Thesis (Ph. D)--University of Washington, 1999. / Includes bibliographical references (leaves 364-392).

Thesis (Ph. D.)--Cornell University, May, 2008. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 127-162)

Thesis (Ph. D.)--University of Oklahoma. / Includes bibliographical references.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000438120-Texto+Completo-0.pdf: 2337312 bytes, checksum: 3bcbd6b2d333489c6e0cefb866d0b73c (MD5) Previous issue date: 2012 / Ewing’s sarcoma was first described by James Ewing in 1921 and it is the second most common bone tumor in children and young adults. Both chromosomal breakage and translocation occur in this sarcoma. The EWS gene is localized in chromosome 22 and is involved in this translocation. However, little is known about this gene breaking region and what sequences could be involved in higher chromosomal break susceptibility. In this study we aimed to investigate three SNPs in the EWS gene breaking region in a healthy subjects’ population and in Ewing’s sarcoma patients. Genotyping was performed by TaqMan® assay for allelic discrimination using Real-Time PCR System. We conducted analysis of allelic and genotypic frequencies, as well as association and transmission disequilibrium tests. According to our results, the control group showed similar and different genotypes distribution of all SNPs when compared to other populations studied by different projects, which shows how important it is to know the frequencies of our population. To test the hypothesis that some SNP, SNParrangement or haplotype could influence in the susceptibility to develop Ewing’s sarcoma, we compared affected with non-affected individuals using association studies. The results showed one significant difference: a higher presence of homozygote T-rs4820804 in Ewing’s Sarcoma patients. Transmission Disequilibrium Test (TDT) was performed to compare data from Ewing’s Sarcoma patients and from their families but no statistically significant result was found. In conclusion, we find that the TT-rs4820804 EWS genotype can be associate with Ewing’s sarcoma and that the rs4820804 SNP can be a candidate to understand the EWS breakage susceptibility. / O sarcoma de Ewing foi primeiramente descrito por James Ewing em 1921 e é o segundo tumor ósseo mais frequente em crianças, adolescente e adultos jovens. Neste sarcoma, é comum ocorrer a quebra e a translocação cromossômica. Dentre os genes envolvidos nesta translocação está o gene EWS, localizado no cromossomo 22. Entretanto, pouco se sabe a respeito da região de quebra deste gene e quais sequências poderiam levar a uma maior susceptibilidade a quebra cromossômica. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi investigar três polimorfismos de base única (SNPs) presentes na região de quebra do gene EWS, em uma população de indivíduos saudáveis e em pacientes afetados pelo Sarcoma de Ewing. A genotipagem para os SNPs selecionados foi realizada usando TaqMan SNP Genotyping Assay pelo sistema de PCR em tempo real. Nós realizamos análises de frequências alélicas e genotípicas, assim como um estudo de associação e de desequilíbrio de transmissão.A comparação das frequências alélicas e genotípicas entre as populações deste estudo e entre populações de projetos já publicados mostrou particularidades entre as populações, revelando a importância de se conhecer tais frequências na população de estudo. Para testar a hipótese de que algum SNP, haplótipo ou combinação específica de SNPs poderia influenciar na susceptibilidade ao Sarcoma de Ewing, comparamos afetados com não-afetados realizando estudos de associação cujos resultados mostraram uma única diferença significativa: a maior incidência no genótipo TT-rs4820804 entre os afetados pelo Sarcoma de Ewing. O Teste de Desequilíbrio de Transmissão (TDT) comparou os dados dos pacientes afetados e os dados de seus familiares, mas nenhum resultado significativo foi encontrado. Em conclusão, o genótipo TT-rs4820804 pode estar associado ao Sarcoma de Ewing e o SNP rs4820804 pode ser candidato para auxílio do entendimento da susceptibilidade de quebra do gene EWS.