No description available.

Chez les plantes, l'oxyde nitrique (NO) est impliqué dans de nombreux processusbiologiques tels que la germination ou le développement racinaire et intervient dans les réponses àdivers stress biotiques ou abiotiques. Ainsi, en situation de stress en fer, la production de NOconstitue un événement précoce dans la voie de signalisation qui aboutit à l'induction desferritines. Les cibles du NO demeurent toutefois mal connues, mais il est établi qu'un effet majeurest la S-nitrosylation de cystéines dans les protéines. Dans ce travail, nous avons cherché àidentifier les protéines (et les cystéines) qui constituent les cibles moléculaires du NO dans deuxsituations de stress abiotique chez Arabidopsis thaliana. Dans ce but, une démarche deprotéomique post-traductionnelle dédiée, fondée sur la méthode classique dite du «Biotin-switch»(BS), a été privilégiée pour l'identification des protéines nitrosylées. Par ailleurs, afin de pouvoirévaluer les variations de nitrosylation et analyser des réponses physiologiques, nous avonsintroduit une dimension quantitative en combinant le BS à un marquage des thiols par des réactifsdifférant par la présence d'isotopes lourds (Isotope coded affinity tag, ICAT). La méthode ainsidéveloppée (BS-ICAT) a permis de caractériser des variations de nitrosylation de protéines lorsd'un stress ferrique et d'un stress salin. A côté de l'identification de cibles potentielles du NO, lesrésultats ont également attiré l'attention sur certaines limites du BS. Sur cette base, la méthodeBS-ICAT a été utilisée pour revisiter quantitativement le BS. Nous avons montré que le blocagedes thiols libres, étape initiale-clé fondant le BS, n'est que partiel et conduit à l'apparition de fauxpositifs. Simultanément, de nouveaux contrôles de spécificité ont été éprouvés. La combinaisonBS-ICAT constitue l'une des toutes premières tentatives pour la caractérisation quantitative àlarge échelle de réponses de nitrosylation. A côté d'un premier répertoire de sites de Snitrosylationchez les plantes et de l'identification de candidats potentiellement impliqués dans lesréponses aux stress en fer et en sel, l'analyse quantitative permet de proposer une utilisation du BSintégrant ses limites de façon plus contrôlée. Cette analyse souligne le besoin de méthodesalternatives où le marquage soit réalisé directement sur les nitrosothiols. / In plants, nitric oxide (NO) is involved in many biological processes such as germination or roots development and in responses to various biotic and abiotic stresses. Thereby, in iron stress situations, NO production is the earliest signaling pathway event leading to ferritins induction. NO targets remain largely unknown but it is now stated that cysteine S-nitrosylation in proteins is the main NO consequence. The present work aims at identifying NO target proteins in Arabidopsis thaliana in the context of two abiotic stresses. For this purpose, a posttranslational proteomics approach based on the classical “Biotin-Switch” method (BS) was favored to identify nitrosylated proteins. Moreover, in order to estimate changes in nitrosylation and analyze physiological responses, a quantitative dimension combining the BS and a differential isotope based labeling of thiol with the ICAT reagents (Isotope Coded Affinity Tag) was introduced. This method named BS-ICAT allowed us to characterize quantitative variations of S-nitrosylation during an iron and a salt stress. Beside the identification of potential NO targets, our results highlighted limitations of BS method through incomplete free thiol blockage, the key initial step in BS, leading to false positive identifications. Simultaneously, new control have been introduced to test the specificity of the labeling. The combination of BS and ICAT is one the first attempt to quantitatively characterize the NO response at a large scale. This quantitative analysis results in one of the first repertoire of S-nitrosylation sites in plant proteins under abiotic stress and highly suggests a careful use of BS under strict control conditions. Moreover this analysis re-enforces the emerging need for alternative methods where the labeling molecules react directly with the nitrosothiols.

