Ces dernières années ont vu se multiplier les études portant sur le positionnment du nucléosome. Ce phénomène est en effet essentiel pour comprendre correctement les processus liés à l'expression génique. Ces travaux soulignent notamment la multiplicité des facteurs qui interviennent dans le positionnement en vivo, toutefois le rôle de la séquence d'ADN elle même est bien reconnu que ce soit sous formes de séquences préférées ou "excluantes". Afin d'identifier les propriétés structurales et dynamiques des séquences qui possèdent une forte capacité à positionner le nucléosome, nous avons procédé à une série d'études structurales sur les oligomères d'ADN libres correspondant à la séquence de l'une des plus connues d'entre elles, la séquence 601. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à une séquence de 39 paires de bases correspondant à la moitié d'un tour complet autour du cœur d'histone. L'utilisation des méthodes de RMN permet de déterminer les propriétés d'oligomères en solution. Néanmoins la difficulté d'attribuer les résonances phosphore sur des séquences oligonucléotides longues nous a conduit à diviser la séquence d'intérêt en quatre parties égales (12bp) sur lesquelles les attribution penvent être réalisées. L'analyse des 72 déplacements chimiques du phosphore (&#948-P) et des 249 distances séquentielles inter-protons recueillies sur les oligomères montre que les mouvements de l'ADN à l'échelle de temps de la nanosecondes, des groupements phosphates, des sucres et des bases sont fortement couplés et directement reliés à la séquence dinucléotidique. Les données expérimentales recueillies dans ce travail sont en accord avec les prédictions de l'échelle TRX (Twist,Roll,X-disp) qui quantifie les mouvement à l'échelle de la nanoseconde de l'ADN-B. L'annotation de l'échelle TRX de la séquence 601 montre une alternance périodique de régions rigides et flexibles le long de la séquence, cette périodicité est de 10 pairs de bases. De façon frappante, cette alternance se superpose aux variations sinusoïdales des largeurs des petits sillons observées sur les structures cristallographiques des nucléosomes. L'élément TTAAA, a fait l'objet d'une attention particulière dans ce travail. Il est soupçonné d'être crucial dans le contexte de la formation des nucléosomes, cette séquence présente en effet quelques particularités remarquables, tels que la présence de plusieurs enchaînements dinucléotidiques riche en BI (dP décalé vers les hauts champs et distances inter-nucléotidiques courtes)- ceux-ci se trouvent associés à un petit sillon très étroit. Les résultats relatifs aux couplages dipolaires résiduels (RDC), qui reflètent l'angle de déviation entre le vecteur carbone-proton et l'axe l'ADN ont montré que les différences entre les couplages dipolaires résiduels de deux résidus successifs &#916-(RDC), sont également corrélées aux &#948-P. Ce résultat confirme définitivement que la structure et la dynamique des groupes phosphates, les positions relatives des bases et les conformations sucres de l'ADN-B sont fortement couplés. En outre, nos résultats permettent de commencer à déchiffrer le processus influençant la formation des nucléosomes, ils montrent que l'échelle TRX est un outil puissant de prédiction des conformations et la dynamique des ADN. / Nowadays, nucleosome positioning is being studied intensively due to the critical role in the regulation and transcription by modulating the accessibility of specific targeted sites for proteins in eukaryotic cell. As demonstrated by recent studies that positioning in vivo could be modulated by various factors, among which the role of DNA sequence is repeatedly underlined due to the form of preferred or excluding sequences. In an attempt to identify the structural and dynamic properties of sequences exhibiting strong ability to precisely position the nucleosome, we carried out a series of structural studies on free DNA oligomers corresponding to the core of this sequence. The synthetic 601 sequence was selected as a proper candidate for the experiment and the oligomers cover 39bp of the 5’ half of the sequence. The utilization of NMR technology allows the observation of the oligomer properties in solution. However, it’s difficult to assign phosphorus resonances signals to long DNA oligonucleotides, which could be realized to divide the sequence of interested part into four equivalents (12 bp). Analysis of a large set of NMR data on the four oligomers (72 dP (phosphorus chemical shift) and 249 sequential inter-proton distances) indicate the strong coupling between nanoseconde timescale motions of phosphate group and those involving sugar and bases. In the four dodecamers, the nanosecond timescale dynamics is dominated by the dinucleotide sequence, modulated at the tetranucleotide level. Importantly, the experimental data collected here validate our previously published NMR-based TRX scale that quantifies the nanosecond timescale intrinsic malleability of the ten complementary dinucleotides in B-DNA. The TRX annotation of the whole 601 sequence shows a 10 base-pair periodic alternation of stiff and flexible regions that can be exactly superimposed to the sinusoidal variations of minor groove width observed on the crystallographic structures of nucleosome. The TTAAA element was the subject of particular attention in this work. It is suspected to be crucial in the nucleosome formation context, exhibiting remarkable features, such as the constitution of a succession of BI-profiles (high-shifted dP and short internucleotide distances) associated to a narrow minor groove. Furthermore, the results related to the residual dipolar couplings (RDC), which reflect the deflection angle between carbon-proton vectors and the long axis of DNA have shown that the differences between the residual dipolar couplings of two successive residues, &#916-(RDC), are also correlated with &#61540-P. This result definitively confirms that the structure and the dynamic of phosphate group, bases and sugars in B-DNA are highly coupled. In addition, our results start to decipher the indirect readout process underlying the nucleosome formation. Further, they establish that the TRX scale is a powerful, predictive tool for better understanding DNA-protein interactions, based on flexibility criteria. It represents a new step towards a simplified determination of properties of DNA by NMR.

