O principal objetivo dos experimentos apresentados nesta tese foi investigar o envolvimento dos receptores do peptídeo liberador de gastrina (GRPRs) hipocampais nos processos de extinção e reconsolidação da memória e em um modelo de amnésia associado à doença de Alzheimer. No Capítulo I foram avaliados os efeitos do bloqueio do GRPR na extinção da memória aversiva. Ratos Wistar machos foram treinados na tarefa de esquiva inibitória e retornaram repetidamente ao contexto da sessão de treino sem choque durante três dias seguidos. A infusão no hipocampo dorsal de um antagonista dos GRPRs ou anisomicina, inibidor da síntese protéica, imediatamente após a primeira sessão de teste inibiram a extinção da memória. Estas drogas não tiveram o mesmo desempenho nas sessões subseqüentes quando a primeira sessão da extinção (primeiro dia após o treinamento) foi omitida. Os resultados indicam que os GRPRs estão envolvidos na extinção da memória motivada por medo no hipocampo.No Capítulo II foi avaliado o possível papel do GRPR e do receptor de glutamato do tipo N-metil-D-aspartato (NMDAR) em processos associados à reconsolidação da memória. Os resultados mostraram que a inativação de GRPR pelo antagonista RC-3095 ou de NMDARs hipocampais pelo antagonista ácido aminofosfonopentanoico (AP5), após a reativação da memória, prejudica temporariamente a retenção. Entretanto, o prejuízo da memória induzido por RC-3095 ou AP5 pós-reativação foi transitório e voltou aos níveis dos ratos-controle em um teste subseqüente 3 dias após o treino. O efeito das drogas se deu apenas após a reativação da memória, e não na ausência da mesma. Estes resultados fornecem a primeira evidência que a inativação de GRPR após areativação pode prejudicar a memória. No Capítulo III nós investigamos o efeito da ativação dos GRPRs em um modelo de amnésia associado à doença de Alzheimer. Os ratos receberam infusão bilateral de bombesina, agonista GRPR, ou salina 10 min antes do treino na tarefa de esquiva inibitória, e peptídeo β-amilóide (25-35) ou água destilada imediatamente após o treino. A infusão intrahipocampal pós-treino do peptídeo β-amilóide (25-35) induziu um prejuízo significativo na retenção da memória na tarefa de esquiva inibitória. A infusão pré-treino de bombesina previniu o prejuízo da retenção da memória induzido pelo peptídeo β-amilóide (25-35). O resultado indica que os agonistas de GRPR podem previnir os prejuízos da memória causados pelo peptídeo β-amilóide (25-35) no hipocampo. / The main purpose of the research presented in this thesis was to evaluate the involvement of hippocampal gastrin-releasing peptide receptors (GRPRs) in extinction and reconsolidation of fear memory, as well as the effects of GRPR activation in a rat model of memory dysfunction associated with Alzheimer’s disease (AD). In Chapter 1, we evaluated the possible involvement of the GRPR in extinction of memory for aversive training. Male Wistar rats were trained in inhibitory avoidance (IA) conditioning and then returned repeatedly to the training context without shock on a daily basis for 3 days. Infusion of the GRPR antagonist RC-3095 or the protein synthesis inhibitor anisomycin into the CA1 area of the dorsal hippocampus immediately after the first extinction session blocked extinction. These drugs did not affect performance in subsequent sessions when the first extinction session (1 day after training) was omitted.The results provide the first evidence that hippocampal GRPRs are involved in memory extinction. In Chapter 2, we evaluated the possible role of hippocampal GRPRs and glutamate N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) in reconsolidation-like processes. We show that inactivation of hippocampal GRPRs or NMDARs after memory reactivation temporarily disrupts retention of IA memory.Post-retrieval intrahippocampal infusion of the GRPR antagonist RC-3095 or the NMDAR antagonist aminophosphonopentanoic acid (AP5) produced an impairment of IA performance tested 2 days after training in rats. However, the memory impairment induced by postretrieval RC-3095 or AP5 was transient and recovered to levels of control rats in a subsequent test 3 days after training. The drug effects were only present after memory reactivation and not in the absence of reactivation. The findings provide the firstevidence that GRPR inactivation after memory retrieval can impair memory. In Chapter 3, we verified whether GRPR activation would affect IA memory retention in a rat model of memory dysfunction associated with AD. Rats were given bilateral infusions of the GRPR agonist bombesin or saline 10 min before IA training, and β-amyloid peptide (25- 35) or distilled water immediately after training. Posttraining intrahippocampal infusion of β-amyloid peptide (25-35) induced a significant impairment of IA retention. Pretraining infusion of an otherwise ineffective dose of bombesin prevented the β-amyloid peptide (25-35)-induced retention impairment. The result indicates that GRPR agonists can prevent memory impairments elicited by β-amyloid peptide (25-35) in the hippocampus.