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000438127-Texto+Completo-0.pdf: 909961 bytes, checksum: 5f9f40febc8291b363b759367f823d98 (MD5) Previous issue date: 2012 / In this study the SNPs rs640098, rs491714, rs611307 into the FLI1 gene were genotyped in a sample of 201 subjects from southern Brazilian population, in 24 Ewing’s sarcoma patients (geographically matched with control group) and 54 of their family members, including parents and siblings. We performed association studies comparing genotypic frequencies of rs640098, rs491714, rs611307 into the FLI1 gene, and all possible genotype combinations between Ewing’s Sarcoma patients and control group. Of the three SNPs investigated individually, only one of them showed a significant result when compared to the control group; our non-combined analysis revealed a significantly higher presence of homozygote A-rs497714 among Ewing’s Sarcoma patients (p=0. 0065; Chi square Test). In all other tested clusters, we always noticed a higher rate of homozygote A-rs497714 among Ewing’s Sarcoma patients independent of the other SNP-arrangements and/or haplotype combinations. In addition, we performed transmission disequilibrium tests comparing data from Ewing’s Sarcoma patients and from their families (parents and siblings), but no statistically significant result was found. In conclusion, the present study provides evidence statistically founded that the AA-rs497714 FLI1 genotype can associated with Ewing's sarcoma. And that this polymorphism can be clinically useful as a potential genetic marker to the prognostic of risk to develop this cancer or to provide insights into FLI1 chromosome breakage context of tumorigenesis. / Neste estudo, os SNPs rs640098, rs491714, rs611307 no gene FLI1 foram genotipados em uma amostra de 201 indivíduos da população do sul do Brasil, e em 24 pacientes portadores de Sarcoma Ewing (geograficamente comparado com grupo controle) e 54 de seus familiares, incluindo pais e irmãos. Realizamos estudos de associação, comparando as freqüências genotípicas do rs640098 e rs491714 e rs611307 no gene FLI1, e todas as combinações possíveis entre o genótipo de pacientes Sarcoma de Ewing e grupo controle. Dos três SNPs investigados individualmente, apenas um deles apresentou um resultado significativo quando comparado com o grupo controle; nossa análise não-combinada revelou uma presença significativamente maior de homozigoto A-rs497714 entre os pacientes de Sarcoma Ewing (p = 0,0065; Chi quadrado). Em todos os outros grupos testados, foi notada uma maior taxa de homozigoto A-rs497714 entre os pacientes com Sarcoma de Ewing, independentemente dos outros arranjos e / ou combinações de SNP e haplótipos. Além disso, foram realizados testes de desequilíbrio de transmissão, comparando dados de pacientes portadores de Sarcoma de Ewing e de suas famílias (pais e irmãos), mas nenhum resultado estatisticamente significativo foi encontrado. Em conclusão, o presente estudo fornece evidências estatisticamente fundada de que o genótipo AA-rs497714 FLI1 pode associado ao sarcoma de Ewing. E que este polimorfismo pode ser clinicamente útil como um potencial marcador genético para o prognóstico de risco para desenvolver este câncer ou para fornecer insights no contexto de quebras cromossômicas de tumorigênese no gene FLI1.

Ewing Sarcoma (ES) is an aggressive pediatric solid tumor. Even though overall-survival for localized patients is approximately 70%, the overall-survival for high risk ES patients has not improved in the last 20 years. Therefore, there is a need for exploration of new therapeutic agents in ES. Recent evidence has demonstrated that ES cells behave like BRCA-deficient tumor types which renders them sensitive to PARP inhibitors in vitro and in vivo. However, a phase II study of the efficacy of single-agent PARP inhibition in patients with relapsed ES did not significantly improve outcome. As single-agent therapy is rarely expected to result in significant clinical responses, in this study, we plan to validate potential targeted combination therapies with PARP inhibitors in ES. Since ES appears to demonstrated BRCA-deficient biology with impaired homologous recombination, cells are expected to be sensitive to both PARP inhibitors and ATR inhibitors, drugs which have a role in regulating DNA damage and