L’effet anti-tumoral d'un lipide A, l’OM-174 (partie lipidique des lipopolysaccharides) a été étudié dans un modèle de cancer mammaire chez la souris. In vivo, l’OM-174 augmente la survie de la souris alors qu’in vitro il n'est pas toxique pour les cellules cancéreuses. L’OM-174 se lie au récepteur TLR4 des cellules immunitaires induisant la production de cytokines comme l’IFNγ. In vitro, l’association de cette cytokine au lipide A est cytotoxique. L’objectif de cette thèse est d’en analyser les mécanismes moléculaires. Nous avons montré, aussi bien in vitro qu’in vivo, que la cytotoxicité du lipide A/IFNγ est dépendante du TLR4, du récepteur à l’IFNγ et de l’expression de la NOS II. Nous avons également montré que les espèces radicalaires, NO et anion superoxyde formant le peroxynitrite jouent un rôle crucial dans cette cytotoxicité. L’origine de ces espèces radicalaires se trouve être la NOS II selon un processus de découplage enzymatique. Nous avons également cherché d’autres mécanismes associés pouvant expliquer la cytotoxicité du lipide A/IFNγ. Nous avons ensuite montré que le NO est capable de réagir avec les résidus cystéine de certaines protéines, un processus appelé S-nitrosylation. Une analyse protéomique nous a permis d’identifier au moins une dizaine de protéines qui sont S-nitrosylées dans les cellules cancéreuses mammaires en réponse au lipide A/IFNγ. Nous avons étudié l’impact de cette modification sur la fonction d’une des ces protéines, l’enzyme de conjugaison E2 de l’ubiquitine Ubc13, une protéine impliquée dans la prolifération et la survie cellulaire. Nous avons confirmé la nitrosylation d’Ubc13 et identifié la cystéine 87 comme cible du NO. L’expression d’une forme mutée d’Ubc13 (remplacement de la cystéine 87 par une alanine) inhibe l’auto-ubiquitination de l’enzyme et sa capacité à ubiquitiner une de ses cibles IkBα. Nous avons montré que la S-nitrosylation d’Ubc13 induit sa migration vers le noyau et rend les cellules plus sensibles à l’effet cytotoxique du lipide A/IFNγ. En résumé, nos résultats révèlent un rôle majeur et insoupçonné de la NOS II et du NO dans l’effet antitumoral du lipide A OM-174 dans un modèle de cancer mammaire chez la souris ouvrant la voie pour la conception de nouveaux traitements anticancéreux. / The anti -tumor effect of a lipid A, OM -174 (lipid portion of LPS) was studied in a model of breast cancer in mice. In vivo, OM- 174 increases the survival of mice whereas in vitro it is not toxic to cancer cells. OM -174 binds to TLR4 immune cells inducing the production of cytokines such as IFNγ. In vitro, the combination of IFNγ to lipid A is cytotoxic. The objective of this thesis is to analyze those molecular mechanisms. We have shown both in vitro and in vivo that the cytotoxicity of the lipid A / IFNγ is dependent of TLR4 and of the receptor for IFNγ, and the NOS II expression. We also showed that the radical species, NO and superoxide anion forming peroxynitrite play a crucial role in this cytotoxicity. The origin of these radical species is being NOS II enzyme in a process of decoupling. We also looked for other associated mechanisms that may explain the cytotoxicity of lipid A / IFNγ. We then showed that NO is able to react with the cysteine residues of certain proteins, a process called S- nitrosylation. A proteomic analysis allowed us to identify at least a dozen proteins that are S- nitrosylated in breast cancer cells in response to lipid A / IFNγ. We studied the impact of this change on the basis of one of these proteins, the E2 conjugating enzyme UBC13 ubiquitin, a protein involved in cell proliferation and survival. We confirmed the UBC13 nitrosylation on cysteine 87 and identified as a target of NO. The expression of a mutant of UBC13 (replacement of cysteine 87 with alanine) forms inhibits the auto-ubiquitination of the enzyme and its ability to ubiquitinylated one of its targets IkBα. We have shown that S- nitrosylation of UBC13 induced its translocation to the nucleus and greater sensitivity to the cytotoxic effect of lipid A / IFNγ in cells. In summary, our results reveal an important and unexpected role of NOS II and NO in the antitumor effect of lipid A OM- 174 in a model of breast cancer in mice opening the way for the development of new cancer treatments.