O aminoácido glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do SNC de mamíferos e participa de funções importantes como cognição, memória, aprendizagem e plasticidade neuronal. Porém, excessiva estimulação dos receptores glutamatérgicos pode resultar em morte celular, processo este denominado excitotoxicidade e que está associado à processos neurodegenerativos. A remoção do glutamato da fenda sináptica, que ocorre através de transportadores dependentes de sódio de alta afinidade, localizados principalmente nos astrócitos, é o principal mecanismo modulatório das ações glutamatérgicas e responsável pela manutenção de concentrações extracelulares abaixo dos níveis neurotóxicos. O Ácido quinolínico (AQ), um agonista NMDA, é uma potente neurotoxina endógena, cujo acúmulo no cérebro parece estar envolvido na etiopatologia das convulsões. Entretanto, apesar do seu envolvimento em muitas doenças, os mecanismos moleculares e danos cerebrais ainda não são perfeitamente elucidados. Os derivados da guanina com funções extracelulares, sejam os nucleotídeos GTP, GDP ou GMP, e o nucleosídeo guanosina mostraram exercer ações tróficas em células neurais, bem como modular o sistema glutamatérgico. Os resultados demonstram que vários sistemas de transporte de glutamato são afetados pela ação do ácido quinolínico, e que os nucleotídeos da guanina podem exercer ação modulatória destas respostas. Nos estudos in vitro, o AQ estimulou a liberação de glutamato em sinaptossomas e inibiu a captação de glutamato por astrócitos. Observou-se ainda que o AQ inibiu a captação vesicular de glutamato, porém os nucleotídeos da guanina foram capazes de prevenir esta inibição, indicando uma possível modulação neste tranportador. Nos estudos in vivo, usando um modelo experimental de indução de convulsão por AQ, observou-se que a liberação sinaptossomal glutamatérgica também está estimulada, porém este efeito foi completamente abolido pela guanosina, quando este nucleosídeo foi capaz de prevenir a convulsão. AQ também estimula a captação vesicular de glutamato e inibe a captação vesicular de GABA; da mesma forma, os nucleotídeos da guanina exercem seus efeitos modulatórios, já que tanto a inibição quanto o aumento de captação retornaram aos níveis do controle quando houve prevenção da convulsão. Adicionalmente, estas alterações na captação vesicular de glutamato parecem ser relacionadas ao AQ, já que em outros modelos (picrotoxina, cainato, cafeína, PTZ ou eletrochoque transcorneal) não foram observadas alterações. Nossos resultados sugerem que os nucleotídeos da guanina exercem importante função como neuromoduladores e ainda neuroprotetores. / Glutamate is the main excitatory neurotransmitter in mammalian CNS, involved in processes such as plasticity, learning and memory, and neural development. However, an excessive glutamate receptors activation can induce intracellular events which lead to the neural death through excitotoxic events, wich are associated to the etiology of neuodegeneratives disorders. The removal of glutamate from the synaptic cleft, which occurs by high affinity of sodium-dependent transporters, located mainly in astrocyte membranes, is the major mechanism for modulating of glutamate actions, responsible for maintaining its extracellular concentrations below neurotoxic levels. Quinolinic acid (QA), an NMDA agonist, is a potent endogenous neurotoxin. Accumulation of QA in the brain seems to be involved in the ethiopatogeny of convulsions. However, in spite of its involvement in many diseases, the molecular mechanisms linking QA and brain damage are far from understood. Extracellular guanine-based purines (GBPs), namely the nucleotides GTP, GDP, GMP and the nucleoside guanosine have been shown to exert trophic effects on neural cells, as well as to modulate of the glutamatergic system. The results demonstrate that various systems of glutamate transport are affected by action of QA, and guanine nucleotides exert modulatory effect. In in vitro studies, QA stimulates glutamate release in synaptosomes and inhibits the glutamato uptake by astrocytes. We observed that QA inhibits glutamate vesicular uptake, however guanine nucleotides prevent this inhibition, indicating a possible modulation of this transporter. In in vivo studies, using a experimental model of QA-induced seizures, we observed that synaptosomal glutamate release is stimulated, and this effect was completely abolished by guanosina. QA stimulates the glutamate uptake and inhibits the GABA uptake, and guanine nucleotides exert modulatory effect, because both effects are abolished when animals not displaying seizures. Additionally, this alterations in vesicular glutamate uptake appears are related with QA, because in other models of seizure (picrotoxin, kainate, caffeine, PTZ or maximal transcorneal electroshock) we do not observed any alterations. Our results suggest that guanine nucleotides exert an important role as neuromodulators and neuroprotectors.

Diversos trabalhos têm relacionado a fisiopatogenia da acidemia glutárica tipo I (GA I) com a excitotoxicidade glutamatérgica. Ainda que sob intenso debate, a maioria desses trabalhos se baseia na semelhança estrutural existente entre o glutamato e os principais ácidos orgânicos acumulados na GA I, os ácidos glutárico (GA) e 3-hidroxiglutárico (3-OHGA). Tendo em vista a janela de vulnerabilidade cerebral dos pacientes afetados pela GA I durante os primeiros anos de vida e o distinto padrão de expressão e propriedades de receptores e transportadores glutamatérgicos ao longo do desenvolvimento, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos dos ácidos GA e 3-OHGA sobre a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática e sobre a captação de glutamato por fatias e preparações sinaptossomais de córtex cerebral e estriado de ratos de 7 a 60 dias de vida. Nossos resultados demonstraram que o 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Observamos ainda que esse ácido parece interagir com receptores do tipo NMDA, agindo como um fraco agonista desses receptores por aumentar a ligação de MK-801 em receptores de membrana e o influxo de Ca2+ em fatias de córtex cerebral de ratos. Através do estudo ontogenético da ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática de ratos na presença de GA e 3-OHGA, verificamos que o GA inibe a ligação de glutamato a seus receptores de membrana em córtex cerebral e estriado de ratos de 7 e 15 dias de vida. A utilização de antagonistas glutamatérgicos juntamente com a inibição da ligação de cainato a seus receptores na presença de GA indicaram que os efeitos desse ácido sobre a ligação de glutamato a seus receptores parecem envolver receptores do tipo não- NMDA, possivelmente do tipo cainato. O ácido 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato somente a transportadores de membrana de estriado de ratos de 7 dias de vida. Os estudos de captação de glutamato mostraram que o GA inibe o transporte desse neurotransmissor apenas em fatias de córtex cerebral de ratos de 7 dias de vida. Esse efeito não foi devido à morte celular e foi prevenido por pré-administração de N-acetilcisteína sugerindo o envolvimento de dano oxidativo na