Orientador: Marco Antonio Alvarenga / Abstract: The present work aimed to investigated several kinds of amides to freeze equine semen. Two ejaculates from 20 stallions of different breeds were used. All ejaculates with initial motility greater than 60 % were split and frozen in 0.5 ml French straws in a milk base extender (INRA 82) containing the different studied cryoprotectants. The post-thaw percentage of motility and other motility parameters wer evaluated using CASA .To evaluate cell viability fluorescent probes were used. Stains used were Carboxyfluorescein and propidium iodine (PI). The first experiment was designed to investigated the protective effect of 3 amides ; Dymethyl acetamide at 3 concentrations - 1, 3 and 5 % v/v; dymethyl formamide at 5% and methyl formamide at 5%. Differences on motion parameters between cryoprotectant treatments were determined by analysis of variance using SAS system. Utilization of amides significantly improved most of parameters evaluated when compared with Glycerol. Progressive motility evaluated by optical microscopy was higher (p< 0,0001) for semen that was frozen with MF 5% and DF5%. The progressive motility evaluated by CASA was higher for the MF 5 % and DA 3% groups. The electron microscopy evaluation showed that DA 5% and MF 5 % were superior in the ability to preserved the acrossomal integrity. The acrossomal status evaluated by fluorescence showed that the preservation was higher on the groups DA 5%, MF 5 % and DF5% (p<0.0001). On the second experiment the cryoprotective effect of two associations of glycerol (Gly) and dimethylformamide (DF) were tested ( Gly 3.5% + DF 1.5 % and DF 3.5% + Gly 1.5%)... (Complete abstract, click electronic address below). / Mestre

Orientador: Maria Denise Lopes / Banca: Frederico Ozanam Papa / Banca: Fabiana Ferreira de Souza / Banca: Aulus Cavalieri Carciofi / Banca: Gilson Hélio Toniollo / Resumo: O objetivo desse projeto foi determinar a eficiência do uso de antioxidantes na prevenção de efeitos deletérios da congelação de sêmen em cães férteis e subférteis. Para isso foram executados dois experimentos: O primeiro teve como objetivo comparar os resultados da congelação do sêmen de cães férteis e subférteis, utilizando meio diluente a base de TRIS/gema de ovo/glicerol, com a adição ou não de antioxidantes (Catalase, Superóxido Dismutase e suas associações, ácido ascórbico, tocoferol e suas associações). O segundo experimento teve como objetivo comparar os resultados da congelação do sêmen de cães férteis e subférteis, suplementados com 500mg de vitamina C e E, por via oral, durante 60 dias. Foram utilizados 13 cães, sendo 7 considerados férteis e 6 classificados com subférteis. Os cães férteis apresentavam exame andrológico dentro dos padrões recomendados pelo CBRA; os subférteis apresentavam baixa concentração espermática (< 20x10 6 sptz/mL) e/ ou alto índice de patologias espermáticas (> 30%). O sêmen foi congelado em três momentos, antes do início da suplementação (M1), 30 (M2) e 60 dias (M3) após o início da suplementação oral. O sêmen foi coletado por manipulação digital do pênis e analisado para: motilidade, vigor, concentração e morfologia espermática. A congelação do sêmen foi realizada pelo método descrito por Chirinéa et al. (2006). A descongelação foi realizada a 70ºC por 8 segundos. Logo após as amostras foram avaliadas na análise computadorizada (CASA) e avaliação de integridade de membrana acrossomal e plasmática. Também foi analisada a taxa de peroxidação lipídica e antioxidantes: SOD, catalase, vitaminas C e E no plasma seminal. Pode-se concluir que a suplementação oral, no meio diluente ou a sua associação pode trazer benefícios para o processo de congelação/descongelação de cães... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this project was to determine the efficiency of antioxidants in preventing the deleterious effects of freezing semen in fertile and subfertile dogs. For this purpose two experiments were performed: The first aim was to compare the results of frozen semen of fertile and subfertile dogs, using the TRIS diluent / egg yolk / glycerol extender, with or without addition of antioxidants (Catalase, Superoxide dismutase and their associations, ascorbic acid, tocopherol and their associations). The second experiment aimed to compare the results of frozen semen of fertile and subfertile dogs supplemented with 500mg of vitamin C and E, orally for 60 days. We used 13 dogs, 7 were considered fertile and 6 classified as subfertile. The dogs had been considered fertile breeding soundness examination within the standards recommended by CBRA; the subfertile had lower sperm concentration (<20x10 6 sptz / mL) and / or high rate of sperm pathologies (> 30%). Semen was frozen in three stages, before the start of supplementation (M1), 30 (M2) and 60 days (M3) after the initiation of supplementation. Semen was collected by digital manipulation of the penis and analyzed for: motility, vigor, concentration and morphology. The frozen semen was performed by the method described by Chirinea et al. (2006). Thawing was performed at 70 ° C for 8 seconds. Soon after the samples were evaluated in the computerized analysis (CASA) and assessment of membrane integrity and acrosomal plasma. We also analyzed the rate of lipid peroxidation and antioxidants: SOD, catalase, vitamins C and E in seminal plasma. It can be conclude that oral supplementation, in the extender or your association can benefit the process of freezing / thawing of dogs. Especially for those with reproductive problems and may even, with oral therapy to reduce or eliminate this feature / Doutor

