Dans la première partie du travail, suite à deux épidémies à K. pneumoniae productrices de carbapénémases, nous avons défini une stratégie précise qui nous a permis de maîtriser et de stopper la première épidémie et de très rapidement contrôler la seconde. Des mesures similaires ont été appliquées avec succès dans d'autres hôpitaux en France, en Israël et aux USA. Ces deux épidémies étant liées à la diffusion de clone épidémique, nous avons étudié la prévalence des facteurs de virulence parmi une collection internationale de souches de K. pneumoniae multirésistantes aux antibiotiques. Nous avons pu établir un lien entre résistance et virulence avec, en particulier une forte prévalence (42%) d'un îlot de pathogénicité portant la yersiniabactine, Ybts, qui joue essentiel dans l'expression du phénotype hyper-virulent de Yersinia sp. Dans la deuxième partie, nous montrons que les souches de K. pneumoniae productrices de BLSE de type CTX-M-15, sont associées à des plasmides appartenant au groupe d'incompatibilité IncF alors que les plasmides portant les gènes blaSHV et ceux portant les carbapénémases, sont moins bien caractérisés et souvent non typables par la méthode de PCR. Ces résultats incitent au séquençage des plasmides. Nous avons procédé au séquençage et à l'annotation du premier plasmide portant à la fois KPC-2 et SHV-12 isolé d'une souche de K. pneumoniae. Cette analyse nous a permis de mettre en évidence un nouveau groupe d'incompatibilité (IncX) impliqué pour la première fois dans la multirésistance chez K. pneumoniae. Nous avons pu montrer l'insertion du transposon Tn4401 (KPC) au sein du transposon portant la BLSE de type SHV-12

Mes travaux ont porté sur l'étude de deux familles de protéines de liaison à l'ARN, la famille des ARE-BP (AU-rich elements binding protein) et la famille des PTB (Polypyrimidine tract binding protein) au cours du développement chez le xénope. L'étude de l'expression de cinq membres de la famille ARE-BP a mis en évidence une redondance d'expression tissulaire et temporelle entre quatre de ces ARE-BP (AUF1, KSRP, HuR et TIA1). A l'inverse, l'expression atypique de TTP a permis de suggérer son implication dans l'hématopoïèse. Mes travaux sur la famille PTB (PTBP1, PTBP2, PTBP3) ont montré que chacun des paralogues présente une expression spécifique ce qui suggère qu'elles aient des fonctions différentes lors du développement. Des résultats du laboratoire montraient que l'inactivation de PTBP1 ou de EXOSC9, un composant de l'exosome ARN, entraînait des défauts de morphogenèse de l'épiderme dorsal. Afin d'identifier l'origine moléculaire de ces défauts, j'ai réalisé l'analyse transcriptomique par séquençage à haut débit (RNA-Seq) des morphants PTBP1 et EXOSC9. J'ai produit des banques d'ADNc à partir des morphants ou d'embryons témoins et celles-ci ont été séquencées au Génoscope. L'analyse d'une cible connue de PTBP1 a montré que des modifications minoritaires de l'épissage étaient détectées à partir de ces données. De plus ces défauts d'épissage ne sont pas retrouvés dans les morphants EXOSC9, validant son utilisation comme crible additionnel permettant d'exclure les évènements d'épissage qui ne sont pas impliqués dans le défaut d'épiderme. Une approche gène candidat a été initiée afin de cibler l'analyse de transcrits impliqués dans la morphogenèse de l'épiderme dorsale.