presença do GA. Além disso, o efeito do GA parece envolver os transportadores glutamatérgicos do tipo GLAST, expressos nos estágios iniciais de desenvolvimento cerebral. Em contraste, o ácido 3-OHGA não afetou a captação de glutamato por fatias de córtex cerebral e estriado de ratos. Observamos também que os ácidos GA e 3-OHGA não afetaram a captação de glutamato por preparações sinaptossomais de cérebro de ratos. Os efeitos detectados no presente estudo pelos ácidos GA e 3-OHGA em períodos específicos do desenvolvimento e também nas distintas estruturas cerebrais estudadas podem estar relacionados com a expressão diferenciada de receptores e transportadores glutamatérgicos no cérebro de ratos. Apesar de não explicarem a janela de vulnerabilidade estriatal, tais resultados podem auxiliar na elucidação dos mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no dano neurológico ocorrido durante os primeiros anos de vida dos pacientes com GA I. / The role of excitotoxicity in the cerebral damage of glutaric acidemia type I (GA I) is under intense debate. Several studies relate the excitotoxic actions of the major metabolites accumulating in GA I, glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric acids (3-OHGA), based on the chemical structural similarity between these organic acids and glutamate. Considering that GA I patients present a window of cerebral vulnerability during the first years of life and the variable ontogenetic pattern of glutamate receptors and transporters expression and properties, the objective of the present work was to investigate the effects of GA and 3-OHGA on glutamate binding to receptors and transporters from synaptic plasma membranes and on glutamate uptake by slices and synaptosomal preparations from cerebral cortex and striatum during rat brain development. Our results demonstrated that 3-OHGA inhibited glutamate binding to receptors and transporters from plasma membranes of cerebral cortex of 30-day-old rats. Moreover, its effect on glutamate receptors seems to be directed towards NMDA receptors and suggests that 3-OHGA acts as a weak agonist of these receptors by increasing the MK-801 binding to membrane receptors and Ca2+ influx into cerebral cortex slices of rats. The ontogenetic study of glutamate binding to receptors and transporters in the presence of GA and 3- OHGA revealed that GA decreased the glutamate binding to receptors from plasma membranes of cerebral cortex and striatum of 7- and 15-day-old rats. In addition, by using glutamate antagonists and kainate binding assay, we verified that this effect involved non-NMDA receptors, probably kainate receptors. On the other hand, 3-OHGA inhibited glutamate binding to transporters from plasma membranes of striatum of 7-day-old rats. The glutamate uptake studies showed that GA decreased glutamate transport only in cerebral cortex slices of 7-day-old rats. Furthermore, this effect was not due to cellular death and was prevented by N-acetylcysteine preadministration suggesting the involvement of oxidative damage. Moreover, immunoblot analysis and glutamate uptake assays in the presence of GA and dihydrokainate (DHK) revealed that GA effect seems to involve GLAST transporters, which are expressed in early stages of rat brain development. In contrast, 3-OHGA did not affect glutamate uptake by brain slices. We also observed that both GA and 3-OHGA did not affect glutamate uptake by synaptosomal preparations from rat brain. Concluding, the effects provoked by GA and 3-OHGA at specific ages of development and also in distinct cerebral structures may possibly be explained by the differential ontogenetic and regional specific expression of the glutamate receptors and transporters in rat brain. Although these results can not explain the window of striatal vulnerability, they may contribute to elucidate the mechanisms of the neurological damage occurred during the first years of life in GA I patients.

O estudo de metodologias que possibilitem o acesso de moléculas terapêuticas ao cérebro evitando a barreira hematoencefálica (blood-brain barrier, BBB), é extremamente importante para o tratamento das doenças que afetam o sistema nervoso central. Os estudos se concentram na busca por vias seguras e pouco invasivas. Recentemente a via nasal tem mostrado resultados positivos na administração de fármacos ao sistema nervoso central de maneira segura, sugerindo a utilização desta via para a terapia gênica. Neste trabalho, foi estudada a administração intranasal de um vetor não viral, que codifica o gene da proteína verde fluorescente otimizada (enhanced green fluorescent proten, EGFP), diluído em água ou em solução de sulfato de zinco em camundongos adultos da linhagem BALB/c. Os resultados de RT-PCR mostraram que o vetor atingiu o cérebro em ambos tratamentos, e sua expressão foi mantida até 8 semanas após o tratamento. A expressão da EGPF em diferentes regiões cerebrais foi analisada 1, 2, 4 e 8 semanas após o tratamento, através de imunohistoquímica. Nossos resultados mostraram que um número muito pequeno de células foi transfectado em ambos tratamentos e que a freqüência destas células nas regiões cerebrais estudadas varia muito mesmo entre animais do mesmo grupo. O tratamento com sulfato de zinco não aumentou a eficiência do vetor. Os maiores números de células transfectadas encontradas foram no bulbo olfatório e hipocampos uma semana após o tratamento. Nossos resultados mostram pela primeira vez a expressão prolongada de um gene administrados pela via nasal no cérebro. / The investigation of methods that allow the access of therapeutic molecules to the brain, overcoming the blood-brain barrier (BBB), is of great importance for the treatment of diseases reaching the central nervous system. Studies concentrate mainly on the search for safer and less aggressive routes. Recent studies have suggested that pharmaceutical agents can reach the brain by the nasal route, that may thus be also appropriate for gene therapy. Here, we investigated brain targeting by intranasal administration of a plasmid vector (pREGFP) with the reporter gene EGFP, diluted in water or in a zinc sulfate/water solution, to adult BALB/c mice. Brain regions were examined by RT-PCR or immunohistochemistry 1, 2, 4 or 8 weeks after the treatment. RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly with the two types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and maintained even 8 weeks after treatment. Brain sections submitted to immunohistochemistry (IHC) were analyzed for the detection of EGFP-positive cells, that could be observed in brain samples from mice treated by intranasal administration of pREGFP. The frequency of EGFP-positive cells was very low, and presented great variation even among mice from the same experimental group. The supplementation of the transfection medium with zinc sulfate did not induce higher numbers of EGFP-positive cells. A higher frequency of these cells was observed in the olfactory bulb one week after treatment, and in the hippocampus as compared to other brain regions. Our results show for the first time the long-term expression of a gene carried by a nonviral vector to the central nervous system.