L’infection broncho-pulmonaire représente le problème majeur des malades atteints de la mucoviscidose. Plusieurs bactéries sont connues depuis des dizaines années comme les principaux agents responsables de ces infections (par exemple Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans…). Récemment, certains genres fongiques notamment les champignons filamenteux (comme Aspergillus, Scedosporium…) ont été identifiés comme des pathogènes émergeants ou ré-émergeants pouvant être responsables d’infection invasive. Ainsi, la détection des microorganismes impliqués dans ces colonisations et/ou infections respiratoires demeure importante sur le plan physiopathologique et clinique.Si la culture microbiologique reste la méthode la plus utilisée à ce jour pour le diagnostic des infections microbiennes, elle ne permet pas d’identifier les microbes non-cultivables ou difficiles à cultiver. Depuis quelques années, grâce au développement de la technique moléculaire de séquençage à haut-débit (next generation sequencing ou NGS), plusieurs études ont montré que l’écologie microbienne du poumon des patients atteints de la mucoviscidose est très complexe et correspond à une flore poly-microbienne, appelée le microbiote pulmonaire, comprenant non seulement des bactéries mais également des micromycètes (levures et/ou champignons filamenteux) et des virus et phages. Une dysbiose (modification en abondance et diversité) de cette flore pourrait influencer la fonction respiratoire et l’état clinique du patient.Alors que le microbiome bactérien et son rôle en pathogenèse sont largement étudiés, peu d’études ont porté sur la composante fongique (mycobiote/mycobiome) du microbiote pulmonaire. Notre travail de thèse s’inscrit dans les différents projets développés au sein de l’axe de recherche « Microbiote pro- et eucaryote pulmonaire » coordonné par le Pr Laurence Delhaes dans l’équipe Biologie et Diversité des Pathogènes Eucaryotes Emergeants (BDPEE) dirigée par le Dr Eric Viscogliosi. Il se focalise sur l’analyse NGS du microbiote pro- et eucaryotique respiratoire chez les patients atteints de la mucoviscidose et notamment la comparaison de différentes approches méthodologiques en vue d’une optimisation et standardisation de la méthode.Dans un premier temps, nous présenterons une synthèse des connaissances actuelles d’une part des phénomènes de colonisations/infections fongiques chez les patients atteints de mucoviscidose et d’autre part dans le domaine du microbiote pulmonaire et surtout du mycobiote pulmonaire autour duquel notre équipe se focalise.2Dans un deuxième temps, nous avons travaillé à mieux adapter l’approche NGS aux études du microbiote pulmonaire dans la mucoviscidose. En effet, le séquençage à haut-débit est une technique puissante mais pour laquelle des biais peuvent être introduits à de nombreuses étapes méthodologiques. Un des biais les plus importants est que l’approche NGS ne permet pas de différencier les microorganismes vivants, des cellules mortes ou endommagées, ni de l’ADN extracellulaire. Dans le contexte de notre travail –celui du microbiote pulmonaire chez des patients atteints de mucoviscidose et souvent exposés aux antibiotiques par voie intraveineuse à forte dose, l’analyse NGS pourrait évaluer incorrectement l’abondance et la diversité de ce microbiote pulmonaire. Un prétraitement des échantillons par propidium monoazide (PMA), qui permet de cibler sélectivement l’ADN des cellules vivantes, pourrait être une solution pour palier à cette limite. Notre étude avait donc comme objectif de déterminer si un prétraitement par PMA des expectorations modifiait le microbiote pro- et eucaryote pulmonaire analysé par NGS. Nous discutons l’intérêt et la relevance clinique de cette approche « PMA - NGS » permettant une quantification isolée des microorganismes vivants dans le contexte de la mucoviscidose. / Chronic pulmonary infection results in an irreversible decline in lung function in patients with cystic fibrosis (CF). While several bacteria are known as main causes for these infections (for example: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans...), more recently some fungal genera including filamentous fungi (such as Aspergillus, Scedosporium...) have also been identified as emerging or re-emerging pathogens able to cause invasive mycosis. Thus, the identification of the microorganisms involved in the respiratory colonizations and/or infections has become essential.Still now culture methods remain the gold standard for diagnostic of microbial infections. However, it could not identify non-culturable or difficult-to-cultivate microorganisms. Thanks to the development of high-throughput sequencing (next generation sequencing or NGS), recent studies have shown that the lung of patients with CF is a complex poly-microbial flora, also called the CF lung microbiota, which includes not only bacteria but also fungi (yeast and/or filamentous fungi), and viruses and phages. Dysbiosis (loss of abundance and/or diversity) of the lung microbiota has been associated with the patient's decreased lung function and poor clinical status.While lung bacteriota and its role in pathogenesis have widely been studied, few research studies focus on the fungal component (mycobiota/ mycobiome) of the lungs. Our thesis (PhD work) focuses on NGS analysis of pro- and eukaryotic lung microbiota in CF patients, in particular on the comparison of different methodological approaches to optimize and standardize the NGS protocol. This project has been developed under the supervision of Pr. Laurence Delhaes in the “Biology and Diversity of Eukaryotic Emerging Pathogens” team directed by Dr. Eric Viscogliosi.Firstly, we present a state of art on the current knowledge on the fungal colonization/infections risk in CF as well as the development of new concepts of lung microbiota and lung mycobiota on which our team focuses.Secondly, we applied the NGS approach to study the pro- and eukaryotic microbiota in the sputum samples of CF patient lung. Indeed, NGS is a powerful technique that may introduce biases on numerous methodological steps. One of the most important biases is that this technique could not differentiate among the living microorganisms, the dead or damaged cells, and the extracellular DNA. In the context of the CF lung microbiota which is often exposed to high-dose intravenous antibiotics, the analysis by NGS might evaluate4inaccurately the abundance and the diversity of the lung microbiota. Pretreatment of samples by propidium monoazide (PMA), which can target selectively the DNA of viable cells, could be a solution to overcome this limitation. Our study aimed to determine whether a sample pretreatment with PMA modified the lung pro- and eukaryotic microbiota analyzed by NGS. We discuss the clinical relevance of this approach "PMA - NGS" in the context of CF patients to a better quantification of living microorganisms.