impairing homologous recombination. In breast cancer and ovarian cell lines with genetic BRCA-deficiency, PARP and ATR inhibitors have synergistic activity. We hypothesize that these inhibitors will also have synergistic anti-Ewing activity. Furthermore, we recognize that ES cells demonstrate remarkably quiet genomes suggesting that there is minimal ongoing DNA-damage when cells are growing unperturbed. Therefore, we also plan to test the effect of adding low-dose genotoxic chemotherapy to induce additional sensitivity to the combination of PARP and ATR inhibitors in ES. The specific aims of this study were to explore the possible anti-tumor effect of PARP inhibitors combined with ATR inhibitors in ES cell lines, and to explore whether low dose genotoxic chemotherapy with SN38 can potentiate the anti-tumor effect of combined PARP and ATR inhibition in ES cell lines. We studied the anti-Ewing Sarcoma effect of the combination of a PARP inhibitor, AZD2281, and an ATR inhibitor, AZD6738, across a range of doses with and without low doses of a DNA damaging agent, SN38 (irinotecan metabolite), in two ES cell lines. We analyzed synergy by determining the Combination Index (CI) and Fractional Inhibition (FA) of each combination. We found that the ATR inhibitor, AZD6738, was synergistic across large range of concentrations when combined with the PARP inhibitor, AZD2281, in ES cell lines. We also found that treatment of cells with low doses of SN38 increases ES cell sensitivity to treatment with the PARP inhibitor and ATR inhibitor combination. This study provides preclinical support for additional studies exploring these combinations in ES. Given the low number of pediatric patients with ES compared to adult cancer patients, there will be limited attempts in combining these agents in clinical trials. Therefore, the development of an in vivo trial testing the safety and efficacy of this combination in ES mouse models is proposed. / 2020-07-03T00:00:00Z

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-25Bitstream added on 2015-01-26T13:30:39Z : No. of bitstreams: 1 000793411.pdf: 2869881 bytes, checksum: dde8b87e326aaccf874b6b62350ca99d (MD5) / O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gammaherpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (SK). A proteína K1 do KSHV é conhecida por aumentar a sobrevivência e proliferação celular em células infectadas. A ORF-K1 viral apresenta elevada variabilidade, de modo a discriminar diferentes genótipos do KSHV. Até o momento não se sabe se diferentes genótipos virais apresentam características biológicas próprias. Assim, vetores recombinantes contendo a ORF-K1 de genótipos virais A e B foram gerados. A ORF-K1 foi obtida a partir do DNA de linhagens de linfoma de efusão primária (PEL) constitutivamente infectadas pelo KSHV. O amplicon da ORF-K1 e vetor comercial foram digeridos, ligados e clonados em bactéria E. coli DH5α. Clones selecionados foram então submetidos à sequenciamento automatizado de DNA. As sequências geradas dos vetores recombinantes foram alinhadas e comparadas com sequências-protótipo de ORF-K1 do KSHV. Sequência de aminoácidos dos vetores recombinantes foram geradas e analisadas quanto a região codificadora do ITAM de K1. Um clone validado de cada vetor recombinante foi transfectado estavelmente em células HEK293 e a expressão de K1 foi avaliada por Western blot (WB) O sequenciamento de DNA demonstrou que a ORF-K1 dos vetores recombinantes de genótipo A, B e C corresponde a de sequências-protótipo depositadas de linhagens de PEL. A presença de K1 no lisado de células HEK293 transfectadas foi demonstrada por WB. A análise da sequência de aminoácidos de K1 codificada nos vetores recombinantes revelou que o domínio ITAM de K1 do genótipo B apresenta aminoácidos distintos em relação ao ITAM de K1 de genótipos A e C. Portanto, vetores recombinantes de ORF-K1 foram produzidos e validados, e serão úteis para se estabelecer modelo experimental para análises das propriedades biológicas da proteína K1 do KSHV / Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is a gammaherpesvirus associated with the development of Kaposi's sarcoma. The K1 protein of KSHV has been shown to induce increases the survival and