Ao longo dos últimos anos, o radical livre gasoso óxido nítrico (NO) vem ganhando destaque como uma importante molécula sinalizadora em respostas fotomorfogênicas em plantas. Sua produção e dagradação parecem incluir uma diversificada gama de rotas bioquímicas, entretanto, a importância relativa de cada um dos sistemas capazes de regular sua disponibilidade e toxidade nos tecidos vegetais ainda permanece pouco compreendida. Dentre as possíveis rotas de conjugação e degradação do NO em tecidos vegetais, postula-se que a glutationa (GSH) desempenhe um papel de destaque no armazenamento desse radical livre por meio da formação reversível da S-nitrosoglutationa (GSNO), sendo possível sua subsequente degradação através da ação da enzima S-nitrosoglutationa redutase (GSNOR). No presente trabalho investigamos a influência da luz sobre o metabolismo de NO em duas etapas de desenvolvimento vegetal caracterizados pela ocorrência de eventos de diferenciação plastidial: (I) o desestiolamento de plântulas e (II) o amadurecimento de frutos carnosos de tomateiro (Solanum lycopersicum). Além do genótipo selvagem Micro-Tom (MT), também foram utilizados os mutantes fotomorfogênicos aurea (au) e high pigment 1 e 2 (hp1 e hp2). Durante o desestiolamento das plântulas de tomateiro constatou-se um incremento progressivo tanto nos teores endógenos quando nas taxas de degradação de NO, bem como na atividade da enzima GSNOR. Sob condições luminosas similares, mutantes com respostas exageradas à luz apresentaram incrementos ainda mais evidentes nesses parâmetros do que aqueles observados no genótipo selvagem. A aplicação de inibidores de S-nitrosilação de proteínas, bem como a avaliação do conteúdo de espécies reativas de oxigênio (ROS) indicaram que tanto a formação de S-nitrosotiois quanto a interação do NO com ROS contribuíram para a determinação da capacidade de remoção de NO nos tecidos fotossinteticamente ativos de tomateiro. Em frutos, observou-se uma correlação positiva entre a atividade da enzima nitrato redutase (NR) e o padrão temporal de produção de NO, uma vez que ambos os parâmetros apresentaram maiores níveis em frutos imaturos. O amadurecimento desses frutos foi acompanhado por uma diminuição transitória dos conteúdos de NO ao passo que as taxas de degradação de NO mantiveram-se bastante reduzidas durante todo o processo de amadurecimento, sugerindo a existência de um estoque de NO na forma de GSNO ou algum outro S-nitrosotiol. A sinalização luminosa influenciou positivamente tanto a produção quanto a degradação de NO em frutos imaturos de tomateiro. Em conjunto, os resultados obtidos permitem concluir que o metabolismo do NO em tomateiro é fortemente controlado pela luz, a qual é capaz de modular conjuntamente as taxas de produção e degradação desse importante composto sinalizador. / In recent years, the gaseous free radical nitric oxide (NO) has emerged as an important signaling molecule in plant photomorphogenic response. NO production and degradation seems to include a wide range of biochemical routes; however, the relative importance of which one of the systems capable of regulating NO availability and toxicity in plant tissues remains elusive. Among all potential NO degradation and conjugation routes in plant tissues, it has been suggested that gluthathione (GSH) plays a key role in NO storage due to the formation of S-nitrosogluthathione (GSNO), being possible its subsequent degradation by the action of enzyme S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR). In this work, we have investigated the light influence on NO metabolism during two plant developmental events characterized by the occurrence of plastidial differentiation: (I) seedling de-etiolation and (II) fruit ripening of tomato (Solanum lycopersicum). Besides the wild-type Micro-Tom (MT) genotype, the tomato photomorphogenic mutants aurea (au) and high pigment 1 and 2 (hp1 and hp2) were also employed in this study. During the de-etiolation of tomato seedlings, a progressive increment was observed in the NO endogenous levels and degradation rates as well as in the GSNOR activity. Under similar light conditions, light hypersensitive mutants exhibited more conspicuous increases in these parameters than those detected in the wild-type genotype. Feeding protein S-nitrosylation inhibitors and measurements of reactive oxygen species (ROS) production indicated that both S-nitrosothiols formation and NO interaction with ROS may to contribute for determining the NO removal capacity in photosynthetically active tissues of tomato. In fruits, a positive correlation was observed between nitrate reductase (NR) activity and the temporal pattern of NO production since both parameters exhibited increased levels in immature fruits. The ripening of theses fruits was accompanied by a transitory reduction in endogenous NO levels whereas its degradation rates were maintained reduced all over the ripening process, thereby suggesting the existence of a more stable NO reservoir such as GSNO or some other S-nitrosothiol. In general light signaling positively influenced both NO production and degradation in mature green tomato fruits. Altogether, the data obtained indicated that tomato NO metabolism is significantly influenced by light, which is able to simultaneous modulate both the production and degradation of this important signaling compound.