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: Marco Antonio Alvarenga / Banca: Denise Pereira Leme / Resumo: O presente estudo objetivou comparar diferentes curvas de congelação utilizando-se uma máquina com curvas programadas (TK3000®) com congelação em vapor de nitrogênio liquido, utilizando sêmen de garanhões de alta e baixa congelabilidade. Comparou-se a eficácia do período de estabilização do sêmen em diferentes sistemas de transporte refrigerado (Botutainer® e Equitainer®) em relação à estabilização feita em refrigerador Minitüb® previamente à congelação. No experimento I e II foram utilizados 4 garanhões com sêmen de alta congelabilidade. As amostras foram refrigeradas durante 20 minutos previamente à congelação em refrigerador Minitüb® (GM), Botutainer® (GB) e Equitainer® (GE). Não houve diferença entre os grupos quanto a motilidade total (MT) e motilidade progressiva (MP): GM (67,1;32,1%); GB (65,2;31,9%); GE (63,4;30,4%) demonstrando que os dispositivos podem ser utilizados como uma alternativa aos refrigeradores. Os valores de integridade de membrana plasmática (IMP%) foram GM(49,43a); GB(48,70a); GE(44,90b). No experimento II foram utilizadas 3 curvas programadas na TK3000® (C1, C2, C3) e a metodologia em caixa de isopor (GC). As comparações foram realizadas em relação ao GC e não apresentaram diferença significativa. Valores em porcentagem de MT, MP e IMP: GCxC1 (70 x 67,5; 35,7 x 32; 48,3 x 46); GCxC2 (63,3 x 67,66; 33,3 x 34,8; 45,4 x 48,3); GCxC3 (63,2 x 65; 32,2 x 32,4; 48,09 x 49,3). No teste de fertilidade, as inseminações foram realizadas com amostras congeladas com C2 e GC apresentando índices de prenhez de 65 e 60% respectivamente, sem diferença significativa. A TK3000® foi tão eficaz quanto à metodologia de congelação em caixa de isopor em relação à congelabilidade e fertilidade. Todas as curvas testadas foram eficientes na manutenção da viabilidade...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This present study compared freezing ratios in a programmable freezer (TK3000) performed by usual methodology, using good freezers and poor freezers stallions. The semen stabilization period efficiency was compared in cooled semen transport systems (Botutainer® e Equitainer®) in relation with Minitüb® fridge before the cryopreservation. Four good freezers stallions was used in experiments I and II. Samples were cooled during 20 minutes before the cryopreservation in a Minitüb® fridge (GM), Botutainer® (GB) and Equitainer® (GE). There was not difference between groups in relation with total motility (TM) and progressive motility (PM): CM (67,1;32,1%); GB (65,2;31,9%); GE (63,4;30,4%) showing that transport systems can be used as an alternative instead of fridges. Plasma membrane integrity (MPI%) values were CM (49,43a); GB (48,70a); GE (44,90b). Three frozen rations were used in experiment II in the TK3000® (C1, C2, C3) and the isothermic box (CG). Results from each freezing ratio were compared to the control group and no difference was observed. Percentage values from TM, PM and MPI were the following: CGxC1(70x67,5; 35,7x32; 48,3x46); CGxC2 (63,3x67,66; 33,3x34,8; 45,4x48,3); CGxC3 (63,2x65; 32,2x32,4; 48,09x49,3). In the fertility test, artificial inseminations were performed with C2 and GC frozen samples showing pregnancy rates of 65 and 60%, respectively, without significant difference. The TK3000® was as efficient as the isothermic box frozen methodology in relation to freezability and fertility. All freezing ratios were efficient in semen viability maintenance. Ten Mangalarga Marchador breed stallions were used in the experiment III. The samples were shared and frozen simultaneously in two programmable freezers with different ratios (G2 e G3) and in an isothermic box (CG). For the statistical analisys, semen ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Marco Antônio Alvarenga / Banca: Rubens Paes de Arruda / Banca: José Antonio Dell Acqua Junior / Resumo: Nas últimas décadas, muitos estudos têm sido realizados nas diferentes espécies com o intuito de se determinar os fatores envolvidos no processo da fragmentação do DNA espermático. A biologia molecular voltada à área da reprodução tem resultado em inúmeras técnicas para a avaliação da qualidade da cromatina e determinação da fragmentação do DNA espermático. Em trabalhos recentes, um novo teste denominado Halomax® tem se mostrado tão eficiente quanto a outros tradicionais para a avaliação da fragmentação do DNA espermático, apresentando como vantagens a sua praticidade e o fato não requerer o uso de equipamentos de alto custo. O presente experimento teve por objetivo comparar as raças Mangalarga Marchador (MM) e Quarto de Milha (QM) quanto à resistência à refrigeração, bem como utilizar o Teste Dispersão de Cromatina Espermática denominado Halomax® para avaliar a fragmentação da cromatina espermática do sêmen refrigerado dos garanhões dessas raças em duas temperaturas de armazenamento de sêmen refrigerado (5°C e 15°C). Os resultados deste trabalho demonstraram que não houve diferença entre as temperaturas de armazenamento (5°C e 15°C), mostran do que ambas são eficientes na manutenção da viabilidade espermática pelo período de 24 horas para ambas as raças estudadas. Além disso, foi observada uma característica espermática superior dos garanhões da raça Quarto de Milha quando comparada aos da raça Mangalarga Marchador, tanto nos parâmetros de velocidade espermática, avaliado pelo CASA, quanto com relação à fragmentação do DNA espermático, revelando uma maior sensibilidade dos animais da