Les Spartines jouent un rôle écologique majeur sur les marais salés. Elles représentent un excellent modèle pour appréhender les conséquences écologiques de la spéciation par hybridation et polyploïdie dans le contexte d'invasion biologique. On s'intéresse plus particulièrement, à l'hybridation récente entre une espèce hexaploïde d'origine américaine Spartina alterniflora et une espèce hexaploïde européenne S. maritima ayant donnés deux hybrides F1 (S. x townsendii et S. x neyrautii) et la nouvelle espèce envahissante allododécaploïde (S. anglica). Les nouvelles technologies de séquençage haut-débit facilitent l'exploration de ces génomes peu connus. L'assemblage et l'annotation d'un transcriptome de référence ont permis d'annoter 16 753 gènes chez les spartines hexaploïdes et d'identifier des gènes d'intérêts écologique et évolutif. Une sélection de ces gènes a ensuite été analysée à travers une étude d'expression par PCR quantitative sur les populations naturelles des 5 espèces du complexe. Les résultats ont permis de mettre en évidence une expression homogène intra-populations mais une grande variabilité entre les espèces. L'analyse du génome des Spartines a ciblé prioritairement le développement de ressources génomiques concernant l'espèce S. maritima pour l'analyse des compartiments codant et répété à l'aide de séquençage d'une banque BAC et d'un run de pyroséquençage d'ADN génomique. Les analyses ont permis d'évaluer une proportion d'éléments répétés représentant près de 30% du génome. Les données générées ont alors été comparées avec les génomes séquencés phylogénétiquement proches et ont permis de premières comparaisons entre les spartines et les autres Poaceae.

Les myopathies congénitales sont des maladies neuromusculaires dont le diagnostic est établi grâce aux données cliniques, histologiques et génétique. Cependant, le diagnostic génétique est manquant pour la moitié des patients, ce qui suggère de nouveaux gènes impliqués. Le but de mon projet était d'identifier de nouveaux gènes de myopathies congénitales et de valider l'impact des mutations trouvées. En utilisant une stratégie d'analyse de séquençage d'exomes de patients déjà exclus pour les gènes connus, nous avons mis en évidence deux nouveaux gènes impliqués dans les myopathies congénitales. Des mutations récessives dans le gène PYROXD1, codant pour une oxydoréductase, causent une myopathie apparaissant à l'enfance avec des défauts spécifiques en histologie. Grâce à un modèle animal, nous avons montré que les mutations impactaient l'activité enzymatique de la protéine. Des mutations dominantes ou récessives dans le gène CACNA1S causent une myopathie avec un phénotype similaire pour toutes les mutations. Les études fonctionnelles ont montré que les mutations causaient un défaut dans le couplage excitation-contraction. / Congenital myopathies are neuromuscular diseases diagnosed by clinical, histological and genetic data. However, the genetic diagnosis is missing for half of the patients, suggesting new genes involved. The goal of my project was to identify new genes of congenital myopathies and validate the impact of the mutations. Using a strategy of analyzing DNA sequencing of patients already excluded for known genes, we have identified two new genes involved in congenital myopathies. Recessive mutations in the PYROXD1 gene, encoding an oxidoreductase, cause a myopathy with childhood-onset and a histology specific spectra. Functionnal studies showed that the mutations have an effect on the enzymatic activity of the protein. We showed that dominant or recessive mutations in the CACNA1S gene cause a neonatal onset myopathy with a similar phenotype for all found mutations.