Óxido nítrico (NO) é um segundo mensageiro biosintetizado a partir de L-Arginina e envolvido em sinalização celular por diferentes mecanismos: ativação da produção de cGMP pela Guanilil Ciclase; regulação de enzimas pela interação com seus centros metálicos; ou pela S-nitrosilação de cisteína e nitração de tirosina, modificações pós-traducionais, capazes de modular a atividade de diversas proteínas. Neste trabalho buscou-se investigar se a interação de Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, com a matriz extracelular (ECM) era capaz de modular a sinalização por NO em T. cruzi. Tripomastigotas de T. cruzi incubados com ECM apresentaram diminuição na atividade de NOS e menor produção de NO. Da mesma maneira, observou-se, por imunofluorescência indireta e imunoblotting, uma diminuição no padrão geral de S-nitrosilação e nitração de proteínas do parasita incubado com ECM. Além disto, os perfis de proteínas S-nitrosiladas e nitradas foram modificados, predominando a denitrosilação e denitração (de 40 para 22 proteínas nitradas após a adesão a ECM), embora em alguns casos tenha sido observado um aumento de nitração, como em proteínas de citoesqueleto (de 2,5% para 9,1% após adesão). O mesmo padrão foi observado em relação a proteínas nitradas, com diminuição de 48 para 20 proteínas após adesão a ECM e novamente com modificação no percentual de proteínas nitradas pertencentes a processos biológicos distintos, como proteínas relacionadas à síntese proteica (35,4% das proteínas nitradas no grupo controle e apenas 5,0% no grupo incubado com ECM). Apesar do perfil de denitração, algumas classes de proteínas têm aumento no número de alvos nitrados, como proteínas relacionadas a metabolismo (de 18,8% para 35,0%), além de alguns alvos específicos que têm aumento na nitração, como enolase. Em suma, os resultados sugerem que a sinalização intracelular por NO em tripomastigotas de T. cruzi é modulada durante a adesão do parasita a componentes da matrix extracelular, tanto através da via clássica de produção de óxido nítrico, quanto por modificações pós-traducionais induzidas por NO. / Nitric oxide (NO) is a second messenger biosynthesized from L-Arginine and involved in cell signaling by different mechanisms: activation of cGMP production by guanilyl cyclase; regulation of enzymes by interaction with their metallic centers; or by S-nitrosylation of cysteine and nitration of tyrosine, posttranslational modifications capable of modulating the activity of several proteins. In this work, we sought to investigate whether the interaction between extracellular matrix (ECM) and Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas\' disease, was capable of modulating NO signaling in the parasite. Trypomastigotes incubated with ECM presented a decrease in NOS activity and NO production. Accordingly, a decrease in S-nitrosylation and tyrosine nitration of proteins from ECM-incubated parasites was also observed, as evidenced by indirect immunofluorescence and immunoblotting. In addition, S-nitrosylated and tyrosine nitrated proteins profiles were modified in ECM-incubated parasites, with an enhancement in protein denytrosylation and denitration. A decrease from 40 to 22 of S-nitrosylated proteins was detected after parasite adhesion to ECM, more evident in some protein groups (as for example 52.5% hypothetical proteins modified in the control group against 36.4% after adhesion). On the other hand, an increase of S-nitrosylation was detected in other groups of proteins, such as cytoskeleton proteins (from 2.5% of total S-nitrosylated proteins to 9.1% after adhesion). The same general pattern was observed in relation to tyrosine-nitrated proteins, with a decrease in the number of modified proteins from 48 to 20 after incubation with ECM, exemplified by those related to protein synthesis, with a contribution of 35.4% in the control group versus 5.0% after treatment with ECM. Despite this general denitration profile, some protein classes have an increase in nitration, such as metabolic proteins (from 18.8% to 35.0%), in addition to some specific targets, such as enolase. Taken together, the results suggest that NO signaling is modulated during adhesion of T. cruzi to components of the extracellular matrix, probably by the classical nitric oxide pathway and by NO-induced post translational modifications.