raça Mangalarga ao processo de refrigeração do sêmen / Abstract: Many studies have been conducted in different species in order to determine the factors involved in the process of sperm DNA fragmentation. Molecular biology studies focused on the reproductive area has resulted in several techniques for assessing the quality of chromatin and sperm DNA fragmentation. Recently, a new test called HALOMAX ® has been shown to be as efficient as other traditional assessment of sperm DNA fragmentation, having the advantage of practicality and not require the use of expensive equipment. The aim of this study was to compare breeds Mangalarga and Quarter Horses for cooling resistance and use the Sperm Chromatin Dispersion Test called HALOMAX ® to evaluate the sperm chromatin fragmentation using two cooled semen storage systems (5°C and 15°C). Our results showed no difference between storage systems (5°C and 15°C), showing that both are effective in maintaining sperm viability for a period of 24 hours for both breeds studied. In addition, the Quarter Horse shown superiority in semen quality parameters assessed by CASA and sperm DNA fragmentation when compared with the Mangalarga, revealing higher sensitivity of the Mangalarga stallions for cooling semen / Mestre

Orientador: Francisco Guilherme Leite / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Banca: Rubens Paes Arruda / Resumo: A utilização da L-carnitina - ácido y-trimethilamino- ß-hidróxido butírico - visando melhorar os parâmetros espermáticos tem sido intensivamente utilizado em medicina humana e em menor escala em medicina veterinária com resultados satisfatórios. O objetivo deste estudo foi verificar a influência da suplementação oral de L-carnitina em sêmen criopreservado de garanhões. Utilizou-se neste experimento quatro garanhões submetidos a duas colheitas de sêmen por semana por um período de quatro semanas durante o mês de agosto de 2001; amostras se sêmen desses animais, agora denominado TO, foram criopreservadas. Os mesmos quatro garanhões receberam uma suplementação oral de quinze gramas de L-carnitina uma vez ao dia nos meses de maio, junho, julho e agosto de 2002 e no mês de agosto de 2002 foram submetidos a duas colheitas de sêmen semanais, tendo suas amostras também criopreservadas, que passaram a ser denominado tratado (T1). Foram analisados e comparados entre si os seguintes parâmetros espermáticos:- total de espermatozóides no ejaculado e integridade da membrana espermática e através de análise computadorizada as variáveis motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), linearidade (LIN), velocidade de trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL) e velocidade curvilinear (VCL) antes e após da realização de um teste de termo-resistência (TTR). Foi realizado um delineamento casualizado com oito repetições (dois tratamentos e quatro garanhões); empregou-se análise de variância - ANOVA - com posterior desdobramento para estudar o efeito dos tratamentos em cada um dos garanhões - Teste de Tukey - o nível de significância adotado foi p<0,05... (resumo completo, clicar acesso no endereço eletrônico abaixo) / Abstract: Owing its positive effect on the improvement of spermatic parameters, L- carnitine - ?-trimethilamino- ß-hidroxid butiric acid - has been intensively utilized in human medicine and in a lower scale in veterinary medicine with satisfactory results. The objective of this study was to verify the influence of oral supplementation with L-carnitine on cryopreserved stallion semen. Four stallions were submitted to semen collection twice a week during a four week period in August of 2001. The collected samples from those horses were then cryopreserved and they were assigned as a control group (T0). The same horses received fifteen grams of L- carnitine by oral supplementation, once a day, during May, June, July and August of 2002, and then they were submitted to semen collection twice a week in August of 2002. Those collected samples were also equally cryopreserved, and assigned as treatment group (T1). The following spermatic parameters were analyzed and submitted to a pair wise comparison: total sperm number in the ejaculate and sperm membrane integrity and by computer analyze, variables as: total motility (TM), progressive motility (PM), linearity (LIN), path velocity (VAP), progressive velocity (VSL), and track speed (VCL). Those variables were then determined before and after a term resistance test (TRT). A casual design was established using eight repetitions (two treatments and four stallions). To investigate the treatment effect, analysis of variance (ANOVA) was performed and to investigate de effect within stallion, the Tukey's test - significance level was established as p£ 0.05. The means and standard errors of means for the variable total motility, determined before and after the term resistance test, total sperm number in the ejaculate and sperm membrane integrity was significantly higher in the treatment group (T1) when compared to the control group (T0)... (complete abstract, access undermentioned eletronic address) / Mestre