L’activation d’oncogènes entraine une prolifération aberrante des cellules, un stress réplicatif et des cassures de l’ADN. Un lien a été établi entre l’instabilité génomique résultant des cassures et l’inhibition de checkpoints entrainant l’accumulation de mutations et finalement le cancer (Halazonetis et al. 2008). Cependant, les mécanismes liant ces différents évènements n’ont pas encore été caractérisés. Notre hypothèse est que la prolifération incontrôlée des cellules augmente les incidents dus aux conflits entre les polymérases responsables de la réplication et celles responsables de la transcription. Lors de la rencontre des deux polymérases, l’accumulation de surenroulements positifs de l’ADN induit un blocage des fourches de réplication. Ceci crée des zones de fragilité, notamment dues à l’exposition d’ADN simple brin, et pourrait être à l’origine des cassures observées chez les cellules tumorales. Pour valider cette hypothèse, les biologistes de l'équipe ont étudié plusieurs lignées de cellules HeLa dans lesquelles les conflits réplication-transcription sont augmentés et j'ai réalisé l'analyse bioinformatique des approches génomiques suivantes :-DRIP-seq pour la détection des R-loops, une structure double brin hybride ADN/ARN qui se forme lors de la transcription, exposant ainsi un brin d’ADN simple brin.- ChIP-seq de γ-H2AX, une marque d’histone indiquant les cassures de l’ADN.-ChIP-seq de phospho-RPA (S33), un substrat de la kinase ATR au niveau des fourches bloquées. Pour chaque expérience, nous avons utilisé une lignée contrôle et deux lignées dans lesquelles TOP1 et ASF/SF2 sont appauvries avec un shRNA inductible (shTOP1 et shASF). La Topoisomérase I (TOP1) est une enzyme qui relaxe les surenroulements de l’ADN. Le complexe ASF/SF2 est un facteur d’épissage responsable entre autres de l’assemblage des mRNP (ribonucleoprotein particles) au moment de la transcription, qui limitent la formation des R-loops. L’analyse bioinformatique de ces données, ainsi que d'autres données de la littérature, m'a permis d'identifier des régions à risque du génome, localisées en aval de gènes fortement transcrits et répliqués précocement en phase S par des fourches progressant en sens opposé à la transcription. J’ai également observé que les gènes impliqués dans le cancer sont surreprésentés dans ces régions à risque. / Oncogenes activation promotes aberrant cell proliferation, increasing replication stress and DNA damage. It has been proposed that genomic instability leads to checkpoints inhibition and promotes cancer development (Halazonetis et al. 2008). However, the link between aberrant proliferation, replication stress and DNA breaks is still unclear. We hypothesized that aberrant proliferation leads to more incident due to DNA and RNA polymerases encounter and stalling. When the two polymerases encounter, the accumulation of positive-supercoiled DNA between two polymerases induces fork stalling, resulting in the formation of fragile structures such as single-stranded DNA (ssDNA). These ssDNAs formed at stalled forks could be a source for DNA breaks, promoting the development of cancer cells. To validate this hypothesis, biologists from our team have worked on HeLa cell lines with increased replication-transcription conflicts. I perform the bioinformatics analysis of the following genomic data:- DRIP-seq: R-Loops positioning on genome using immunoprecipitation on DNA/RNA hybrids.-γ-H2AX ChIP-Seq: Gamma-H2AX is an histone mark found at DNA breaks.-pRPA ChIP-Seq : Positioning of stalled forks using the substrate of ATR kinase, phospho-RPA (S33) as a marker.Each data was produced on control cells and two cell lines where TOP1 and ASF/SF2 were depleted by as inducible shRNA (shTOP1 and shASF). Topoisomerase 1 is a topological enzyme that unwinds DNA when supercoiling accumulates. ASF/SF2 is part of the splicing complexes that processes mRNP (messenger ribonucleoprotein particles) to prevent the accumulation of R-loops during transcription. Using these data and others from literature, I determined that regions having higher risk to induce replication stress are located downstream of highly transcribed and early replicated genes, and preferentially with head-on collision between DNA and RNA polymerases. I also revealed that cancer-related genes are enriched in these regions of the genome.