O núcleo supraóptico (SON), uma das várias áreas hipotalâmicas envolvidas no equilíbrio hidroeletrolítico corporal, é de suma importância na complexa rede de sistemas fisiológicos que atuam na manutenção da homeostase. Este núcleo é constituído por um grupamento de neurônios magnocelulares (MNCs) responsáveis pela síntese e liberação de vasopressina e ocitocina, neuropeptídios cujos principais efeitos se fazem sobre a excreção de água e sal pelos rins. Alterações da osmolalidade plasmática implicam em mudanças funcionais intrínsecas (propriedades de membrana) e extrínsecas (sinápticas) na excitabilidade desses neurônios, com consequências para a liberação desses neuropeptídios. Além da osmolalidade, outros fatores são capazes de modular a excitabilidade dos MNCs, dentre elas o óxido nítrico (NO). Vários estudos têm mostrado que o NO desempenha um papel neuromodulador importante nesses neurônios, resultando na inibição da excitabilidade dos MNCs durante condições isotônicas e hipertônicas. Além disso, estas respostas são independentes das conexões sinápticas e envolvem a modulação de canais para cátions ativados por hiperpolarização e nucleotídeo cíclico (HCN). Entretanto, ainda é desconhecido à origem deste mensageiro neural, o envolvimento de outros tipos celulares nesta resposta, os mecanismos de sinalização utilizados pelo NO na modulação dos canais HCN, se esta modulação também ocorre em situações de aumentos de osmolaridade plasmática, e se há diferenças na modulação nitrérgica entre os fenótipos celulares. Assim, dada a importância deste núcleo para a manutenção do meio interno, elucidar os mecanismos pelo qual o NO modula os neurônios magnocelulares do SON torna-se essencial para o entendimento do controle da sua excitabilidade elétrica. Desta forma, considerando que: 1) os neurônios magnocelulares expressam a enzima para a síntese do NO em condições isotônicas e hipertônicas; 2) que os efeitos do NO parecem envolver, principalmente, a guanilato ciclase solúvel com consequente produção de cGMP; e 3) que os canais HCN são modulados por este segundo mensageiro, nós hipotetizamos que os MNCs são capazes de produzir NO independente de outros tipos celulares e do fenótipo celular, e que a modulação nitrérgica dos canais HCN envolve a produção de cGMP. Frente a isso, este projeto teve como objetivo: 1) investigar o envolvimento das células gliais na modulação nitrérgica observada nos MNCs; 2) desvendar a origem do NO; 3) estudar as vias de sinalização da modulação nitrérgica sobre os canais HCN 4) avaliar se os efeitos do NO nos canais HCN também ocorre durante estímulo hiperosmótico agudo, e 5) se há diferença na modulação do NO em relação ao fenótipo celular. Para tanto, utilizamos a eletrofisiologia celular, essencialmente a técnica de patch clamp em fatias do SON e neurônios isolados. Experimentos de fluorescência foram realizados para a detecção da atividade intracelular do NO com o intuito de elucidar a origem deste mensageiro neural. Além disso, técnicas de biologia celular e molecular também foram utilizadas para caracterizar o fenótipo da célula que se está registrando, uma vez que 3 tipos já foram descritos neste núcleo e podem responder de maneira diferente ao mesmo estímulo. Até o presente nossos resultados mostraram que: 1) A modulação nitrérgica nos MNCs não envolve células gliais, 2) O NO é produzido pelos neurônios magnocelulares durante estímulo hipertônico, e este processo é dependente das alterações da osmolalidade, mas não da atividade elétrica dos neurônios frente ao estímulo; 3) Esta modulação ocorre por um mecanismo dependente de S-nitrosilação e independentemente da formação de cGMP; 4) a modulação nitrérgica nos canais HCN não difere entre os diferentes tipos de fenótipos encontrados e também ocorre durante aumentos da osmolaridade plasmática. Frente a estes resultados podemos concluir que a excitabilidade dos neurônios magnocelulares do SON é essencialmente determinada por um efeito do NO sobre os canais HNC por um mecanismo dependente de S-nitrosilação. Desta forma, o NO apresenta-se como mais uma molécula nesse complexo mecanismo de manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico do organismo. / The hypothalamic supraoptic nucleus (SON) plays an importante role in the complex systems network that operates to maintain the hydroelectrolytic balance of the body. The nucleus is formed by a cluster of neurons (magnocellular neurosecretory cells - MNCs) responsible for the synthesis and secretion of vasopressin and oxytocin, whose main effects are on the excretion of water and salt by the kidneys. Changes in plasma osmolality lead to intrinsic (membrane properties) and extrinsic (synaptic inputs) functional changes in these neurons, with consequences for neuropeptides release. Furthermore, besides osmolality, studies have shown that the electrical excitability of MNCs can be modulated by several