A terapia celular utilizando células tronco mesenquimais (MSC) derivadas da medula óssea surge como uma alternativa para o tratamento das doenças neurodegenerativas. Apesar dos resultados positivos com o uso dessas células nos ensaios pré-clínicos e clínicos após a isquemia cerebral, seus efeitos colaterais e seu mecanismo de ação permanecem desconhecidos. Os benefícios alcançados após a terapia celular para o tratamento da isquemia não são atribuídos à diferenciação dessas células em novos neurônios, mas sim aos fatores que elas podem secretar. Na tentativa de compreender como os fatores secretados pelas MSC podem influenciar o tecido hipocampal que sofreu ou não privação de oxigênio e glicose (POG) e como os fatores liberados pelo tecido lesionado podem atuar sobre as MSC, nós utilizamos culturas organotípicas de hipocampo expostas ao meio condicionado pelas MSC e MSC expostas ao meio condicionado pelas culturas organotípicas de hipocampo expostas à POG. Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que o meio condicionado pelas MSC é tóxico para as culturas organotípicas de hipocampo, induzindo morte celular especificamente nas regiões do Corno de Ammon (CA) e agravando a lesão causada pela POG. Essa toxicidade parece ser específica das MSC, uma vez que o meio condicionado por outros tipos celulares não tem o mesmo efeito. As MSC isoladas tanto de rato como de camundongo e tanto de medula óssea como de pulmão induzem a morte celular de uma maneira semelhante, sugerindo que o efeito não é espécie ou órgão específico. Ainda, nós observamos que os fatores secretados pelas MSC ativam a microglia e os astrócitos, induzindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da iNOS e um aumento de IL-6 e TNFα nas culturas organotípicas. O efeito tóxico do meio condicionado pelas MSC pode ser atenuado por antioxidantes, anti-inflamatórios, antagonistas NMDA e AMPA, bloqueadores de canal de cálcio dependentes de voltagem e por agonista GABA. Quando as MSC foram analisadas após a sua exposição ao meio condicionado pelo tecido hipocampal lesionado, nós não observamos morte celular ou mudanças morfológicas aparentes nessas células após 24 h de exposição ao meio. Surpreendentemente, as MSC aumentaram a proliferação quando expostas ao meio condicionado pelo hipocampo lesionado, não apresentando nenhum marcador neural após 72 h em contato com esse meio condicionado. Em conjunto, nossos resultados mostram um possível efeito adverso de fatores secretados pelas MSC, introduzindo uma nota de cautela na utilização dessas células. / Cell therapy using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) seems to be a new alternative for the treatment of neurodegenerative diseases. In spite of several good and promising results with the use of these cells in preclinical and clinical studies after stroke, their side effects and their mechanism of action are still unknown. The benefits reached after cell therapy to treat stroke are not attributed to the differentiation of the cells in new neurons, but to the factors that these cells can secrete. In an attempt to understand how MSC secreted factors can influence the hippocampal tissue that suffer or not from oxygen and glucose deprivation (OGD) and how the factors secreted from the injured hippocampus can influence MSC behavior, we used organotypic hippocampal slice cultures exposed to MSC conditioned medium and MSC exposed to organotypic hippocampal cultures conditioned medium. The results obtained in this work show that MSC conditioned medium is toxic to organotypic hippocampal slice cultures, inducing cell death specifically in the CA (Cornus Ammonis) region of hippocampus and aggravating the lesion induced by OGD. This toxicity seems to be specific to MSC, once the medium conditioned by other cell types do not induce cell death. Also, MSC isolated from rat or mice and from bone marrow and lungs induce cell death in a similar manner, suggesting that the effect is not organ- or specie- specific. In addition, we have observed that MSC secreted factors activate microglia and astrocytes, inducing reative oxygem species (ROS) generation and iNOS, TNFα and IL-6 increase in organotypic cultures. The MSC conditioned medium-induced toxic effect can be attenuated by antioxidants, antiinflammatory drugs, NMDA and AMPA antagonists, Ca2+ voltage-dependent channel blockers and GABA agonist. When MSC behavior was investigated after these cells were exposed to the conditioned medium from the lesioned hippocampus, we observed that these medium is not able to induce cell death or any apparent change in MSC morphology after a 24 h exposure period. Surprinsingly, MSC increase proliferation in response to the conditioned medium from the injured hippocampal tissue, do not presenting any neural marker after 72 h of contact with this medium. Taken together, our results show a possible side effect of MSC secreted factors, introducing a note of caution in the use of these cells.