La microfluidique en gouttes permet l’analyse de systèmes biochimiques à grand débit, en utilisant de faibles volumes réactionnels, à faible coût. Dans l’état de l’art, le volume des gouttes varie entre 2 pL et 4 nL, un millier à million de fois inférieur au volume d’un puit de microplaque. Miniaturiser d’avantage les volumes réactionnels permettrait d’augmenter encore les débits d’analyse, de d’avantage réduire les coûts et ouvre également l’accès à de nouvelles études, telles que les études sur molécule unique ou la délivrance de médicaments. La première partie de ce travail de thèse concerne la miniaturisation des opérations classiques de la microfluidique en gouttes à l’échelle femtolitrique: production, stabilité, biocompatibilité, mélange en gouttes, coalescence, tri, division de gouttes, production à la demande ont été démontrés avec succès sur des gouttelettes femtolitriques. Le tout a été permis en restant dans les limites de la technologie PDMS et des standards classiques de la lithographie. La seconde partie s’intéresse à certaines applications biologiques issues du couplage de gouttelettes picolitriques et femtolitriques. Une plateforme permettant l’encodage in situ de gouttes à l’aide de codes barres d’ADN lisibles par séquençage a été construite. Deux autres applications ont été envisagées: un projet concernant l’émergence des chromosomes dans un monde prébiotique qui nécessitait des facteurs de dilution de l’ordre de 1:1000 et un projet de cartographie génotype-phénotype sur une enzyme qui nécessitait deux dilutions par 10 ont bénéficié de la miniaturisation à l’échelle femtolitrique. / Droplet-based microfluidics has demonstrated its multiple advantage over standard microtiter plates technologies by increasing analysis throughputs, decreasing costs and enabling the encapsulation of single cells into individual reservoirs. In the state-of-the-art, droplet volumes usually range from 2 pL to 4nL, one thousand to one million times smaller than microtiter plate wells. This PhD work focuses on the miniaturization of biological reservoirs down to the femtoliter scale which would enable an increase of throughputs of analysis and open up access to new studies, such as single-molecule studies or drug delivery. The first part of this manuscript concentrates on the miniaturization of elementary operations of droplet-based microfluidics down to the femtoliter scale. Production, mixing, electrocoalescence, DEP sorting, splitting, drop-on-demand, stability, biocompatibility were successfully demonstrated on droplets of a few micrometers diameter. The second part of this manuscript focuses on some biological applications that were developed with the LBC. A platform for the in situ encoding of droplets with DNA barcodes readable per sequencing was developped. Two other applications were envisioned: a project studying the conditions that prevailed the apparition of chromosomes in an early RNA world and a genotype-phenotype mapping project benefited from downscaling to the femtoliter scale.