factors, including nitric oxide (NO). Previous studies of our group, demonstrated that NO inhibits the excitability of MNCs during isotonic and hypertonic conditions and that this responses are independent of synaptic connections and involve the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels (HCN). However, some points remained unclear, such as: What is the origin of NO? Are there other cell types involved in this response? What signaling pathway does NO use to modulate HCN channels? Does NO modulate HCN channels during changes in the plasma osmolality? Are there differences in the nitrergic modulation according to cellular phenotypes? Considering that: 1) MNCs express the enzyme for nitric oxide synthesis, in isotonic and hypertonic conditions; 2) the NO effects involve, mainly, activation of guanylate cyclase with consequent increase in the cGMP production, and that 3) HCN channels are modulated by this second messenger, we hypothesize that MNCs are able to produce NO independently of other cells and cellular phenotypes, and that nitrergic modulation of HCN channels involves the guanylate cyclase activation. To answer those questions and to test our hypothesis, we used cellular electrophysiology, essentially Whole cell patch clamp using slices of the SON and isolated neurons. Fluorescence experiments were also used to detect the intracellular activity of NO in order to clarify the origin of this neuronal messenger. In addition, cellular and molecular biology approaches were also used to characterize the phenotype of recorded cells, since 3 distinct cellular types have been described in this nucleus. Our results demonstrate that: 1) NO is produced by MNCs during hypertonic stimulation, and this process is dependent on changes in osmolality, but not on the electrical activity of MNCs in response to the stimulus; 2) NO modulates the electric excitability of the neurons by acting on HCN channels and it does not differ among cellular phenotypes; and 3) the effect of NO occurs by a mechanism dependent of S-nitrosylation and independently of cGMP production. Considering these results we may conclude that electrical excitability of magnocellular neurons of the supraoptic nucleus is essentially determined by an effect of NO on Ih currents by a mechanism dependent of S-nitrosylation. Acting on HCN channels, NO is another player in the complex set of mechanisms controlling the hydroelectrolytic balance.

O núcleo supraóptico (SON), uma das várias áreas hipotalâmicas envolvidas no equilíbrio hidroeletrolítico corporal, é de suma importância na complexa rede de sistemas fisiológicos que atuam na manutenção da homeostase. Este núcleo é constituído por um grupamento de neurônios magnocelulares (MNCs) responsáveis pela síntese e liberação de vasopressina e ocitocina, neuropeptídios cujos principais efeitos se fazem sobre a excreção de água e sal pelos rins. Alterações da osmolalidade plasmática implicam em mudanças funcionais intrínsecas (propriedades de membrana) e extrínsecas (sinápticas) na excitabilidade desses neurônios, com consequências para a liberação desses neuropeptídios. Além da osmolalidade, outros fatores são capazes de modular a excitabilidade dos MNCs, dentre elas o óxido nítrico (NO). Vários estudos têm mostrado que o NO desempenha um papel neuromodulador importante nesses neurônios, resultando na inibição da excitabilidade dos MNCs durante condições isotônicas e hipertônicas. Além disso, estas respostas são independentes das conexões sinápticas e envolvem a modulação de canais para cátions ativados por hiperpolarização e nucleotídeo cíclico (HCN). Entretanto, ainda é desconhecido à origem deste mensageiro neural, o envolvimento de outros tipos celulares nesta resposta, os mecanismos de sinalização utilizados pelo NO na modulação dos canais HCN, se esta modulação também ocorre em situações de aumentos de osmolaridade plasmática, e se há diferenças na modulação nitrérgica entre os fenótipos celulares. Assim, dada a importância deste núcleo para a manutenção do meio interno, elucidar os mecanismos pelo qual o NO modula os neurônios magnocelulares do SON torna-se essencial para o entendimento do controle da sua excitabilidade elétrica. Desta forma, considerando que: 1) os neurônios magnocelulares expressam a enzima para a síntese do NO em condições isotônicas e hipertônicas; 2) que os efeitos do NO parecem envolver, principalmente, a guanilato ciclase solúvel com consequente produção de cGMP; e 3) que os canais HCN são modulados por este segundo mensageiro, nós hipotetizamos que os MNCs são capazes de produzir NO independente de outros tipos celulares e do fenótipo celular, e que a modulação nitrérgica dos canais HCN envolve a produção de cGMP. Frente a isso, este projeto teve como objetivo: 1) investigar o envolvimento das células gliais na modulação nitrérgica observada nos MNCs; 2) desvendar a origem do NO; 3) estudar