Foi proposto que animais submetidos a estresse crônico mostram uma resposta ao estresse que pode ser reduzida pela ingestão de alimentos palatáveis (“comfort foods”). No entanto, uma dieta saborosa, rica em açúcar ou gordura, também pode levar a dano oxidativo e lesão neuronal. Assim, o objetivo deste estudo é verificar, em ratos machos e fêmeas, os efeitos da exposição crônica ao estresse durante o acesso livre a ração padrão e a uma dieta altamente palatável sobre o comportamento exploratório, a memória espacial e a ansiedade, bem como o estresse oxidativo e quebras do ADN em duas estruturas do sistema nervoso, hipocampo e estriado. Ratos Wistar machos e fêmeas foram submetidos ao estresse de contenção por 40 dias. A dieta era ração padrão e chocolate ad libitum. O estresse crônico induziu um comportamento do tipo ansioso em ratas fêmeas e o consumo de uma dieta palatável aumentou a atividade locomotora; uma interação também foi observada entre a dieta e estresse, pois a dieta preveniu, ao menos em parte, os efeitos do estresse sobre o comportamento nas fêmeas. Nos ratos machos, a dieta mostrou um efeito facilitador na memória espacial em dias de treinamento. Os resultados também mostraram que o estresse e a dieta induziram aumento no índice de quebras de ADN e um desequilíbrio na atividade de enzimas antioxidantes, catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD), nas estruturas estudadas em ambos os sexos, além da perturbação na produção de óxido nítrico, especialmente no hipocampo de ratos machos. Medidas de estresse oxidativo no hipocampo dos ratos machos mostraram que a dieta palatável diminuiu a atividade das enzimas GPx, CAT e da razão SOD:CAT. O estresse crônico mostrou uma tendência em aumentar a produção de óxido nítrico enquanto que a dieta diminuiu. Nas fêmeas, a exposição ao estresse crônico diminuiu a atividade da SOD e a dieta aumentou o potencial antioxidante reativo total (TRAP). Na exposição ao estresse agudo, foi observado, no hipocampo dos ratos machos, que o estresse agudo aumentou as quebras de ADN e houve uma tendência de aumentar a atividade da SOD, enquanto que a dieta palatável diminuiu a atividade desta enzima. Concluindo, observou-se que ratas fêmeas parecem ter maior susceptibilidade aos efeitos do estresse, e que o acesso a uma dieta palatável foi capaz de neutralizar alguns efeitos comportamentais do estresse. No entanto, esta mesma dieta induziu um aumento do estresse oxidativo e de quebras do ADN, especialmente nos machos. Além disso, uma única exposição ao estresse por contenção apresentou, no hipocampo de ratos machos, aumento nas quebras de ADN e a dieta induziu alterações na atividade de enzimas antioxidantes. O estresse por contenção e o consumo de uma dieta palatável induziram um estado de maior susceptibilidade ao estresse oxidativo em diferentes estruturas cerebrais, considerando alterações na atividade das enzimas antioxidantes e nas quebras ao ADN e também na produção de óxido nítrico. / It has been proposed that animals subjected to chronic stress show a stress response that can be reduced by the intake of highly palatable foods (“comfort foods”). However, a palatable diet, rich in sugar or fat, can also lead to oxidative damage and neuronal injury. So, the aim of this study is to verify, in male and female rats, the effects of exposure to chronic stress during free access to regular chow and to a highly palatable diet, on exploratory, spatial memory and anxiety-like behavior, on oxidative stress and on DNA breaks in two structures of the nervous system, hippocampus and striatum. Wistar rats male and female were submitted to restraint stress for 40 days. The diet was standard chow and chocolate, ad libitum. Chronic stress induced anxiety-like behavior in female rats and the consumption of a palatable diet increased the number crossing and an interaction was also observed between diet and stress. In male rats, the diet showed a facilitatory effect on spatial memory on training days. About oxidative stress, the results showed stress- and diet-induced DNA breaks and an imbalance in the activity of antioxidants enzymes, such as CAT, GPx and SOD in the both structures, besides disturbed production of nitric oxide especially in male rats hippocampus. About oxidative stress, in the hippocampus of male rats, the palatable diet decreased GPx, CAT activities and SOD:CAT ratio and chronic stress showed a tendency to increase the production of nitric oxide, while the diet decreased it. In female rats, the exposure to chronic stress decreased SOD activity and diet incresead TRAP. Acute stress increased DNA breaks and showed a tendency to increase SOD activity. In addition, we observed that female rats appear to have higher susceptibility to the stress effects evaluated, and that access to a palatable diet was able to counteract some behavioral effects of stress. However, this same diet induced oxidative stress and increased DNA breaks, especially in males. Furthermore, a single exposure restraint stress showed increased DNA breaks in the hippocampus of male rats. Restraint stress and consumption of a palatable diet induced a state oh higher susceptibility to oxidative stress in different brain structures, considering the altered activities of antioxidant enzymes, production nitric oxide and DNA breaks.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Tecnologia, Departamento de Engenharia Elétrica, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-08-30T16:07:19Z No. of bitstreams: 1 2017_EvandrodaCostaOliveiraJúnior.pdf: 5134963 bytes, checksum: 8c5b5d63cf2bc1c8b391810d495254a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-20T17:49:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_EvandrodaCostaOliveiraJúnior.pdf: 5134963 bytes, checksum: 8c5b5d63cf2bc1c8b391810d495254a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-20T17:49:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_EvandrodaCostaOliveiraJúnior.pdf: 5134963 bytes, checksum: 8c5b5d63cf2bc1c8b391810d495254a4 (MD5) Previous issue date: 2017-09-20 / O processo de envelhecimento leva a diversas mudanças no organismo humano, inclusive na modulação do sistema nervoso autônomo (SNA). Neste estudo, foram calculados índices de variabilidade da frequência cardíaca (VFC), sensibilidade do barorreflexo (BRS) e arritmia sinusal respiratória (RSA) por meio do processamento de sinais de eletrocardiograma, pressão arterial e respiração, nos domínios da frequência e do tempo. O indicador da VFC foi estimado no domínio da frequência por meio da densidade espectral de potência (DEP) dos intervalos R-R (IRR), resultantes do sinal de eletrocardiograma, para as altas e baixas frequências. Os índices de BRS foram