry a peptide deformylase? In this context, the objective of my thesis was to undertake the characterization of these marine phage PDFs and particularly Vp16 PDF derived from the bacteriophages originally isolated from Vibrio Parahaemolyticus strain 16. Our studies reveal that phage PDFs display deformylase activity both in vitro and in vivo with a substrate specificity similar to that of other bacterial PDFs. On the other hand, we showed by biochemical and structural data, combined with site-directed mutagenesis analyses, that Vp16 PDF significantly differs from previously characterized PDFs in terms of their properties, which can be related to its few uncommon peculiarities. Interestingly, expression of Vp16 PDF in E. coli strains, even at low concentrations, exhibited a severe bactericidal effect at temperature lower than 37 °C. This bactericidal effect of Vp16 PDF was independent of the presence of the bacterial endogenous PDF and strictly relied on its PDF activity. Characterization of this phenotype revealed that Vp16 PDF-induced lethality showed a strong genetic link with genes encoding cellular factors involved in nascent pre-secretory protein targeting and folding (Trigger Factor and Sec). Differently from bacterial PDF, I could show that Vp16 PDF has strong affinity for ribosomes with a specific nascent chain, interacting with a ribosomal region overlapping that of factors involved in pre-secretory protein targeting. A competition between Vp16 PDF and these RPBs at the level of the ribosome may contribute to the host lysis, revealing a possible new unrecognized mechanism developed by viruses to control host viability.

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The following work demonstrates that paternal diet controls medically important metabolic phenotypes in offspring. We observe transmission of dietary information to the zygote via sperm, and this information evades reprogramming that typically occurs after fertilization. Cytosine methylation is implicated as a major contributor to meiotic epigenetic inheritance in several transgenerational phenomena. Our extensive characterization of the sperm methylome reveals that diet does not significantly affect methylation patterns. However, we find that extensive epivariability in the sperm epigenome makes important contributions to offspring variation. Importantly, coordinate cytosine methylation and copy number changes over the ribosomal DNA locus contributes to variation in offspring metabolism. Thus, rDNA variability acts independently of postadolescent paternal diet to influence offspring metabolism. Therefore, at least two mechanisms exist for epigenetically controlling offspring metabolism: stochastic epivariation and diet acting by an unknown mechanism to further modulate metabolism. This work argues that an offspring's phenotype can no longer be viewed solely as the result of genetic interactions with the developmental environment - the additional influences of paternal environment and inherited epigenetic variability must also be considered. These findings reveal novel contributions to metabolism that could revolutionize how we think about the risk factors for human health and disease.

La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique qui nécessite de nombreuses étapes de maturation et de modification des ARNr ainsi que l’assemblage et le transport des RNPs précurseurs. Un ribosome mature contient une centaine de pièces, ARN et protéines confondus, mais son assemblage requiert l’intervention de plus de 400 facteurs de synthèse. De part le coût énergétique important de ce processus, plusieurs voies de régulation interviennent pour contrôler la biogenèse des ribosomes en fonction des conditions nutritives. L’une des voies les plus connue est la voie TOR (Target of rapamycin). Cette voie de régulation agît principalement au niveau de la transcription des différents intervenants de la biogenèse : les ARNr, les protéines ribosomiques mais aussi les facteurs de synthèse. Ces facteurs, ayant une action transitoire dans la maturation des ribosomes, sont, par économie, recyclés pour la synthèse de nouveaux ribosomes. Nous nous sommes donc intéressés au devenir de ces facteurs, plus particulièrement de ceux intervenants dans la biogenèse de la petite sous unité, lorsque les conditions environnementales sont inadaptées à la croissance cellulaire. Ainsi, nous avons pu montré, pour quatre facteurs particuliers : Dim2, Rrp12, Hrr25 et Fap7, que leur localisation est dépendante de la synthèse ribosomique. Ainsi, lors de carence en sources nutritives, l’inhibition de la synthèse et de l’activité ribosomique entraîne un confinement de ces facteurs ribosomiques dans le nucléole ou dans des corps cytoplasmiques. En outre, la localisation particulière des facteurs ribosomiques Hrr25 et Fap7 dans les P-bodies en phase de croissance saturée laisse penser que ces corps cytoplasmiques sont le lieu de dégradation des pré-ribosomes lorsque les carences nutritives perdurent.