Les gènes RUNX1 et CBFB codent pour les sous-unités du core binding factor (CBF), facteur de transcription hétérodimérique essentiel de l’hématopoïèse définitive. La dérégulation du CBF est l'une des anomalies les plus fréquemment rencontrées dans les hémopathies malignes. Puisque la perturbation seule du CBF est insuffisante au développement d’une leucémie aiguë myéloïde (LAM), les LAM impliquant le CBF sont considérées comme des modèles de leucémogénèse multi-étapes, nécessitant la coopération d’anomalies génétiques additionnelles.Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux LAM de type CBF, caractérisées soit par une t(8;21)/fusion RUNX1-RUNX1T1 soit par une inv(16)/fusion CBFB-MYH11, ainsi qu’aux LAM avec mutations germinales de RUNX1 (définissant la thrombopénie familiale avec prédisposition aux leucémies aiguës ou FPD/AML). Afin d’identifier des anomalies additionnelles, nous avons étudié les prélèvements de patients atteints de LAM CBF inclus dans les essais français ELAM02 (0-18 ans) et CBF2006 (18-60 ans) par séquençage à haut débit (n=215) et single nucleotide polymorphism-array (n=198). Les échantillons de 25 individus atteints de FPD/AML (issus de 15 familles), diagnostiqués entre 2005 et 2014, ont également été séquencés au stade thrombopénique et au moment de la transformation en leucémie aiguë.Dans les LAM CBF, les mutations activatrices des voies tyrosines kinases (TK) sont les événements les plus fré-quents quel que soit le sous-type de LAM CBF [t(8;21) ou inv(16)], comme cela a déjà été rapporté dans d’autres études. En revanche, les mutations affectant les gènes du remodelage chromatinien ou du complexe de la cohésine sont identifiées à des fréquences élevées (41% et 18% respectivement) dans les LAM avec t(8;21) tandis qu’elles sont pratiquement absentes dans les LAM avec inv(16). Dans les LAM avec t(8;21), la coexistence de ces mutations avec les mutations de type TK est associée à un pronostic défavorable suggérant une synergie entre ces événements. D'autres événements fréquemment retrouvés incluent les mutations de ZBTB7A et DHX15 dans les LAM avec t(8;21) (20% et 6% respectivement) et les délétions/mutations de FOXP1 dans les LAM avec inv(16) (7%). Enfin, nous avons décrit la perturbation de CCDC26 comme une possible lésion associée à une signalisation aberrante des TK dans les LAM CBF (4,5% des cas).Dans les FPD/AML, l'analyse mutationnelle a révélé l'acquisition d'un deuxième événement impliquant RUNX1 chez tous les patients ayant développé une LAM. Ce deuxième événement correspondait soit à une mutation somatique du second allèle de RUNX1 soit à la duplication de la mutation germinale de RUNX1 (par perte d'hétérozygotie sans anomalie du nombre de copies ou trisomie 21 acquise). En pratique clinique, cela suggère que la présence de deux mutations différentes de RUNX1 ou d'une seule mutation avec un ratio allélique supérieur à 50% chez un patient atteinte de LAM doit alerter sur la possibilité d’un syndrome FPD/AML sous-jacent. / RUNX1 and CBFB encode subunits of the core binding factor (CBF), a heterodimeric transcription factor required for the establishment of definitive hematopoiesis. Deregulation of the CBF is one of the most frequent aberrations in hematological malignancies. Since CBF disruption alone is insufficient to induce acute myeloid leukemia (AML) on its own, AML with CBF involvement is considered as a model of multistep leukemogenesis requiring additional genetic aberrations.Here, we focused on acute myeloid leukemia (AML) with t(8;21)/RUNX1-RUNX1T1 fusion and AML with inv(16)/CBFB-MYH11 fusion, reported together as CBF AML, as well as AML with germline RUNX1 mutation (defining the familial platelet disorder with propensity to develop leukemia or FPD/AML).In order to explore additional genomic aberrations, we performed comprehensive genetic profiling in CBF AML patients enrolled in the French trials ELAM02 (0-18 years) and CBF2006 (18-60 years) using both high-throughput sequencing (n=215) and single nucleotide polymorphism-array (n=198). In addition, we sequenced samples from 25 individuals with FPD/AML (15 pedigrees) diagnosed between 2005 and 2014 at thrombocyto-penic stage and during leukemic progression.In CBF AML, mutations in genes activating tyrosine kinase (TK) signaling were frequent in both subtypes as previously described by others. By contrast, we found mutations in genes encoding chromatin modifiers or members of the cohesin complex with high frequencies in t(8;21) AML (41% and 18% respectively) while they were nearly absent in inv(16) AML. Interestingly, such mutations were associated with a poor prognosis in patients with TK mutations suggesting synergic cooperation between these events. Other events included ZBTB7A and DHX15 mutations in t(8;21) AML (20% and 6% respectively) and FOXP1 deletions or truncating mutations in inv(16) AML (7%). Finally, we described CCDC26 disruption as a possible new lesion associated with aberrant TK signaling in this particular subtype of leukemia (4.5% of CBF AML).In FPD/AML, mutational analysis revealed the acquisition of a second event involving RUNX1 in all patients with AML including somatic mutation of the second allele or duplication of the germline RUNX1 mutation through copy-neutral loss of heterozygosity and trisomy 21. In clinical practice, we suggest that the occurrence of two different RUNX1 mutations or a single RUNX1 mutation with a variant allele frequency higher than 50% in a patient with AML should alert about the possibility of FPD/AML.