proliferation of infected cells. The viral ORF-K1 shows high variability, so it is possible to distinguish different KSHV genotypes (genotypes A, B, C, D). So far, it is unclear whether different viral genotypes have their own biological characteristics. To this intent, recombinant vectors were generated containing the ORFK1 genotypes A and B. ORF-K1 was obtained from the DNA of primary effusion lymphoma (PEL) cell lines. The amplicon generated and the commercial vector were digested, bonded and cloned in E.coli DH5α. Selected clones underwent automated DNA sequencing. The generated sequences were compared with prototype sequences of ORF-K1. The amino acid sequences from vectors were generated and analyzed in the K1 ITAM-coding region. Validated clones were stably transfected into HEK293 cells and K1 expression was evaluated using Western blot (WB). DNA sequencing showed that the ORF-K1 recombinant vectors corresponds to the prototype sequences deposited from PEL cell lines. WB demonstrated the presence of K1 in the lysate of HEK293 transfected cells. Analysis of the K1 amino acid sequence encoded in the vectors revealed that ITAM domain of K1 (genotype B) has distinct amino acids from the ones in the ITAM domain of K1 (genotypes A and C). Therefore ORF-K1 recombinant vectors were produced and validated, and will be useful to establish an experimental model for analysis of the biological properties of the K1 protein

Orientador: Deilson Elgui de Oliveira / Banca: Claudia Esther Alicia Rocio Hassan / Banca: João Pessoa Araújo Junior / Resumo: O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gammaherpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (SK). A proteína K1 do KSHV é conhecida por aumentar a sobrevivência e proliferação celular em células infectadas. A ORF-K1 viral apresenta elevada variabilidade, de modo a discriminar diferentes genótipos do KSHV. Até o momento não se sabe se diferentes genótipos virais apresentam características biológicas próprias. Assim, vetores recombinantes contendo a ORF-K1 de genótipos virais A e B foram gerados. A ORF-K1 foi obtida a partir do DNA de linhagens de linfoma de efusão primária (PEL) constitutivamente infectadas pelo KSHV. O amplicon da ORF-K1 e vetor comercial foram digeridos, ligados e clonados em bactéria E. coli DH5α. Clones selecionados foram então submetidos à sequenciamento automatizado de DNA. As sequências geradas dos vetores recombinantes foram alinhadas e comparadas com sequências-protótipo de ORF-K1 do KSHV. Sequência de aminoácidos dos vetores recombinantes foram geradas e analisadas quanto a região codificadora do ITAM de K1. Um clone validado de cada vetor recombinante foi transfectado estavelmente em células HEK293 e a expressão de K1 foi avaliada por Western blot (WB) O sequenciamento de DNA demonstrou que a ORF-K1 dos vetores recombinantes de genótipo A, B e C corresponde a de sequências-protótipo depositadas de linhagens de PEL. A presença de K1 no lisado de células HEK293 transfectadas foi demonstrada por WB. A análise da sequência de aminoácidos de K1 codificada nos vetores recombinantes revelou que o domínio ITAM de K1 do genótipo B apresenta aminoácidos distintos em relação ao ITAM de K1 de genótipos A e C. Portanto, vetores recombinantes de ORF-K1 foram produzidos e validados, e serão úteis para se estabelecer modelo experimental para análises das propriedades biológicas da proteína K1 do KSHV / Abstract: Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is a gammaherpesvirus associated with the development of Kaposi's sarcoma. The K1 protein of KSHV has been shown to induce increases the survival and proliferation of infected cells. The viral ORF-K1 shows high variability, so it is possible to distinguish different KSHV genotypes (genotypes A, B, C, D). So far, it is unclear whether different viral genotypes have their own biological characteristics. To this intent, recombinant vectors were generated containing the ORFK1 genotypes A and B. ORF-K1 was obtained from the DNA of primary effusion lymphoma (PEL) cell lines. The amplicon generated and the commercial vector were digested, bonded and cloned in E.coli DH5α. Selected clones underwent automated DNA sequencing. The generated sequences