Le but de ce travail de thèse a été d’identifier par séquençage d’exomes, de nouveaux gènes de prédisposition dans 2 pathologies rares dont l’étiologie est peu connue. Le 1er projet a porté sur une famille à 3 cas de sarcomes, sans mutation du gène TP53. Nous avons identifié une mutation pathogénique du gène CDKN2A, dans les 3 cas. Le gène CDKN2A étant le gène majeur de prédisposition au mélanome, nous avons recherché parmi 3 collections différentes des cas de sarcomes associés à une mutation du gène CDKN2A. Nous avons identifié 8 cas de sarcomes indépendants, porteurs d’une mutation du gène CDKN2A et montré une perte d’hétérozygotie au niveau du site de la mutation constitutionnelle CDKN2A dans 5/7 cas, montrant ainsi une perte de fonction complète. Les sarcomes étant rares chez les porteurs de mutations CDKN2A, nous avons recherché des variants rares modificateurs potentiels, par séquençages d’exomes constitutionnels des 8 cas index, et identifié 3 variants du gène PDGFRA. Des études de modélisation ont montré que 2 de ces variants, pourraient avoir un impact sur la structure du domaine extracellulaire de la protéine PDGFRA. Nous avons ainsi démontré que le gène CDKN2A peut prédisposer aux sarcomes et identifié PDGFRA comme gène modificateur potentiel.Dans le second projet nous avons travaillé sur les mélanomes de l’enfant, d’apparence sporadique. Notre hypothèse de travail était que ces mélanomes surviennent suite à un accident génétique de novo. Nous avons analysé des exomes constitutionnels de 41 trios (enfant atteint et ses 2 parents sains). Nos analyses bio-informatiques ont montré l’existence de mutations de novo post-zygotiques de gènes impliqués dans le développement de la crête neurale ou le cancer, dans 5 cas. Les analyses plus complètes des exomes tumoraux sont en cours, ainsi que des études fonctionnelles des gènes et de leurs mutations, dans un modèle d’embryon de poulet. Ce travail permettra d’accroitre la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires dérégulés dans ces maladies, ouvrant ainsi, de nouvelles perspectives thérapeutiques. / The aim of this thesis was to identify by sequencing of exomes new predisposing genes in 2 rare pathologies whose etiology is not well known.The first project involved a family with 3 cases of sarcomas, without mutation of TP53 gene. We identified a pathogenic mutation of the CDKN2A gene, in the 3 cases. Since CDKN2A gene is the major melanoma predisposing gene, we have searched in 3 different collections, sarcoma cases link to CDKN2A mutations. In total, we have identified 8 independent sarcomas cases, carrying a germline mutation of the CDKN2A gene and showed a loss of heterozygosity at the site of the constitutional mutation of CDKN2A in 5/7 cases, thus proving a complete loss of function. Since sarcomas are rare in carriers of CDKN2A mutations, we looked for potential modifying rare variants, by sequencing constitutional exomes of the 8 index cases, and identified 3 variants of the PDGFRA gene. Modeling studies have shown that 2 of these variants could have an impact on the structure of the extracellular domain of the PDGFRA protein. We have thus demonstrated that the CDKN2A gene can predispose to sarcomas and identified PDGFRA as a potential modifier gene. In the second project, we worked on childhood melanomas, of sporadic appearance. Our working hypothesis was that these melanomas occur as a result of a de novo genetic accident. We analyzed constitutional exomes of 41 trios (affected child and his 2 healthy parents). Our bioinformatics analyzes identified the existence of de novo post-zygotic mutations of genes involved in neural crest development or cancer, in 5 cases. More complete analyzes of tumor exomes are underway, as well as functional studies of genes and their mutations, in a chick embryo model.This work improves the understanding of molecular and cellular mechanisms that are deregulated in these diseases, thus opening up new therapeutic perspectives.