Le microbiote pulmonaire complexe de patients atteints de mucoviscidose (MV) peut être modifié par des facteurs de l'hôte (état clinique), xénobiotiques (antibiothérapie, habitat) ainsi que bactériens (pathogènes, commensaux). Notre étude a porté sur ces facteurs bactériens et plus particulièrement sur l'effet de Pseudomonas aeruginosa sur la structuration des microbiotes MV. Le but de notre travail a été d'étudier la structure et la composition des microbiotes pulmonaires chez des patients MV en fonction de la présence ou non de P. aeruginosa, ainsi que l'effet de ces microbiotes sur ce pathogène. Différentes approches nous ont permis de mettre en évidence ces résultats : i) certains genres bactérien (Stenotrophomonas, Prevotella) contenus dans un microbiote particulier plus pauvre et moins diverse sont associés préférentiellement à la présence de P. aeruginosa, ii) aucune diminution de richesse et de diversité n'est observée en amont d'une primo-colonisation par P. aeruginosa mais celle-ci entraine ultérieurement une diminution de richesse du microbiote, iii) le microbiote MV in vitro s'appauvrit et diminue en diversité plus rapidement lors d'une colonisation par une souche ayant un phénotype de « primo-colonisation », iv) les souches de primo-colonisation sont plus virulentes que les souches issues de colonisation chronique, v) ces souches sécrètent des molécules appartenant à la famille des 4-hydroxy-2-heptylquinoline (HAQs) bactéricides vis-à-vis de S. aureus. Une meilleure compréhension de cette modulation des microbiotes MV par P. aeruginosa offriraient de nouvelles stratégies thérapeutiques afin notamment de contrer l'implantation de ce pathogène au niveau pulmonaire et de limiter le développement d'infections chroniques chez les patients MV / Cystic fibrosis microbiota could be modified by different factors such as host factor (clinical state), xenobiotic factor (antibiotic, environment) or bacterial factors (pathogen, commensal). Our study focused on bacterial factors and more particularly on the impact of Pseudomonas aeruginosa on the CF microbiota structure. The objectives were to study the structure and the composition of CF microbiota whether the presence or not of P. aeruginosa and the impact of the CF microbiota on this pathogen. Different experimentations were used to get results : i) bacterial genus (Stenotrophomonas, Prevotella) were preferentially associated with P. aeruginosa in a poor and no diverse microbiota, ii) no previous decrease of microbiota richness was observed when the initial P. aeruginosa pulmonary colonization took place but this event was associated with a later decrease of microbiota richness, iii) In vitro model of CF microbiota showed a more important richness and diversity decrease with early colonization strains, iv) early colonization strains were more virulent than chronic colonization strains, v) these strains secreted bactericid molecules toward Staaphylococcus aureus belonging to 4-hydroxy-2-heptylquinoline (HAQs). Improve our understanding on how P. aeruginosa could modulate CF microbiota could permit to find new therapeutic strategies to prevent the early colonization and then to limit the chronic infections in CF patients

Des prospections réalisées en Equateur (Amazonie et côte pacifique) ont permis la collecte d'un matériel entomologique abondant et diversifié, notamment chez les Psychodopygina. Nos travaux ont permis de réaliser plusieurs travaux de systématique, essentiellement moléculaire. Afin de tester les hypothèses phylogénétiques développées par Galati (2010), nous avons conduit une étude de phylogénie moléculaire chez les Psychodopygina. Basée sur les séquences des domaines D1, C2 et D2 de l'ADNr 28S et sur celles d'une partie du cytochrome b de l'ADNmt, elle inclut 49 espèces représentant les sept genres de la sous tribu et la majorité des sous-genres et séries. Les marqueurs ribosomiques sont mieux adaptés à la problématique que le marqueur mitochondrial. Le genre Psychodopygus est monophylétique. En raison du positionnement de Ny. richardwardi parmi les Trichophoromyia, nous concluons à la paraphylie des genres Nyssomyia et Trichophoromyia. Le genre Psathyromyia est également paraphylétique, tout comme le genre Martinsmyia. Le genre Bichromomyia serait le groupe frère du genre Psychodopygus et la validité du genre Vianniamyia, inclus dans le genre Psathyromyia doit être discutée. Des phylogénies moléculaires plus terminales ont été réalisées par comparaison de séquences de l'ITS2, de l'EF-1α et du cytochrome b.Chez les Psychodopygus de la série Guyanensis, une étude moléculaire couplée à une étude morphologique et morphométrique de morphotypes différents chez Ps. geniculatus, en sympatrie avec Ps. corossoniensis et Ps. luisleoni nous a conduit à décrire une espèce nouvelle pour la science : Ps. francoisleponti.Chez Pa. aragaoi, notre étude pilote basée sur l'analyse de morphotypes différents allopatriques et sympatriques renforce l'hypothèse de l'existence probable d'un complexe d'espèces chez ce taxon. Chez Ny. trapidoi, les analyses moléculaires et enzymatiques conduites sur des exemplaires clairs et foncés ne supportent pas la mise en évidence de deux populations comme cela avait été auparavant démontré. Nos approches épidémiologiques ont permis de mettre en évidence l'ADN d'Endotrypanum monterogeii chez plusieurs exemplaires de Ny. trapidoi. Si aucun phlebovirus n'a été détecté dans les échantillons étudiés, nous rapportons la présence d'un flavivirus chez Pa. abonnenci. Mots-clés: Psychodopygina, Equateur, ADN ribosomique, ADN mitochondrial, phylogénie, Endotrypanum. / Most Ecuadorian sand flies studied so far belong to Psychodopygina sub tribe and the present research uses morphometric and modern molecular techniques to answer many some questions regarding this taxon in Ecuador. We present phenetic and phylogenetic analyses based on the sequences of the domains D1, C2 and D2 of the 28S rDNA and cytochrome b mtDNA were used to test the classification of Psychodopygina sub tribe proposed by Galati (2010). Our study includes 49 species representing the seven genera included in the sub tribe and its main subgenera and series. The results support the monophyly of the genus Psychodopygus. The genera Psathyromyia, Nyssomyia and Trichophoromyia are paraphyletic. Bichromomyia is the sister group of Psychodopygus and the validity of the genus Viannamyia is doubtful because it is included inside the Psathyromyia genus. Our data strongly suggest the presence of two populations within Ps. geniculatus and the lack of intermediate forms between these two morphotypes incited us to describe a new sympatric species, Psychodopygus francoisleponti.We also carried out a pilot study based on the analysis of different allopatric and sympatric morphotypes of Pa. aragaoi which suggested the existence of a possible complex of species in this taxa.Finally, we analyzed of mitochondrial gene sequences and isoenzymes from Ny. trapidoi collecte from Ecuador and our result did not support the existence of two sibling species within as previously reported in the literature. From an epidemiological point of view, we emphasize the probable vectorial role of Nyssomyia trapidoi for Endotrypanum monterogeii. Moreover, no phlebovirus was detected in the processed sand flies whereas a flavivirus has been found in a pool of Psathyromyia. abonnenci females.Key words: Psychodopygina, Ecuador, ribosomal DNA, mitochondrial DNA, phylogeny, Endotrypanum.