as vias de sinalização da modulação nitrérgica sobre os canais HCN 4) avaliar se os efeitos do NO nos canais HCN também ocorre durante estímulo hiperosmótico agudo, e 5) se há diferença na modulação do NO em relação ao fenótipo celular. Para tanto, utilizamos a eletrofisiologia celular, essencialmente a técnica de patch clamp em fatias do SON e neurônios isolados. Experimentos de fluorescência foram realizados para a detecção da atividade intracelular do NO com o intuito de elucidar a origem deste mensageiro neural. Além disso, técnicas de biologia celular e molecular também foram utilizadas para caracterizar o fenótipo da célula que se está registrando, uma vez que 3 tipos já foram descritos neste núcleo e podem responder de maneira diferente ao mesmo estímulo. Até o presente nossos resultados mostraram que: 1) A modulação nitrérgica nos MNCs não envolve células gliais, 2) O NO é produzido pelos neurônios magnocelulares durante estímulo hipertônico, e este processo é dependente das alterações da osmolalidade, mas não da atividade elétrica dos neurônios frente ao estímulo; 3) Esta modulação ocorre por um mecanismo dependente de S-nitrosilação e independentemente da formação de cGMP; 4) a modulação nitrérgica nos canais HCN não difere entre os diferentes tipos de fenótipos encontrados e também ocorre durante aumentos da osmolaridade plasmática. Frente a estes resultados podemos concluir que a excitabilidade dos neurônios magnocelulares do SON é essencialmente determinada por um efeito do NO sobre os canais HNC por um mecanismo dependente de S-nitrosilação. Desta forma, o NO apresenta-se como mais uma molécula nesse complexo mecanismo de manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico do organismo. / The hypothalamic supraoptic nucleus (SON) plays an importante role in the complex systems network that operates to maintain the hydroelectrolytic balance of the body. The nucleus is formed by a cluster of neurons (magnocellular neurosecretory cells - MNCs) responsible for the synthesis and secretion of vasopressin and oxytocin, whose main effects are on the excretion of water and salt by the kidneys. Changes in plasma osmolality lead to intrinsic (membrane properties) and extrinsic (synaptic inputs) functional changes in these neurons, with consequences for neuropeptides release. Furthermore, besides osmolality, studies have shown that the electrical excitability of MNCs can be modulated by several factors, including nitric oxide (NO). Previous studies of our group, demonstrated that NO inhibits the excitability of MNCs during isotonic and hypertonic conditions and that this responses are independent of synaptic connections and involve the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels (HCN). However, some points remained unclear, such as: What is the origin of NO? Are there other cell types involved in this response? What signaling pathway does NO use to modulate HCN channels? Does NO modulate HCN channels during changes in the plasma osmolality? Are there differences in the nitrergic modulation according to cellular phenotypes? Considering that: 1) MNCs express the enzyme for nitric oxide synthesis, in isotonic and hypertonic conditions; 2) the NO effects involve, mainly, activation of guanylate cyclase with consequent increase in the cGMP production, and that 3) HCN channels are modulated by this second messenger, we hypothesize that MNCs are able to produce NO independently of other cells and cellular phenotypes, and that nitrergic modulation of HCN channels involves the guanylate cyclase activation. To answer those questions and to test our hypothesis, we used cellular electrophysiology, essentially Whole cell patch clamp using slices of the SON and isolated neurons. Fluorescence experiments were also used to detect the intracellular activity of NO in order to clarify the origin of this neuronal messenger. In addition, cellular and molecular biology approaches were also used to characterize the phenotype of recorded cells, since 3 distinct cellular types have been described in this nucleus. Our results demonstrate that: 1) NO is produced by MNCs during hypertonic stimulation, and this process is dependent on changes in osmolality, but not on the electrical activity of MNCs in response to the stimulus; 2) NO modulates the electric excitability of the neurons by acting on HCN channels and it does not differ among cellular phenotypes; and 3) the effect of NO occurs by a mechanism dependent of S-nitrosylation and independently of cGMP production. Considering these results we may conclude that electrical excitability of magnocellular neurons of the supraoptic nucleus is essentially determined by an effect of NO on Ih currents by a mechanism dependent of S-nitrosylation. Acting on HCN channels, NO is another player in the complex set of mechanisms controlling the hydroelectrolytic balance.

No description available.