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: José Antonio Dell'Aqua Júnior / Banca: Rubens Paes de Arruda / Resumo: A criopreservação de sêmen equino mostra-se como importante instrumento no ganho genético de rebanhos pela maximização do uso de bons reprodutores. Porém, nos programas de inseminação artificial, a utilização de espermatozóides criopreservados apresenta índices de fertilidade inferiores aos obtidos com sêmen a fresco, constituindo um dos maiores entraves à plena difusão dessa biotecnologia. Assim, o experimento 1 teve como objetivo avaliar o movimento espermático pelo sistema computadorizado (CASA) e a integridade da membrana plasmática por microscopia de epi-fluorescência de espermatozóides equino congelados em palhetas de 0,5 e 0,25 mL, em diferentes taxas de congelação na viabilidade espermática. Para desenvolver o projeto foram utilizadas três metodologias de congelação: o método convencional em caixa de isopor e dois equipamentos automatizados, um deles a máquina Mini Digitcool® (IMV - Technologies - França), que possibilita uma variação de -10ºC a -60ºC por minuto e o outro equipamento TK® 4000C (TK Equipamentos para Congelação) que possibilita uma variação de -10ºC a -40ºC por minuto. Para tanto foram utilizados 3 ejaculados de 4 garanhões de diferentes raças, para cada protocolo de congelação, sendo o protocolo 1: caixa de isopor x máquina TK® 4000C na taxa de -20ºC/min x máquina Mini Digitcool® na taxa de -20ºC/min; protocolo 2: caixa de isopor x máquina TK® 4000C na taxa de -40ºC/min x máquina Mini Digitcool® na taxa de -40ºC/min e protocolo 3: caixa de isopor x máquina TK® 4000C na taxa de -40ºC/min x máquina Mini Digitcool® na taxa de -60ºC/min. Para a análise pós-descongelação as palhetas de 0,5 mL foram descongeladas a 46ºC por 20 segundos e as palhetas de 0,25 mL a 46ºC por 15 segundos. A análise estatística das variáveis estudadas no sêmen congelado/descongelado foi realizada mediante o pacote... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Equine semen cryopreservation comes as an important tool to enhance the herd gene pool by maximizing the use of the top genetic merit stallions. However, the use of frozen semen in the artificial insemination programs presents reduced fertility rates in comparison to those obtained with fresh semen, being one of the biggest hindrances to spread this biotechnology. Thus, Experiment 1 aimed to evaluate the motility pattern using a computer-assisted sperm analysis (CASA) and plasma membrane integrity by epifluorescence microscopy of equine semen that were frozen in 0.5 and 0.25mL straws at different freezing rates and their relationship with sperm viability. Three different methodologies were used: conventional method with isothermic box and two automated systems: the Mini Digitcool® machine (IMV - Technologies - France), which allows a range from -10oC to -60oC per minute, and the TK® 4000C (TK Equipamentos para Congelação, Brazil), that provides a range from -10ºC to -45ºC per minute. Therefore 3 ejaculates for 4 animals were used for each freezing protocol. On protocol 1 we compared isothermic box vs. TK® 4000C machine at a -20ºC/min rate vs. Mini Digitcool® at a -20ºC/min rate; Protocol 2 compared isothermic box vs. TK® 4000C machine at a -40ºC/min rate vs. Mini Digitcool® at a -40ºC/min rate; and Protocol 3 compared isothermic box vs. TK® 4000C machine at a -40ºC/min rate vs. Mini Digitcool® at a -60ºC/min rate. The 0.5mL-straw samples were thawed at 46oC/20 sec whereas samples from the 0.25mL straws were thawed at 46oC/15 sec for post-thawing analysis. Statistical analysis from the frozen-thawed semen evaluated parameters was performed using the statistics software SAS 9.1. At first, it was used the descriptive analysis Box Plot R program. Then, data were analyzed using Proc. MIXED, a variance analysis to investigate the treatment effect (freezing rates and... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-16T11:29:46Z No. of bitstreams: 2 texto completo.pdf: 542484 bytes, checksum: ce7405ee8e6a21702cc15252ef074236 (MD5) texto completo.pdf: 542484 bytes, checksum: ce7405ee8e6a21702cc15252ef074236 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-16T11:29:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 texto completo.pdf: 542484 bytes, checksum: ce7405ee8e6a21702cc15252ef074236 (MD5) texto completo.pdf: 542484 bytes, checksum: ce7405ee8e6a21702cc15252ef074236 (MD5) Previous issue date: 2015-07-24 / Um dos problemas mais importantes da indústria da inseminação artificial é a determinação do potencial de fertilidade do sêmen, pois, as metodologias convencionais utilizadas para avaliar a qualidade de sêmen não têm demonstrado boa correlação com fertilidade dos espermatozoides. Resultados de recentes estudos com sêmen congelado-descongelados quando submetidos a uma filtragem antes das avaliações espermáticas tem melhor correlação entre as características dos espermatozoides e a fertilidade in vivo. Além disso, a utilização de diferentes sondas fluorescentes nas análises do sêmen permitem avaliação ampla e individual dos espermatozoides, além de sua qualidade funcional, bioquímica e estrutural. Desde modo, o presente estudo teve como objetivo empregar diferentes testes complementares de avaliação espermática pré e pós-filtragem em solução coloidal de sêmen criopreservado e verificar sua correlação com a fertilidade in vivo. Foram utilizadas duas amostras (palhetas da mesma partida) de sêmen congelado de 18 touros doadores de sêmen, sendo 11 reprodutores da raça Nelore, cinco Composto Montana Tropical, um Senepol, e um Red Angus, escolhidos de acordo com os animais utilizados em programa de Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) imposto em um rebanho comercial. Os dados obtidos foram divididos de acordo com a fertilidade obtida após as inseminações, sendo fertilidade satisfatória (≥ 55 % de taxa de prenhez) e fertilidade insatisfatória (˂ 55 % de taxa de prenhez) Todas as fêmeas foram sincronizadas por uso de protocolos de sincronização e inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Os