La métagénomique ciblée, étude de la composition et de la diversité des communautés microbiennes présentes dans différents échantillon biologiques sur la base d'un marqueur génomique, a connu un véritable essor lors de cette dernière décennie grâce à l'arrivée du séquençage haut-débit. Faisant appel à des outils de biologie moléculaire et de bioinformatique, elle a été à l’origine de substantiels progrès dans les domaines de l’évolution et de la diversité microbienne. Cependant, de nouvelles problématiques sont apparues avec le séquençage haut-débit : la génération exponentielle de données soulève des problèmes d'analyse bioinformatique, qui doit être adaptée aux plans d'expérience et aux questions biologiques associées. Cette thèse propose des solutions d'amélioration des études de métagénomique ciblée par le développement d'outils et de méthodes innovantes, apportant une meilleure compréhension des biais d'analyse inhérents à de telles études, et une meilleure conception des plans d'expérience. Tout d'abord, une expertise du pipeline d'analyse utilisé en production sur la plate-forme PEGASE-biosciences a été menée. Cette évaluation a révélé la nécessité de mettre en place une méthode d'évaluation formelle de pipelines d'analyses de données de métagénomique ciblée, qui a été développée sur la base de données simulées et réelles, et de métriques d'évaluation adaptées. Cette méthode a été utilisée sur plusieurs pipelines d'analyse couramment utilisés par la communauté, tout comme sur de nouvelles approches d'analyse jamais utilisées dans un tel contexte. Cette évaluation a permis de mieux comprendre les biais du plan d'expérience qui peuvent affecter les résultats et les conclusions biologiques associées. Un de ces biais majeurs est le choix des amorces d'amplification de la cible ; un logiciel de design d'amorces adaptées au plan d'expérience a été spécifiquement développé pour minimiser ce biais. Enfin, des recommandations de montage de plan d'expérience et d'analyse ont été émises afin d'améliorer la robustesse des études de métagénomique ciblée. / Targeted metagenomics is the study of the composition of microbial communities in diverse biological samples, based on the sequencing of a genomic locus. This application has boomed over the last decade thanks to the democratisation of high-throughput sequencing, and has allowed substantial progress in the study of microbial evolution and diversity. However, new problems have emerged with high-throughput sequencing : the exponential generation of data must be properly analyzed with bioinformatics tools fitted to the experimental designs and associated biological questions. This dissertation provides solutions to improve targeted metagenomics studies, by the development of new tools and methods allowing a better understanding of analytical biases, and a better design of experiments. Firstly, an expert assessment of the analytical pipeline used on the PEGASE-biosciences plateform has been performed. This assessment revealed the need of a formal evaluation method of analytical pipelines used for targeted metagenomics analyses. This method has been developed with simulated and real datasets, and adequate evaluation metrics. It has been used on several analytical pipelines commonly used by the scientific community, as well as on new analytical methods which have never been used in such a context before. This evaluation allowed to better understand experimental design biases, which can affect the results and biological conclusions. One of those major biases is the design of amplification primers to target the genomic locus of interest. A primer design software, adaptable to different experimental designs, has been specifically developed to minimize this bias. Finally, analytical guidelines and experimental design recommendations have been formulated to improve targeted metagenomics studies.