Le cancer est une maladie du génome. La transformation tumorale résulte de l’acquisition de mutations somatiques via divers processus mutagènes opérant tout au long de la vie du patient. Les mécanismes à l’origine des mutations incluent les erreurs de réplication, les défauts de réparation de l’ADN, les modifications de base spontanées ou catalysées par des enzymes cellulaires, et l’exposition à des agents mutagènes endogènes (ROS) ou exogènes (tabac, UV…). Au cours de ma thèse, j’ai analysé des données de séquençage exome et génome complet de tumeurs hépatiques pour décortiquer les mécanismes à l’origine des mutations dans ces tumeurs, leur interaction avec les facteurs de risque, les processus cellulaires, les gènes drivers, et leur évolution au cours de la maladie. J’ai utilisé des méthodes statistiques existantes et dévoloppé des outils bioinformatiques innovants pour:- extraire les signatures de mutations et de réarrangements structuraux à l’aide de données de séquençage à haut débit- identifier les facteurs de risque et/ou les altérations génétiques à l’origine de chacune- prédire les mécanismes mutagènes à l’origine de chaque mutation somatique- explorer les corrélations entre la densité des mutations et les processus cellulaires comme la réplication et la transcription- reconstruire l’histoire clonale des tumeurs et dater l’apparition des signatures mutationnelles et des aberrations chromosomiques.Ces approches innovantes m’ont permis d’identifier 10 signatures mutationnelles: 5 signatures ubiquitaires à l’œuvre dans toutes les tumeurs hépatiques mais modulées par les facteurs de risque (sexe, alcool, tabac), et 5 signatures sporadiques opérant dans moins de 5% des tumeurs et associées à des étiologies connues (aflatoxine B1, acide aristolochique) ou restant à identifier. J’ai aussi mis en évidence 6 signatures de réarrangements structuraux, notamment des phénotypes duplicateurs et déléteurs, spécifiques de petits groupes de tumeurs. Chaque processus mutagène est modulé différemment par la réplication et la transcription. Les signatures liées à des molécules formant des adducts sur l’ADN (hydrocarbures polycycliques aromatiques, aflatoxine B1, acide aristolochique) sont nettement moins actives dans les gènes fortement exprimés suite à l’action du transcription-coupled repair, alors que la signature 16, liée à l’alcool, présente un motif unique de transcription-coupled damage. Une corrélation étonnante entre la densité des petites insertions et délétions (indels) et l’expression des gènes a été identifiée, conduisant à une accumulation considérable d’indels dans les gènes très forterment exprimés dans les cellules hépatiques. Enfin, l’histoire clonale des tumeurs hépatiques montre l’évolution des signatures mutationnelles au cours du temps et identifie l’accumulation de gains chromosomiques multiples comme un évènement tardif entraînant probablement une croissance de la tumeur jusqu’à une taille détactable en clinique. Ces résultats nous éclairent sur les mécanismes à l’origine des altérations génomiques dans l’histoire naturelle des cancers du foie. / Cancer is a disease of the genome. A normal cell goes rogue and is transformed into a cancerous cell due to acquired somatic mutations in its genome. The catalogue of these somatic mutations observed in the cancer genome is the outcome of multiple mutational processes that have been operative over the lifetime of a patient. These mutational processes that have occurred throughout the development of cancer may be infidelity of the DNA replication machinery, impaired DNA repair system, enzymatic modifications of DNA, or exposures to exogenous or endogenous mutagens. Each mutational process leaves a characteristic pattern – a “mutational signature” on the cancer genome. Various genomic features related to genome architecture, including DNA replication and transcription, modulate these mutational processes. During my PhD, I analyzed whole exome and whole genome sequencing data from liver tumors to understand the mutational processes remodeling these tumor genomes, their interaction with risk factors, cellular processes, and driver genes, and their evolution along the tumor histories. For that aim, I used existing statistical methods and I developed innovative computational tools to:- extract mutational and structural variant signatures from next-generation sequencing data- identify risk factors or genetic alterations underlying each process- predict the mutational process at the origin of each somatic mutation- explore correlations between mutation rates and cellular processes like replication and transcription- reconstruct the clonal history of a tumor and the timing of mutational processes