Post-translational modification is an intracellular process that modifies the properties of proteins to extend the range of protein function without spending energy in de novo peptide synthesis. There are many post-translational modifications, for example, phosphorylation, ubiquitination, and S-nitrosylation. S-Nitrosylation is a post-translational modification which adds nitric oxide (NO) to sulfhydryl groups at cysteine residues to form S-nitrosothiol (SNO), and is required for plant immunity and fertility. Cellular NO changes between a pool of free NO and bound SNO. During pathogen infection, nitrosative stress in plants is mainly controlled by Snitrosothiolglutathione reductase (GSNOR) via the decomposition of GSNO. GSNOR is an alcohol dehydrogenase type 3 (ADH3) which has both GSNOR and formaldehyde dehydrogenase (FDH) activities. The roles of S-nitrosylation in mammals overlap with those in plants. This conservation led us to explore the relationship between S-nitrosylation, immune response, and fertility in Drosophila melanogaster as it might prove to be a good genetic model for further analysis of the role of S-nitrosylation in animals. I have identified fdh as the likely gsnor in D. melanogaster and have knocked this out using an overlapping deficiency technique in order to observe the effect on immunity and fertility. There are two main pathways in the Drosophila innate immune response, the Toll pathway for protecting against gram-positive bacteria and fungi, and the Imd pathway against gram-negative bacteria. I have investigated the effect of removing GSNOR on sensitivity to gramnegative bacteria (Escherichia coli and Erwinia carotovora) by septic and oral infection, and to fungi (Beauveria bassiana). Susceptibility to infection by the gram negative bacteria was similar to wild-type but susceptibility to B. bassiana was increased. This increase in susceptibility correlated with reduced anti-fungal antimicrobial peptide (AMP) production after B. bassiana infection. This suggests that GSNOR might be required for the normal activity of the Toll pathway or novel Toll-independent processes. We also observed that gsnor knockout impairs fertility and development of embryos.

Mammals are well adapted to respond to changes in ambient oxygen concentration (O2) by activating homeostatic physiological and cellular responses which maintain cell function and survival. Although anemia has been associated with increased mortality in a number of clinical settings, surprisingly little is known about how anemia affects tissue PO2 and hypoxia signaling. Because nitric oxide synthases (NOSs) figure prominently in the cellular response to acute hypoxia, we define the effects of NOS deficiency in acute anemia. Unlike wildtype (WT), endothelial NOS (eNOS) and inducible NOS (iNOS) deficient mice, only neuronal NOS (nNOS) deficient mice (nNOS-/-) demonstrated increased mortality during acute anemia. With respect to global tissue O2 delivery, anemia did not increase cardiac output (CO) or reduce systemic vascular resistance (SVR) in nNOS -/- mice. At the cellular level, anemia increased expression of HIF-1α and HIF-responsive mRNA levels (EPO, VEGF, GLUT1, PDK) in the brain of WT, but not nNOS-/- mice. These date suggest that nNOS contributed to cardiovascular and cellular mechanisms which maintain oxygen homeostasis in anemia. To confirm the physiological relevance of these findings in a whole animal model of anemia, we utilized transgenic animals which express a reporter HIF-α(ODD)-luciferase chimeric protein. Using this model, we confirmed that nNOS is essential for anemia-induced increases in HIF-α protein stability in vivo in real-time whole animal images and brain tissue. With respect to the mechanism, nNOS-derived NO is known to affect S-nitrosylation of specific proteins, which may interfere with HIF-α and von Hippal Lindau protein (pVHL) interaction. Utilizing the biotin switch assay, we demonstrated that anemia caused a time-dependent increase in S-nitrosylation of pVHL in brain tissue from WT but not nNOS-/- mice. In addition, anemia also leads to a decrease in S-nitrosoglutathione (GSNO) reductase protein expression, an important enzyme responsible for de-nitrosylation of proteins. The combination of increased nNOS expression and decreased GSNO reductase expression would favor prolonged S-nitrosylation of proteins during anemia. These findings identify nNOS effects on the HIF/pVHL signaling pathway as critically important in the physiological responses to anemia in vivo. By contrast, after exposure to acute hypoxia, nNOS-/- mice survived longer, retained the ability to regulate CO and SVR, and increased brain HIF-α protein levels and HIF-responsive mRNA transcripts. This comparative assessment provided essential mechanistic insight into the unexpected and striking difference between anemia and hypoxia. Understanding the adaptive responses to acute anemia will help to define novel therapeutic strategies for anemic patients.