testes empregados para análise do sêmen foram motilidade e vigor espermático, análise quanto à integridade de membrana plasmática e acrossomal, produção de peróxido de hidrogênio intracelular, e organização da bicamada, por meio de sondas fluorescentes (IP, FITC-PSA, M540) empregando a Citômetria de fluxo. Houve efeito de touro sobre a taxa de prenhez (P<0,05) com máximo de 76 % (19/25) e mínimo de 15,6 % (5/32) sendo a média de 54,6 % (723/1325) de prenhez com uma inseminação. Quanto aos grupos de fertilidade houve diferença (P<0,05) entre as médias, sendo 62 % de prenhez para o grupo FERTILIDADE SATISFATÓRIA e 40,6 % para o grupo FERTILIDADE INSATISFATÓRIA. Na avaliação convencional do sêmen, o grupo de fertilidade satisfatória apresentou maior média de motilidade espermática progressiva retilínea (60,49%) que o grupo de fertilidade insatisfatória. Nas avaliações realizadas por citometria de fluxo, o grupo de fertilidade insatisfatória obteve maiores médias percentuais para populações celulares com membrana plasmática lesionada e membrana acrossomal intacta (7,18 %), para células com alto grau de peroxidação e lesão de membrana plasmática (25,5 %) e menor média percentual de populações celulares com membrana plasmática íntegra e estável (19,5 %) que diferiram (p<0,05) do grupo e fertilidade satisfatória. A centrifugação do sêmen em solução coloidal foi eficiente em reter as células com lesões na membrana plasmática e células com lesões na membrana acrossomal (16,8; 31,9 e 7,0 %); células com alta peroxidação intracelular (4,17; 64,3 e 15,0 %). Concluiu-se que as populações de espermatozóides com lesão na membrana acrossomal representam o maior percentual das células espermáticas em sêmen submetido ao processo de congelamento e relacionam-se com à alta taxa de fertilidade obtida em programa de inseminação artificial em tempo fixo (IATF); populações de espermatozóides com lesão de membrana plasmática e alta taxa de peroxidação intracelular estão relacionadas à baixa taxa de fertilidade em programas de inseminação artificial em tempo fixo (IATF); a seleção de espermatozoides com membranas acrossomal e espermática intactas é possível pela centrifugação associado ao uso de soluções coloidais (Androcoll®) e a avaliação da motilidade espermática progressiva retilina está relacionada a alta taxa de fertilidade em programa de inseminação artificial em tempo fixo. / One of the most important problems of the artificial insemination industry is the determination of semen fertility potential for the conventional methods used to assess the quality of semen have not shown good correlation with fertility of sperm. Results of recent studies with frozen-thawed semen when subjected to filtering before the spermatic reviews have better correlation between the characteristics of sperm and fertility in vivo. In addition, the use of different fluorescent probes in semen analysis allow for a wide and individual assessment of sperm, as well as its functional, biochemical and structural. In this way, the present study aims to employ different complementary tests pre sperm and post-filtering in colloidal solution and check its correlation with fertility in vivo semen. Two samples were used (vanes in the same match) frozen semen of 18 donor bulls semen, 11 breeding Nelore five Composite Montana Tropical, one Senepol, and Red Angus, chosen according to the animals used in program Fixed-Time Artificial insemination (FTAI). It was previously established that the data obtained would be divided into fertility group, being satisfactory (≥ 55% pregnancy rate) and unsatisfactory (˂ 55% pregnancy rate) All females were synchronized by using synchronization protocols and fixed-time artificial insemination (FTAI). For data analysis of semen were motility and sperm vigor, analysis of the integrity of plasma and acrosomal membrane of intracellular hydrogen peroxide production, and organization of the bilayer by means of fluorescent probes (IP FITC-PSA, M540) in flow cytometer. There was bull effect on the pregnancy rate (P<0.05) with a maximum of 76% (19/25) and a minimum of 15.6% (5/32) with a mean of 54.6% (723/1325 ) of pregnancy. As for fertility groups difference (P <0.05) between the average, 62% of pregnancy for SATISFACTORY group and 40.6% for UNSATISFACTORY group. In conventional semen evaluation, the satisfactory group showed higher mean rectilinear motility (60.49%) than the poor group. In the assessments performed by flow cytometry, the UNSATISFACTORY group had higher average percentage for cell populations with damaged plasma membrane and intact acrosome membrane (7.18%; IP + PSA-) for cells with a high degree of peroxidation and plasma membrane injury (25.5%; DCFDA + PI +) and lower mean percentage of cell populations with full and stable plasma membrane (19.5% M540-6DCFDA +) that differed (p <0.05) SATISFACTORY group. The centrifugation of semen in colloidal solution was efficient in retaining the cells with lesions in the plasma membrane and cell injuries in the acrosome membrane (16.8% IP + PSA-; 31.9%, IP + PSA +, 7.0% IP-PSA +); cells with high intracellular peroxidation (4.17% DCFDA-PI +; 64.3% DCFDA + PI + 15.0%, + DCFDA PI). It was concluded that the populations of sperm with injury acrosome membrane represent the highest percentage of sperm cells in semen subjected to the freezing process and are related to the high fertility rate obtained in fixed-time artificial insemination (FTAI); sperm populations of plasma membrane damage and high intracellular peroxidation rate represent the highest percentages of sperm populations of cryopreserved semen, and are related to low fertility rate in fixed-time artificial insemination (FTAI); the selection of sperm with intact acrosome and sperm membranes is possible by centrifugation associated with the use of colloidal solutions (Androcoll®) and evaluation of sperm motility by light microscopy is related to high fertility rate in fixed-time artificial insemination (FTAI) program.