and copy-number changes These innovative analytical strategies allowed me to identify 10 mutational signatures: 5 ubiquitous signatures operative in every liver cancer but modulated by risk factors (gender, alcohol, tobacco), and 5 sporadic signatures operative in <5% of HCC and associated with specific known (aflatoxin B1, aristolochic acid) or unknown mutational processes. I also identified 6 structural variant signatures, including striking duplicator or deletor phenotypes in rare tumors. Each mutational process showed a different relationship with replication and transcription. Signatures of bulky DNA adducts (polycyclic aromatic hydrocarbons, aflatoxin B1, aristolochic acid) strongly decreased in highly expressed genes due to transcription-coupled repair, whereas the alcohol-related signature 16 displayed a unique feature of transcription-coupled damage. A striking positive correlation between indel rate and gene expression was observed, leading to recurrent mutations in very highly expressed tissue-specific genes. Finally, reconstructing the clonal history of HCC revealed the evolution of mutational processes along tumor development and identified synchronous chromosome duplications as late events probably leading to fast tumor growth and clinical detection of the tumor. Together, these findings shed new light on the mechanisms generating DNA alterations along the natural history of liver cancers.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le metabarcoding, un domaine alliant les technologies de séquençage à haut débit et l’identification d’organismes biologiques via l’ADN, a permis d’ouvrir les portes à un grand nombre de nouveaux projets scientifiques. Il existe une multitude de programmes capables d’effectuer les analyses, mais ces programmes ne sont souvent pas adaptés pour des projets particuliers comme la détection de pathogènes. ADAPTI a été développé afin de répondre à ce manque. ADAPTI est une méthodologie complète d’analyse adaptée pour la détection de pathogènes, mais capable de s’adapter à différents contextes de recherche grâce à son développement flexible et extensible. Toute la méthodologie a été mise à l’épreuve afin d’évaluer sa capacité, tant au niveau de l’efficacité en temps, mémoire vive et en espace disque, qu’au niveau de la validité et l’exactitude des résultats. Il a été démontré qu’ADAPTI est non seulement capable de fournir des résultats sur des jeux de données de grande taille, mais il le fait avec une grande sensibilité tout en conservant une efficacité multifilaire acceptable. ADAPTI a ensuite été comparé à des programmes open source en utilisant un jeu de données standardisé et il a été déterminé qu’il permet d’effectuer de meilleures analyses que les autres programmes testés. Il a été déterminé que la haute sensibilité fait la force d’ADAPTI, mais aussi l’une de ses faiblesses en permettant une plus grande quantité de séquences « bruits », lesquelles nécessitent des traitements supplémentaires. Certains programmes composant la suite d’ADAPTI nécessitent de l’optimisation au niveau de l’utilisation de la mémoire vive, ce qui est souvent un enjeu en bio-informatique. Il sera aussi nécessaire d’implémenter des capacités de calcul parallèle massif, car l’évolution rapide des technologies de séquençage rendra ADAPTI inefficace dans sa forme actuelle d’ici quelques années. Somme toute, ADAPTI est une méthodologie fonctionnelle capable de répondre à la demande en pathologie.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 janvier 2024) / Les protéines sont des machines moléculaires essentielles au fonctionnement des organismes vivants. Malgré plus de 60 ans de recherche en ce sens, notre compréhension des mécanismes qui façonnent leur évolution reste loin d'être complète. Les nouvelles méthodes d'édition de génome offrent de nouvelles possibilités en termes de méthodologie pour l'étude à haut débit de l'effet des mutations sur la fonction des protéines. Les connaissances découlant de ces nouvelles approches ont un potentiel important pour améliorer la santé humaine, animale et végétale. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont en premier lieu élaboré une nouvelle méthodologie basée sur l'édition de base pour l'étude à haut débit de l'effet des mutations sur la fonction des protéines. Cette approche a identifié plus de 700 sites ayant une importance fonctionnelle dans les gènes essentiels de levure. Les données générées par cette expérience ont aussi permis d'identifier des propriétés de sgRNA déterminantes pour l'efficacité de l'édition base. Dans le deuxième chapitre, nous avons utilisé une approche de mutagenèse systématique pour caractériser les mutations menant à la résistance à un antifongique, la 5-fluorocytosine, dans le gène FCY1. Nous avons en même temps pu mesurer les compromis résistance-fonction pour les mutants de ce gène, et pu valider la capacité de notre jeu de données à prédire le phénotype de résistance de mutants d'orthologues provenant d'espèces de levures pathogènes. Finalement, nous avons utilisé nos connaissances des propriétés de FCY1 acquises au chapitre précédent pour en faire un modèle d'évolution des protéines. Plus précisément, nous avons exploré le rôle potentiel de l'épistasie en trans entre des mutants de perte de fonction dans la transition d'un complexe homomérique vers hétéromérique suite à une duplication de gène. Nous avons découvert des centaines de paires d'allèles inactifs de FCY1 pouvant se complémenter, et avons pu explorer les propriétés de ces mutants et des complexes hétéromériques résultants. / Proteins are molecular machines essential to the functioning of living organisms. Despite more than 60 years of research in this direction, our understanding of the mechanisms that shape their evolution remains far from complete. Recently developed genome tools methods offer new possibilities in terms of methodology for the high-throughput study of the effect of mutations on protein function. The knowledge resulting from these new approaches has significant potential in human, animal, and plant health. In the first chapter of this thesis, we developed a new methodology based on base editing for the high-throughput study of the effect of mutations on protein function. This approach identified more than 700 sites of functional importance in essential yeast genes. The data generated by this experiment also made it possible to understand sgRNA properties that are decisive for the efficiency of base editing. In the second chapter, we used a systematic mutagenesis approach to characterize the mutations leading to resistance to an antifungal, 5-fluorocytosine, in the FCY1 gene. At the same time, we measured the resistance-function trade-offs for mutants of this gene and validated the ability of our dataset to predict the resistance phenotype of orthologous mutants from pathogenic species. Finally, we used our knowledge of the properties of FCY1 acquired in the previous chapter to use it as a model for protein evolution. Specifically, we explored the potential role of trans epistasis between loss-of-function mutants in the transition from a homomeric to a heteromeric complex following gene duplication. We have discovered hundreds of pairs of inactive FCY1 alleles that can complement each other, and have been able to explore the properties of these mutants and the resulting heteromeric complexes.

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Les technologies « Next Generation Sequencing» (NGS), qui permettent de caractériser les séquences génomiques à un rythme sans précédent, sont utilisées pour caractériser la diversité génétique humaine et le transcriptome (partie du génome transcrite en acides ribonucléiques). Les variations du niveau d’expression des gènes selon les organes et circonstances, sous-tendent la différentiation cellulaire et la réponse aux changements d’environnement. Comme les maladies affectent souvent l’expression génique, les profils transcriptomiques peuvent servir des fins médicales (diagnostic, pronostic). Différentes méthodes d’apprentissage artificiel ont été proposées pour classer des individus sur base de données multidimensionnelles (par exemple, niveau d’expression de tous les gènes dans des d’échantillons). Pendant ma thèse, j’ai évalué des méthodes de « machine learning » afin d’optimiser la précision de la classification d’échantillons sur base de profils transcriptomiques de type RNA-seq. / Since a decade, “Next Generation Sequencing” (NGS) technologies enabled to characterize genomic sequences at an unprecedented pace. Many studies focused of human genetic diversity and on transcriptome (the part of genome transcribed into ribonucleic acid). Indeed, different tissues of our body express different genes at different moments, enabling cell differentiation and functional response to environmental changes. Since many diseases affect gene expression, transcriptome profiles can be used for medical purposes (diagnostic and prognostic). A wide variety of advanced statistical and machine learning methods have been proposed to address the general problem of classifying individuals according to multiple variables (e.g. transcription level of thousands of genes in hundreds of samples). During my thesis, I led a comparative assessment of machine learning methods and their parameters, to optimize the accuracy of sample classification based on RNA-seq transcriptome profiles.