were compared with prototype sequences of ORF-K1. The amino acid sequences from vectors were generated and analyzed in the K1 ITAM-coding region. Validated clones were stably transfected into HEK293 cells and K1 expression was evaluated using Western blot (WB). DNA sequencing showed that the ORF-K1 recombinant vectors corresponds to the prototype sequences deposited from PEL cell lines. WB demonstrated the presence of K1 in the lysate of HEK293 transfected cells. Analysis of the K1 amino acid sequence encoded in the vectors revealed that ITAM domain of K1 (genotype B) has distinct amino acids from the ones in the ITAM domain of K1 (genotypes A and C). Therefore ORF-K1 recombinant vectors were produced and validated, and will be useful to establish an experimental model for analysis of the biological properties of the K1 protein / Mestre

nÃo hà / Annona muricata, conhecida popularmente como gravioleira, à uma planta usada amplamente na medicina popular na forma de chÃs e infusÃes para o tratamento de diversas doenÃas, como o cÃncer. O objetivo deste trabalho foi avaliar a citotoxicidade e a atividade antitumoral do extrato acetÃnico das sementes de Annona muricata. O presente estudo foi realizado frente a um painel de 4 linhagens de cÃlulas tumorais, as cÃlulas HL-60, HCT-116, SF-295 e OVCAR-8 obtiveram os valores de IC50 0,1944Âg/mL, 0,1488Âg/mL, 0,0601Âg/mL e 0,0987 Âg/mL respectivamente. Na anÃlise frente a eritrÃcitos de camundongos obtivemos a IC50 de 9,23Âg/mL. O estudo de toxicidade aguda foi realizado in vivo e a DL50 foi de 310,2 mg/kg. O estudo da atividade hemolÃtica foi feita utilizando suspensÃo de eritrÃcitos de camundongos nÃo causando lise. O estudo da avaliaÃÃo antitumoral nas doses (7,5; 15 e 30mg/kg/dia por via oral) em camundongos transplantados com Sarcoma 180 revelou atividade em todas as doses, causando uma reduÃÃo de 48,41% do crescimento tumoral na maior dose. As anÃlises do fÃgado e rins revelaram que houve algumas alteraÃÃes no fÃgado, como esteatose e necrose focal sugerindo toxicidade hepÃtica nos camundongos tratados com o extrato acetÃnico das sementes da Annona muricata. Essas alteraÃÃes sÃo, entretanto, consideradas de possÃvel reversÃo do tecido com a descontinuidade do tratamento ou adequaÃÃo da dose. As anÃlises bioquÃmicas, revelaram um aumento nos nÃveis sÃricos da creatinina nas doses de 15 e 30 mg/kg/dia. Nos testes hematolÃgicos nÃo houve alteraÃÃes nos grupos tratados com o extrato acetÃnico das sementes da Annona muricata. Os resultados mostraram poucas alteraÃÃes dos animais nos parÃmetros fÃsicos, bioquÃmicos e hematolÃgicos, mostrando que o extrato à bem tolerado e pouco tÃxico. / Annona muricata, popularly known as soursop, is a plant widely used in folk medicine as teas and infusions for the treatment of various diseases such as cancer. The aim of this study was to cytotoxicity evaluate the antitumor activity of the acetone extract of the seeds of Annona muricata. This study was conducted with a panel of four tumor cell lines, HL-60 cells, HCT-116, SF-295 and OVCAR-8 IC50 values obtained 0.1944 Âg/ ml, 0.1488 Âg/mL, 0.0601 Âg/mL and 0.0987 Âg/mL, respectively. In the analysis across from erythrocytes of mice obtained the IC50 of 9.23 Âg/mL. The acute toxicity study was conducted in vivo and DL50 was 310.2 mg/kg. The study of hemolytic activity was performed using cell suspension from mice without causing lysis. The evaluation study antitumor doses (7.5, 15 and 30mg/kg/day orally) in mice transplanted with Sarcoma 180 showed activity at all doses, causing a reduction of 48.41% of tumor growth at the highest dose . Analyses of liver and kidney revealed that there were some changes in the liver, such as steatosis and focal necrosis suggesting liver toxicity in mice treated with acetone extract of the seeds of Annona muricata. These changes are, however, considered the possible reversal of the tissue with treatment discontinuation or dose adjustment. Biochemical analysis revealed an increase in serum creatinine at doses of 15 and 30 mg/kg/day. In haematological tests there were no changes in the groups treated with acetone extract of the seeds of Annona muricata. The results showed little change in physical parameters of the animal, biochemical and hematological showing that the extract is well tolerated and less toxic