obtidos por intermédio da relação entre os espectros dos sinais de IRR e pressão arterial sistólica (PAS) e pela associação entre os sinais de IRR e PAS na função de resposta em frequência (FRF). Os índices espectrais da BRS foram obtidos também usando coerência entre os sinais e com a média das regiões de alta e baixa frequência (índice ). O método da sequência foi usado para obter índices temporais da BRS, assim como, o método da resposta ao impulso (RI), que é um método que utiliza o modelo autorregressivo com entrada exógena (ARX) e permite obter a resposta ao impulso entre os sinais de PAS e IRR. O indicador da RSA foi obtido de forma semelhante ao da BRS, em que foram utilizadas a DEP e FRF para produzir os índices espectrais e a resposta ao impulso para obter os índices temporais, sendo utilizadas as relações entre os sinais de IRR e volume pulmonar instantâneo (VPI). Foram usados dados de indivíduos jovens e idosos saudáveis da base de dados Fantasia do Physionet. A base contém dados de eletrocardiograma e respiração de 40 voluntários, sendo 20 jovens entre 21 e 34 anos, e 20 idosos entre 68 e 85. O dado de pressão arterial existe para metade do grupo. Cada subgrupo (voluntários jovens e idosos) tem um número igual de homens e mulheres. Os sinais dos voluntários foram obtidos em posição supino enquanto assistiam ao filme Fantasia (Disney, 1940) durante o experimento. As análises estatísticas dos índices obtidos mostraram que a VFC é um forte indicador de mudanças no SNA de jovens e idosos, porém apesar dele ser um indicador muito aceito na literatura, ar uma diminuição da BRS de jovens para idosos nas baixas frequências utilizando o método da FFT (P=0,027) e Welch (P=0,012). Mostrando que há uma influência da pressão no sistema. Os mecanismos respiratórios também são afetados com a idade e os resultados da FRF e resposta ao impulso mostraram isso. Os resultados mostraram que os indicadores da FRF nas baixas frequências usando a FFT tiveram P<0,05 e para o método Welch um P=0,0134. Nas altas frequências também foi obtido relevância estatística significativa nos dois métodos com P<0,01. Na análise da magnitude da resposta ao impulso, foi obtido um P=0,003 e para o ganho dinâmico o valor de P=0,008, que são medidas do sistema parassimpático. Com esses resultados, foi possível concluir que o envelhecimento leva a uma atenuação da modulação vagal de indivíduos idosos em comparação a voluntários jovens e apesar de o banco Fantasia já ter sido usado em outros estudos, essa foi a primeira vez do conhecimento do autor, que índices baseados na RI e na FRF foram utilizados nesse banco. / The aging process leads to diverse changes in the human organism, including in autonomic system nervous (SNA) modulation. In this study, indices of heart rate variability (VFC), baroreflex sensitivity (BRS) and respiratory sinus arrhythmia (RSA) were calculated through the processing of electrocardiogram signals, arterial pressure and respiration, in the domains of frequency and time. The VFC indicator was estimated in the frequency domain by means of the spectral density (PSD) of the R-R intervals(IRR), resulting from the electrocardiogram signal, for the high and low frequencies. The indices of BRS were obtained through the relation between the spectrum of IRR and systolic blood pressure (PAS) and the association between the signs of IRR and PAS in the frequency response function (FRF). The spectral indices of the BRS were also obtained using coherence between the signals and the average of the high and low frequency regions (index ). The method of the sequence was used to obtain temporal indices of the BRS, as well as the method of impulse response(RI), which is a method that uses the autorregressive model with input exogenous (ARX) and allows to obtain the impulse response between the signals of PAS and IRR. The RSA indicator was obtained similarly to the BRS indicator, in which DEP and FRF were used to produce spectral indices, and the impulse response for obtaining the temporal indices, in which the relations between IRR signals and instantaneous pulmonary volume (VPI) were used.The data were used for healthy young and elderly subjects from the Fantasia database of Physionet. The database contains electrocardiogram and respiration data of 40 volunteers, 20 young (21 and 34 years old), and 20 elderly (68 and 85 years old) adults. The blood pressure data exists for half the group. Each subgroup (young and elderly volunteers) has an equal number of men and women. The vital signs of the volunteers were obtained in a supine position while watching the film Fantasia (Disney, 1940) during the experiment. The statistical analyses of the indices obtained have shown that the VFC is a strong indicator of changes in the SNA of young and elderly people. Although it is a very accepted indicator in literature, it is not the only indicator capable of making that distinction. It was possible to identify a decrease in the BRS of young adults compared to elderly adults at the low frequencies using the FFT method (P = 0.027) and Welch (P = 0.012), and it was showed that there was a pressure influence on the system. Respiratory mechanisms were also affected by aging, and FRF’s results and impulse response were affected too. The results showed that FRF indicators at low frequencies using FFT had P<0.05, and P=0.0134 for the Welch method. At the high frequencies, it was also obtained significant statistical relevance in the two methods with P<0.01. In the analysis of the magnitude of the response to the impulse, it was obtained P=0.003, and P=0.008 for the dynamic gain, which.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-29T16:37:11Z No. of bitstreams: 1 2017_LucianoPereiraMiranda.pdf: 2374199 bytes, checksum: 2f43e34943de67e2e57c227778ba4f73 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-02-01T18:13:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_LucianoPereiraMiranda.pdf: 2374199 bytes, checksum: 2f43e34943de67e2e57c227778ba4f73 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-01T18:13:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_LucianoPereiraMiranda.pdf: 2374199 bytes, checksum: 2f43e34943de67e2e57c227778ba4f73 (MD5) Previous issue date: 2018-02-01 / O trauma desencadeia uma resposta tecidual organizada envolvendo o sistema nervo central, o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal e o sistema imune. O desenvolvimento das reações de estresse ao trauma determina a magnitude da síndrome de resposta inflamatória sistêmica. São muitos os fatores cirúrgicos e anestésicos que afetam a resposta ao trauma, sendo o controle do fator inflamatório considerado o de maior importância. A resposta imune/inflamatória tem