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-25T16:41:27Z No. of bitstreams: 1 2018_AdalmyrMoraisBorges.pdf: 5438238 bytes, checksum: d936e356826ef0abd06970160cde3b2b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-31T19:17:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_AdalmyrMoraisBorges.pdf: 5438238 bytes, checksum: d936e356826ef0abd06970160cde3b2b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-31T19:17:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_AdalmyrMoraisBorges.pdf: 5438238 bytes, checksum: d936e356826ef0abd06970160cde3b2b (MD5) Previous issue date: 2018-07-25 / O estudo buscou avaliar diferentes alternativas para o congelamento do sêmen de jundiá amazônico e de pintado e a melhoria da qualidade pos-descongelamento, contribuindo para o desenvolvimento de protocolos para as duas espécies. Entre as abordagens avaliadas foram: (1) a caracterização morfológica dos espermatozoides de jundiá amazônico com o uso de microscopia eletrônica de varredura e de transmissão; (2) a utilização de diferentes agentes crio protetores, para o jundiá amazônico: metanol, dimetilsulfoxido e etilenoglicol a 10%, associados a solução de glicose a 5% e para o pintado: metanol, dimetilsulfoxido e dimetilacetamida a 5%, 7,5% e 10%, associados a solução de BTS a 5%; e (3) a adição de substancias antioxidantes nos meios de congelamento para o pintado: trealose 100 mM, acido ascórbico 1 mM e α-tocoferol 0,1 mM. Para ambas espécies, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 mL e congelado em vapor de nitrogênio, utilizando botijão dry shipper, e descongelado a 40oC por 12 segundos. No jundiá amazônico, o espermatozoide apresentou o comprimento total de 25,46 } 2,54 μm, cabeça esférica (1,51 } 0,18 μm) ausência de acrossoma, peca intermediaria de formato cônico, ligeiramente assimétrica com presença de vesículas, e comprimento de 0,93 } 0,17 μm, e flagelo com arranjo típico e comprimento de 21,48 } 2,45 μm. O sêmen descongelado apresentou valores mais altos (p<0,05) para duração, vigor e taxa de mobilidade espermática com os crio protetores metanol 10% e dimetilsulfoxido 10% quando comparado com o etilenoglicol 10%. No pintado, o sêmen criopreservado com metanol 7,5% e 10% apresentou valores para duração e taxa de mobilidade maiores (p<0,05) comparado com o dimetilsulfoxido e dimetilacetamida. O tratamento com os três antioxidantes associados proporcionou taxa de mobilidade maior (p<0,05) em relação ao tratamento sem antioxidantes. Para os parâmetros de duração e taxa de mobilidade foi observada interação significativa (p<0,05) entre o acido ascórbico e o α-tocoferol. Assim, os resultados obtidos na criopreservação de sêmen de jundiá amazônico não foram suficientes para estabelecer um protocolo para a espécie. Na criopreservação de sêmen de pintado e recomendado o uso do metanol a 7,5% associado a solução de BTS a 5%, e a adição conjunta dos antioxidantes trealose (100mM), acido ascórbico (1mM) e α-tocoferol (0,1mM). / This study aimed to evaluate different alternatives for the semen freezing of amazon catfish and spotted catfish, contributing to the development of protocols for both species increasing the process efficiency in both species. Among the approaches used are (1) morphological characterization of amazon catfish spermatozoa using scanning and transmission electron microscopy; (2) use of different cryoprotectant agents, 10% methanol, dimethylsulfoxide and ethyleneglycol, associated 5% glucose solution in amazon catfish, and 5%, 7,5% e 10%, methanol, dimethylsulfoxide and dimethyacetamide, associated 5% BTS solution in spotted catfish; and (3) addition of antioxidants in the freezing media, trehalose (100 mM), ascorbic acid (1 mM) and α- tocopherol (0.1 mM) in spotted catfish. In both especies, semen samples were loaded in 0.25 mL plastic straws, frozen in nitrogen vapour (dry shipper) and thawed at 40oC for 12 seconds. In the amazon catfish, fresh spermatozoon was 25.46 } 2.54 μm long, head was spherical (1.51 } 0.18 μm) with no acrosome, midpiece was coneshapped with presence of vesicles, slightly asymmetric, 0.93 } 0.17 μm long and the single fagellum was 21.48 } 2.45 μm long with the typical arrangement. Postthawed semen presented higher values (p<0.05) for duration, vigor and sperm motility rate with cryoprotectants 10% methanol and 10% DMSO, when compared to 10% ethyleneglycol. In the spotted catfish, the cryopreserved semen with 7,5% and 10% methanol presented higher values (p<0.05) for latency time and motility rate compared to dimethylsulfoxide and dimethyacetamide. The treatment with associated antioxidants provided a higher motility rate (p<0.05) compared to the antioxidant-free treatment. For the parameters of latency time and motility rate, a significant interaction (p<0.05) was observed between ascorbic acid and α-tocopherol. In conclusion, the results observed in semen cryopreservation of amazon catfish were not satisfactory to establish a protocol for the specie. For the semen cryopreservation of spotted catfish, it is recommended the use of 7.5% methanol with the 5% BTS solution and the addition of the antioxidants trehalose (100 mM), ascorbic acid (1 mM) and α-tocopherol (0.1 mM).

Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Ian Martin / Banca: Luciana da Silva Leal / Banca: Frederico Ozanan Papa / Resumo: Os programas que visam aumentar a incorporação de biotecnologias reprodutivas a fim de se obter um incremento genético dos rebanhos bubalinos, visando aumentar a produtividade dos mesmos. No entanto, a melhoria do sistema produtivo e reprodutivo será possível mediante a utilização de tecnologias que viabilizem o melhor aproveitamento dos animais, como a congelação de sêmen. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a qualidade das amostras seminais de búfalos diluídas em três meios diferentes: Botu-bov® (BB), água de coco em pó (ACP-111) e Tris-gema antes e após a criopreservação utilizando o mesmo protocolo. No presente estudo foram utilizados 4 touros bubalinos para colheitas seminais utilizando vagina artificial, os ejaculados foram diluídos com BB, Tris-gema e ACP-111. O sêmen fresco foi analisado quanto ao seu volume, aspecto, cor, concentração (câmara de Neubauer), morfologia realizada por microscopia de interferência diferencial (DIC), cinética pelo sistema CASA e pela microscopia de epifluorescência. Na pós-congelação as amostras foram avaliadas pelo CASA, citometria de fluxo (membrana plasmática, acrossoma, lesões semelhantes à capacitação e fragmentação do DNA) e pela microscopia de epifluorescência. Os diluentes BB e Tris-gema apresentaram melhores resultados para congelação do sêmen de búfalos, em relação ao meio ACP-111 (BB 58,59%; Tris-gema 52,64% e ACP-111 36,94% para MT). Porém o diluente BB demonstrou superioridade em relação à motilidade progressiva espermática (MP para BB, Tris-gema e ACP-111, 47,56%; 40,39% e 29,59% respectivamente), menor porcentagem de índice de fragmentação de DNA (0,85%) e de espermatozoides lesados (24,97%). Assim sendo, mediante o protocolo do presente estudo deduz-se que o BB apresenta superioridade na congelação de sêmen de búfalos, sendo este a melhor opção de diluente para essa biotecnologia / Abstract: These programs aim to increase the incorporation of reproductive biotechnologies in order to obtain a genetic increment of buffalo herds to increase their productivity. However, improving the productive and reproductive system will be possible through the use of technologies that enable the best use of animals, such as semen freezing. Therefore, this study aimed to evaluate the quality of semen samples of buffalo diluted in three different extenders: Botu-bov ® (BB), powdered coconut water (ACP-111) and Tris-yolk before and after cryopreservation using the same protocol. In the present study was used four buffalo bulls for seminal collection using artificial vagina. The ejaculates were diluted with BB, Tris-yolk and ACP-111. The fresh semen was analyzed for volume, appearance, color, concentration (Neubauer chamber), morphology performed by differential interference microscopy (DIC), the kinetic by CASA system and membrane integrity by epifluorescence microscopy. In the post-freeze moment the samples were evaluated by CASA, flow cytometry (plasma membrane, acrosome, lesions similar to capacitation and DNA fragmentation) and by epifluorescence microscopy. The extenders BB and Tris-yolk showed superior results for semen freezing of buffalo in relation to the ACP-111 (BB 58,59%; Tris-yolk 52,64% e ACP-111 36,94% for MT). However the diluent BB demonstrated superiority for progressive sperm motility (MP for BB, Tris-yolk and ACP-111, 47,56%; 40,39% e 29,59% respectiblely), lower percentage of DNA fragmentation (0,85%) and lower percentage of damaged sperm (24,97%). Thus, through the protocol of this study it shows that the BB has superiority in semen freezing of buffalo, appearing to be the best option of extender for this biotechnology / Mestre

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-25T09:51:00Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 467608 bytes, checksum: 415cfc97bb8e785d82d9258a9338dec2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T09:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 467608 bytes, checksum: 415cfc97bb8e785d82d9258a9338dec2 (MD5) Previous issue date: 2015-11-19 / Análises seminais por meio da associação de sondas fluorescentes possibilitam a avaliação dos diversos compartimentos da célula espermática, simultaneamente, oferecendo um prognóstico mais acurado frente ao caráter subjetivo de alguns testes de rotina. Neste estudo foi utilizada a associação de três sondas fluorescentes com objetivo de avaliar a integridade da membrana plasmática (iodeto de propídio e Hoechst 33342) e o potencial de membrana mitocondrial (MitoTracker red), em sêmen fresco e descongelado de cão. Os resultados obtidos foram comparados aos resultados dos testes de rotina. Todos os testes demonstraram capacidade em detectar queda de qualidade seminal pós- descongelamento. A associação das sondas fluorescentes iodeto de propídio (IP), Hoechst 33342 (H33342) e MitoTracker red (CMXRos) mostrou-se eficaz na distinção de diferentes populações de espermatozoides em ejaculados descongelados de cão doméstico. Foram distintas 4 populações: IC (membrana plasmática íntegra e com potencial de membrana mitocondrial), IS (membrana plasmática íntegra e sem potencial de membrana mitocondrial), LC (membrana plasmática lesada e