CSIR / Translation initiation is a rate limiting step during protein biosynthesis. Initiation occurs by formation of an initiation complex comprising 30S subunit of ribosome, mRNA, initiator tRNA, and initiation factors. The initiator tRNA has a specialized function of binding to ribosomal P site whereas all the other tRNAs are selected in the ribosomal A site. The presence of a highly conserved 3 consecutive G-C base pairs in the anticodon stem of the initiator tRNA has been shown to be responsible for its P-site targeting. The exact molecular mechanism involved in the P-site targeting of the initiator tRNA is still unclear and focus of our study. Using genetic methods, we obtained mutant E. coli strains where initiator tRNA mutants lacking the characteristic 3-GC base pairs can also initiate translation. One such mutant strain, A30, was selected for this study. Using standard molecular genetic tools, the mutation was mapped and identified to be a mutation in a transcription remodeling factor, RapA (A511V). RapA is a transcription recycling factor and it displaces S1 when it performs its transcription recycling activity. We found this mutation to cause an increase in the S1-depleted ribosomes leading to decreased fidelity of translation initiation as the mutant RapA inefficiently displaces S1 from RNA polymerase complex. The mutation in the RapA was also found to cause changes in the transcriptome which leads to downregulation of major genes important for methionine and purine metabolism. Using mass spectrometric analysis, we identified deficiencies of methionine and adenine in the strain carrying mutant RapA. Our lab had previously reported that methionine and S-adenosyl methionine deficiency cause deficiency of methylations in ribosome which in turn decreases the fidelity of protein synthesis initiation. We used strains deleted for two newly identified methyltransferases, namely RlmH and RlmI, for our study and these strains also showed decreased fidelity of initiation. RlmH and RlmI methylate 1915 and 1962 positions of 23S rRNA respectively. We found that deletion of these methyltransferases also caused defects in ribosome biogenesis and compromised activity of ribosome recycling factor. We constructed phylogenetic trees of the initiator tRNA from 158 species which distinctly assembled into three domains of life. We also constructed trees using the minihelix or the whole sequence of species specific tRNAs, and iterated our analysis on 50 eubacterial species. We identified tRNAPro, tRNAGlu, or tRNAThr (but surprisingly not elongator tRNAMet) as probable ancestors of tRNAi. We then determined the factors imposing selection of methionine as the initiating amino acid. Overall frequency of occurrence of methionine, whose metabolic cost of synthesis is the highest among all amino acids, remains almost unchanged across the three domains of life. Our results indicate that methionine selection, as the initiating amino acid was possibly a consequence of the evolution of one-carbon metabolism, which plays an important role in regulating translation initiation. In conclusion, the current study reveals the importance of methylations in ribosome biogenesis and fidelity of translation initiation. It also strongly suggests a co-evolution of the metabolism and translation apparatus giving adaptive advantage to the cells where presence of methionine in the environment can be a signal to initiate translation with methionine initiator tRNA.