como objetivo preservar a homeostase; entretanto, esta resposta inflamatória pode significar um gatilho para a descompensação do estado fisiológico. Diferentes graus de síndrome da resposta inflamatória sistêmica se desenvolve, determinando alterações clínicas, como edema, hipotensão, delírio, instabilização de placa ateromatosa vulnerável, choque cardiogênico e morte. Logo são necessárias investigações que avaliem alterações na resposta inflamatória e sua aplicabilidade durante o trauma asséptico. A associação de alfa2 agonista à anestesia geral promove o controle da resposta ao trauma por alterar o reflexo neuroinflamatório, a via antinocicepção e a imunomodulação. A dexmedetomidine utilizada como agente anestésico imunomodulador, visando controle da resposta fisiológica ao trauma, pode levar a melhores resultados perioperatório. Esse estudo teve como objetivo avaliar o efeito da administração de dexmedetomidina em associação à anestesia geral em modelo cirúrgico de grande porte, a artrodese de coluna via posterior. Trata-se de ensaio clínico randomizado, duplo cego e placebo controlado com dois grupos de pacientes, grupo intervenção (dexmedetomidina 0,2 - 1 ug/kg/hr) e grupo placebo comparador (solução salina nas mesmas taxas de infusão). Foram coletados 4 amostras de sangue para dosagem de marcadores segundo padrão para o controle imune: Avaliação da liberação das citocinas pró-inflamatórias (IL-1b, Il-6 e TNF-a) e alterações endócrinometabólicas (catecolaminas, cortisol, insulina e glicemia). As alterações cardiovasculares, renais, respiratórias e qualitativas foram avaliadas durante todo período perioperatório através de marcadores séricos (troponina I, creatinoquinase-MB, pró-BNP, cistatina-C, gasometria e leucometria) e alterações clínicas (hemodinâmica, sangramento cirúrgico, débito urinário, qualidade de despertar, escala de sedação Ricker, dor pós-operatória e avaliação qualitativa com questionário QoR40). Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Sarah de Reabilitação em Junho/2016 (n° 50057415.0.0000.0022). Foi observado que a curva de IL-6 apresentou uma amortecimento no grupo intervenção com significânica estatística na manhã do pós-operatório (- 49.3 [58, 108]; p = 0.08) e segundo dia de pós-operatório (- 48.9 [39, 88]; p = 0,135). A produção de leucócitos diminuiu no pósoperatório imediato (- 4886 [ 6646, 11532]; p = 0,0001) e segundo dia (- 648 [ 8960, 9554]; p = 0,04). Em contraste, ocorreu aumento do TNF-α com significância estatística no primeiro dia pós-operatório (+1.19 [6.3,5.1]; p = 0.041). Os demais parâmetros avaliados não apresentaram alterações entre os grupos. Estes resultados confirmam o efeito imunomodulador da dexmedetomidina e foram acompanhados de melhor diurese, taxa de filtração glomerular pela cistatina-C, diminuição do pró-BNP, estabilidade hemodinâmica e diminuição da dor pós-operatória. / The hypothalamus-pituitary-adrenal axis, sympathetic nervous system and immune system crosstalk acts in the initiation and propagation of reactions to trauma distress. Several factors affect the immune response owing to surgery and anesthesia, being the inflammatory factor considered of major importance. The immune / inflammatory response is an evolutionary survival mechanism aimed at preserving salt and water, defense against infections and healing. However, this inflammatory response may means trigger for a chronic basal inflammatory state or the decompensation of a physiological state, determining different degrees of morbidity, such as hypotension, delirium, vulnerable atheromatous plaque instability, cardiogenic shock and death. Regarding the current field, surveys are needed to evaluate the real clinical significance of immune control in the asseptic trauma. In order to blunt the surgical stress response, dexmedetomidine as an immunomodulatory agent plays a way to more effective control to the endocrine-metabolic response, predicate role to better outcomes in patients undergoing to major surgical trauma. The aim of this study is evaluate if the association of dexmedetomidine at general anesthesia standing effective immunomodulatory control to trauma and improve changes at outcomes in patients undergoing to spinal fusion. A randomized double-blind clinical trial was performed to compare two groups, active dexmedetomidine group (dexmedetomidine 0.2 - 1 ug/kg/hr) and placebo comparator (normal saline). Our study was approved by the Ethnic Committee (no 50057415.0.0000.0022) since June of 2016. We started enrolling the patients in July of 2016. In time, we have n = 24 patients. Goals standard to immune control: Measure of proinflammatory cytokines [IL-1beta, IL-6 and TNF-alpha]; changes from baseline of cellular and humoral T-helper cells activity [interferon-gamma and IL-4], and; the endocrine-metabolic changes [cortisol, insulin and glucose] has been collected by arterial line at four times. Outcomes to improve hemodynamic safety and recovery quality is being evaluated and recorded throught all perioperatory. In data analysis, we found an IL-6 curve showing a cushioning of the immune response with statistical significance on the postoperative morning (- 49.3 [58, 108], p = 0.08) and second postoperative day (- 48.9 [39, 88]; p = 0.135). Leukocyte production decreased in the immediate postoperative period (4886 [6646, 11532], p = 0.0001) and second day (-648 [8960, 9554], p = 0.04). In contrast, a significant increase in TNF-α was observed on the first postoperative day (+1.19 [6.3.5.1], p = 0.041). These results confirm the immunomodulatory effect of dexmedetomidine and were accompanied by better diuresis, glomerular filtration rate by cystatin-C, decreased pro-BNP, hemodynamic stability and decreased postoperative pain.

Os nervos periféricos são freqüentemente lesionados por lesão mecânica direta, doenças metabólicas ou tumores. As lesões dos NPs resultam em perda parcial ou total das funções motoras, sensoriais e vegetativas no segmento corporal envolvido. Ratos machos adultos Wistar foram divididos em três grupos: controle (n=7), sham (n=25) e crush (n=25). Todos os grupos foram submetidos à avaliação termográfica, funcional e histológica. A ∆ T do grupo crush foi diferente do grupo controle no 1°, 3°e 7° dia pós-operatório, e do grupo sham no 1°, 3°e 28° dia pós-operatório (p0.05). No grupo crush, a recuperação funcional retornou ao aos valores normais entre a 3ª e 4ª semanas após a lesão, enquanto a análise morfológica do nervo mostrou uma regeneração incompleta na 4ª semana após a lesão. Este estudo é a primeira demonstração que a temperatura da pele é aumentada pela compressão do nervo ciático e esta mudança provavelmente não é correlacionada com a recuperação funcional.