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Des techniques de séquençage existent pour les biopolymères comme les protéines et l'ADN et ont permis de révolutionner la biologie moderne. Toutefois, des techniques similaires dédiées au séquençage des carbohydrates n'ont pas encore été développées à cause de la complexité de cette classe de biomolécules. Dans ce contexte, nous avons construit un instrument couplant spectroscopie vibrationnelle et spectrométrie de masse (MS/IR) afin de caractériser la structure des carbohydrates grâce à leur signature infrarouge.Dans cette thèse, nous avons démontré que cette métrique permet de différencier les différentes isoméries présentes dans la classe des carbohydrates : la nature des monosaccharides, la position des modifications fonctionnelles ainsi que la régio- et la stéréochimie de la liaison glycosidique. Ensuite la conservation de la structure moléculaire des ions après fragmentation a été démontrée sur des fragments de disaccharides permettant ainsi d'établir les règles du séquençage de carbohydrates par MS/IR. Cette méthode a ensuite été appliquée sur différents oligosaccharides.Enfin dans la dernière partie de ce manuscrit, le potentiel de la spectroscopie IRMPD dans l'infrarouge lointain est exploré pour la résolution des anomères, des isomères et des conformations. Finalement deux approches permettant une séparation en masse et en isomère en amont de l'analyse spectroscopique sont proposées : spectroscopie IRMPD 2 couleurs ou couplage avec la chromatographie liquide / Sequencing techniques have been established for proteins and DNA and have revolutionised modern biology but similar technique do not exist for carbohydrates due to their unique complexity. In this context, we have built an instrument coupling vibrational spectroscopy and mass spectrometry (MS/IR) dedicated to the structural characterization of carbohydrates.In this thesis, we have shown that the IR signature is a powerful metric which is able to resolve simultaneously all carbohydrate isomerisms: the monosaccharide content, the position of functional modifications, the regiochemistry and the stereochemistry of the glycosidic linkage. Then the conservation of the molecular structure of MS fragments has been revealed on disaccharide fragments. Following this demonstration we have established the carbohydrate sequencing rules using MS/IR and applied them for the determination of the sequence of different oligosaccharides.Finally the potential of the IRMPD spectroscopy in the Far-IR range is explored for anomers, isomers and conformations resolution as well as the utilisation of a two colors infrared spectroscopy or the coupling with an HPLC instrument

Les ataxies cérébelleuses héréditaires sont un ensemble de pathologies neurodégénératives ou neuro-développementales rares responsables d’un handicap fonctionnel important. Nous décrivons la découverte dans deux familles consanguines avec une ataxie cérébelleuse, une épilepsie et un retard mental deux mutations homozygotes dans le gène WWOX à l’aide du séquençage de l’exome d’un des patients de chaque famille. Ce gène était connu comme un gène suppresseur de tumeur. Par une stratégie de capture ciblée de 57 gènes d’ataxies cérébelleuses sur une série de 155 patients, nous avons posé un diagnostic dans 20,6% des cas dont des mutations d’ANO10 et SYNE1. Des études multicentriques ont permis d’étendre les connaissances sur ces maladies et montrer l’existence de phénotypes sévères dans ARCA1.A partir de cette série, nous avons validé en aveugle la pertinence d’un algorithme diagnostique clinico-biologique proposé par l’article de Anheim dans le New England Journal of Medicine en 2012. / Hereditary cerebellar ataxias are a group of neurodegenerative or neurodevelopemental diseases responsible of major disability. We found thanks to exome sequencing mutations in the WWOX gene in two consaguineous families presenting with cerebellar ataxia, epilepsy and mental retardation. This gene was until recently only recognized to be a tumor suppressor.With a 57 ataxia genes targeted capture strategy, next generation sequencing in 155 patients found 20,6% of positive diagnosis, including several new mutations in ANO10 and SYNE1. Multi center studies allow to extend clinical knowledge with severes phenotypes especially in ARCA1.We validate a clinico-biological algorithm for recesssive ataxias diagnosis published by Anheim in the in New England Journal of Medicine, 2012 in a blinded manner.