com potencial de membrana mitocondrial) e LS (membrana plasmática lesada e sem potencial de membrana mitocondrial). Esta associação permitiu também quantificar e qualificar as injúrias causadas às membranas plasmáticas das células espermáticas, pelo processo de congelamento/descongelamento, nesta espécie. Foi observada correlação (p<0,05) entre a coloração das sondas fluorescentes e a avaliação da motilidade espermática e teste hiposmótico. Desta forma, sugere-se a inclusão da combinação de sondas fluorescentes nos protocolos de análise de sêmen, como teste complementar aos testes convencionais, tornando mais precisa a avaliação das injúrias à célula espermática desta espécie. Entretanto, nem os testes de rotina e nem as sondas fluorescentes são hábeis em predizer a capacidade do espermatozoide de ligar-se ao ovócito, evento crucial para a fecundação. Assim, faz-se importante a adoção de testes de ligação entre espermatozoides e ovócitos nas pesquisas referentes à avaliação dos protocolos de congelamento/descongelamento do sêmen. Embora o status metabólico dos ovócitos, assim como o efeito fêmea, limitem a exatidão das interpretações, tem-se buscado substratos de ligação mais homogêneos e de mais fácil obtenção. Neste contexto, a membrana perivitelina do ovo de galinha (MPOG) tem se demonstrado eficiente na avaliação da capacidade de ligação do sêmen em diversas espécies. O teste de ligação de espermatozoides à MPOG apresenta comportamento semelhante aos resultados dos testes de rotina da avaliação do sêmen, assim como os testes com as sondas fluorescentes, apresentando diferença quando comparados sêmen fresco e sêmen descongelado (p<0,05). Neste estudo, o teste hiposmótico correlacionou-se positivamente com o número de espermatozoides ligados à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha. O comportamento da MPOG e das sondas, entre os tratamentos, demonstraram sensibilidade da membrana em distinguir sêmens de diferentes potenciais de ligação (p < 0,05) nesta espécie. / Seminal analysis by means of the association of fluorescent probes allows for the simultaneous evaluation of several compartments of the spermatic cell, offering a more accurate prognostic when compared to the subjective character of some routine tests. In this study, the association of three fluorescent probes was used with the goal of evaluating the integrity of plasma membrane (propidium iodide and Hoechst 33342) and mitochondrial membrane potential (Mito Tracker red), in dog semen, both fresh and frozen. The attained results were compared to those of routine tests. All tests showed the capacity of detecting a drop in seminal quality after being unfrozen. The association of the fluorescent probes propidium iodide (IP), Hoechst 33342 (H33342) and Mito Tracker red (CMXRos) showed efficiency when differentiating sperm populations in the frozen semen of domestic dogs. There were four distinct populations: IC (intact plasma membrane and with mitochondrial membrane potential), IS (intact plasma membrane without mitochondrial membrane potential), LC (injured plasmatic membrane with mitochondrial membrane potential) and LS (injured plasmatic membrane without mitochondrial potential). This association also allows the quantification and qualification of the injuries caused on the sperm cell by the freezing/thawing process in this species. A correlation was observed between the coloring of the fluorescent probe and the evaluation of sperm motility and hypo- osmotic swelling test (p<0,05). However, the attained results with the probes showed a higher precision rate when detecting injuries to the spam cells thus suggesting the inclusion of the combination of fluorescent probes in semen analysis protocols, once evidence shows greater efficiency when compared to routine tests. Consequently, the inclusion of the combination of the fluorescent probes in the semen analysis is suggested as a complementary test, making the evaluation of the injuries to the spermatic cell of this species more precise. However, neither the routine tests nor the fluorescent probes are capable of predicting spermatozoon’s capability to bind to the oocyte, an crucial event to fecundation. Therefore, it is important to introduce biding assays between spermatic cells and oocytes in the research that refer to the evaluation of the freezing/ thawing semen protocols. Although the oocytes metabolic status, like the ‘’female effect’’, limit the accuracy of the interpretations, substrate binding that are more homogeneous and easier to obtain are being pursued. In this context, the perivitelline layer of the egg yolk has demonstrated to be efficient in evaluating the binding capacity of sperm in a number of species. The binding tests of sperm to the MPOG shows a behavior that is similar to the results obtained from semen’s routine evaluation tests, as well as the test with the fluorescent probes, presenting a difference when comparing fresh with unfrozen semen (p<0,05). In this study, the hypoosmotic test correlated positively to the number of spermatozoon connected to the perivitelline layer of the egg yolk. The behavior the MPOGs and that of the probes, between other treatments, demonstrated the membrane’s sensibility in distinguishing semen of different potential binding (p<0,05) in this species.