O glutamato, principal neurotransmissor excitatório no sistema nervoso central (SNC), está envolvido em várias funções cerebrais e da retina, como aprendizado/memória, desenvolvimento e envelhecimento cerebral e função visual. No entanto, o aumento da concentração do glutamato na fenda sináptica pode levar a neurotoxicidade. A excitotoxicidade glutamatérgica está relacionada a várias desordens cerebrais, tanto agudas quanto crônicas. Manter o nível de glutamato em concentrações fisiológicas relevantes ao adequado funcionamento do SNC se faz necessário. Para tanto, existem transportadores específicos para o glutamato, responsáveis por controlar os níveis de glutamato na fenda sináptica. Os ácidos graxos essenciais ω3 vêm ganhando especial atenção de pesquisadores por seus efeitos sobre o SNC, tanto responsáveis pelo adequado desenvolvimento e funcionamento cerebral e da retina, quanto por sua ação neuroprotetora frente a patologias relacionadas com a excitotoxicidade glutamatérgica. Na presente tese, nós demonstramos que os ácidos graxos ω3 são importantes para a homeostasia do sistema glutamatérgico tanto no hipocampo quanto na retina de ratos. Uma dieta deficiente em ácidos graxosω3, mantida durante todo o período de desenvolvimento do SNC até a vida adulta, foi capaz de atrasar o desenvolvimento normal das sinapses glutamatérgicas, onde houve uma redução de proteínas sinápticas (NMDA, AMPA e α-CaMKII) no período pós-natal, promovendo alterações comportamentais na vida adulta de ratos, como comportamentos de hiperatividade e ansiedade. Os animais deficientes em ω3 também apresentaram déficits na memória aversiva de longa duração, que foi relacionado com uma baixa interação do receptor NMDA com a proteína cinase Fyn, bem como a redução dos níveis de DHAω3 e BDNF no hipocampo dos ratos. Os ácidos graxos ω3 preveniram as alterações sobre parâmetros do sistema glutamatérgico (queda na captação de glutamato, aumento de transportadores de glutamato GLAST e GLT-1) provocadas por um único evento convulsivo neonatal. Além disso, os animais deficientes em ácidos graxos ω3 apresentaram aumento no conteúdo de GFAP (proteína astrocitária) e redução no conteúdo de NeuN (proteína neuronal) independente do evento convulsivo. Os ácidos graxosω3 também preveniram o déficit de memória de curta duração na vida adulta dos ratos causado pela convulsão 5 neonatal. Na retina de ratos, a deficiência dos ácidos graxos ω3 causou alterações na captação de glutamato e no conteúdo do transportador GLT-1. Após um insulto isquêmico na retina, os animais deficientes em ácidos graxos ω3 apresentaram alterações em parâmetros do sistema glutamatérgico (queda na captação de glutamato, aumento de GLT-1 e EAAC1). Já nos animais que receberam ácidos graxos ω3, o conteúdo de GLT-1 foi maior tanto basal quanto isquêmico, e somente o EAAC1 foi modulado. Nossos resultados mostram a importância dos ácidos graxos ω3 em manter a homeostasia glutamatérgica, contribuindo para o adequado desenvolvimento, funcionamento e proteção do SNC e da retina. / The main excitatory neurotransmitter in central nervous system (CNS), glutamate, is involved in many functions in brain and retina, such as learning / memory, brain and retina development and aging, and visual process. However, increased glutamate concentrations in synaptic cleft could lead to neurotoxicity. Glutamate excitotoxicity was related to many neurological acute and chronic disorders. Keeping glutamate at relevant physiological concentrations to adequate CNS function is necessary. The high affinity glutamate transporters are responsible to maintain glutamate below neurotoxic levels, preventing excitotoxicity. The essential omega-3 fatty acids (ω3) have received attention from scientific community because of its effects on brain development and neuroprotection against pathologies related to glutamatergic excitotoxicity. In the present thesis, we demonstrated that dietary ω3 fatty acids are important for glutamatergic system homeostasis in the hippocampus and retina of rats. A ω3 deficient diet, maintain since gestation until adulthood, was capable to delay the normal glutamatergic synapse development, with a reduction in synaptic proteins (NMDA, AMPA and αCaMKII) in the postnatal period, promoting behavioral alterations in adulthood in rats (hyperactivity and anxiety-like behavior). The deficient animals also presented aversive long-term memory deficit, which was related to reduction in the interaction of NMDA receptor with Fyn kinase protein, as well as in DHA and BDNF hippocampal content in rats. Dietary ω3 fatty acids prevented alterations on glutamatergic system functionality (decrease in glutamate uptake activity, increase in glutamate transporters GLAST and GLT-1 contents) caused by one single neonatal seizures episode. Dietary ω3 fatty acids also prevented aversive short-term memory deficit in adulthood caused by neonatal seizures. In the retina, ω3 deficiency caused decrease in glutamate uptake and reduction in GLT-1 content in basal conditions. After ischemic insult in the retina, ω3 deficient rats presented alteration on parameters of glutamatergic system evaluated (decrease in glutamate uptake activity, increase in GLT-1 and EAAC1 transporters). In ω3 adequate rats, GLT-1 content was higher in basal and ischemic conditions, and only EAAC1 was increase after ischemia. Taking together, our data show the importance of dietary ω3 fatty acids to maintain glutamatergic system homeostasis, contributing to adequate development, function and protection of CNS and retina.