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Annona muricata, conhecida popularmente como gravioleira no Brasil, à uma planta usada amplamente na medicina popular na forma de chÃs e infusÃes para o tratamento de diversas doenÃas, incluindo o cÃncer. O trabalho teve como objetivo avaliar o perfil toxicolÃgico, genotoxicolÃgico e antitumoral do extrato acetÃnico das folhas de Annona muricata e foi realizado utilizando ensaios de curta e longa duraÃÃo in vivo e in vitro. Inicialmente foi avaliada a citotoxicidade in vitro contra vÃrias linhagens tumorais humanas, havendo resposta tÃxica a muitas delas, principalmente K-562, HCT-8, HCT-116 e SF-295 com concentraÃÃo inibitÃria mÃdia (CI50) de 0,1452 Âg/mL, 0,2457 Âg/mL, 0,2956 Âg/mL e 0,2191 Âg/mL respectivamente. Os estudos de toxicidade aguda foram realizados in vivo e a dose letal mÃdia (DL50) foi de 310,2 mg/Kg. Os estudos de toxicidade crÃnica foram realizados utilizando-se as doses 12,5 mg/Kg, 25 mg/Kg e 50 mg/Kg do extrato acetÃnico. Os resultados mostraram poucas alteraÃÃes nos animais nos parÃmetros fisiolÃgicos, bioquÃmicos e hematolÃgicos, mostrando que o extrato à bem tolerado e pouco tÃxico. Os estudos de genotoxicidade foram realizados in vivo. Os animais foram tratados, por via oral, com trÃs doses do extrato acetÃnico (12,5 mg/Kg, 25 mg/Kg e 50 mg/Kg). ApÃs 24 h e 48 h, o sangue perifÃrico e a medula Ãssea foram coletados. No ensaio do cometa nÃo houve detecÃÃo de nenhum cometa de grau elevado, sendo as doses testadas estatisticamente semelhantes ao controle negativo. No ensaio do micronÃcleo, todas as doses testadas do extrato acetÃnico nÃo induziram a formaÃÃo de micronÃcleos, sendo semelhantes estatisticamente em relaÃÃo ao controle negativo, ao contrÃrio do observado no controle positivo. Os ensaios antitumorais mostraram que o extrato apresenta atividade inibidora do crescimento tumoral, tanto em ratos, no modelo do carcinossarcoma de Walker 256, como em camundongos, no modelo Sarcoma 180. Todos esses resultados indicam que o extrato acetÃnico das folhas de Annona muricata apresenta poucas aÃÃes tÃxicas e significante atividade inibidora do crescimento tumoral nos modelos testados / Annona muricata, popularly known as soursop in Brazil, is a plant widely used in vernacular medicine as teas and infusions for the treatment of various diseases, including cancer. This study aimed to evaluate the toxicological, genotoxicological and antitumor profile of the acetone extract from the leaves of Annona muricata and test it using short-and long-term in vivo and in vitro assays. We initially assessed in vitro cytotoxicity against several human tumor cell lines. There was a toxic response to many of them, especially K-562, HCT-8, HCT-116 and SF-295 with average inhibitory concentration (IC50) of 0.1452 Âg/mL, 0.2457 Âg/mL, 0.2956 Âg/ml and 0.2191 Âg/mL respectively. Acute toxicity studies were performed in vivo and the average lethal dose (LD50) was 310.2 mg/kg. Chronic toxicity studies were performed using doses of 12.5 mg/kg, 25 mg/kg and 50 mg/kg of acetone extract. Results showed little change in animalsâ physical, biochemical and hematological parameters, showing that the extract is well tolerated and not very toxic. Genotoxicity studies were performed in vivo. Animals were given three oral doses of the acetone extract (12.5 mg/kg, 25 mg/kg and 50 mg/kg). After 24 and 48 hours peripheral blood and bone marrow were collected. In the comet assay no high grade comet was detected and tested doses were statistically similar to the negative control. In the micronucleus test, none of the tested acetone extract doses induced the formation of micronuclei. They were statistically similar to the negative control, unlike what was observed in the positive control. Antitumor testing showed that the extract has tumor growth inhibitory activity, both in rats, in the Walker 256 carcinosarcoma model, and in mice, in the Sarcoma 180 model. All such results indicate that the acetone extract from the leaves of Annona muricata has little toxic action and significant activity inhibiting tumor growth in the models we tested.