11 |
Analys av huvudkinematik under olyckor i alpina slalomdisciplinen : -med stöd från videoanalysverktygLundin, Ludvig January 2023 (has links)
Huvudskador inom alpin skidsport är bland de allvarligaste skador som kroppen utsätts för. Tidigare studier på huvudskador som genomförts på grenar såsom Störtlopp, Super-G, Storslalom, Skicross, Freestyle och Snowboard visar att standarder som finns på skyddsutrustning inte är tillräckliga. Ännu har ingen videoanalys genomförts på disciplinen Slalom med fokus på huvudets islag med underlaget under olyckor trots att dylika händelser har rapporterats. Certifieringar av hjälmar inom dessa discipliner skiljer sig och har genom åren påverkats av studier och forskning. Detta har resulterat i regeländringar och ökade krav på säkerhetsstandarder satta av Internationella Skidförbundet (FIS). Videoanalyser av olyckstillfällen inom snösport omfattar en hel del antaganden vilket medför problematik för okända variabler då de sker genom rekonstruktioner. De variabler som är kända utnyttjas för att uppskatta dessa okända värden. Denna avhandling syftade till att rekonstruera olyckor i slalomdisciplinen för att undersöka vilka hastigheter som faktiskt uppstår vid huvudkollison mot underlaget, samt därefter utröna eventuella samband mellan utövarens färdhastighet och underlagets lutning. Detta för att möjligen påverka eller upplysa om de faktiska hastigheter som uppstår för att validera de standardiserade certifieringar som idag är stadgade. Resultatet av den här studien visar tendenser på att en minskad lutning på underlaget ger en högre islagshastighet för huvudet mot underlaget. Färdhastigheten enskilt påverkar inte i lika stor uträckning som lutningen men bidrar till att öka islagshastigheten. I ett av de åtta analyserade fallen uppmättes 5,94 m/s, vilket överskred de testkrav för hjälmar satta till 5,42 m/s enligt EN-1007:2007 Klass B skyddscertifiering. / Head injuries in alpine skiing are the most serious injuries exposed to the human body. Previous studies applied to Downhill, Super-G, Giant Slalom, Skicross, Freestyle and Snowboard shows that safety standards on protection equipment may not be enough. In the slalom discipline no such video analysis studies have yet been deployed on head impacts in the Slalom discipline, although several incidents have been reported. Certifications for helmets in the respective disciplines differ and each of them have become influenced by studies and research throughout the years. This has resulted in rule changes and increased standards set by the International Ski Federation (FIS). Video analysis of athletes in snow sports causes problems with unknown variables based on rough reconstruction of past events, which lead to assumptions. To estimate these unknown values known variables play a critical role. This thesis aimed to reconstruct accidents in the slalom discipline to investigate the velocities for head collisions normal to the ground. Hence evaluate the relationship between the athlete’s travel speeds and the slope angle. This is to influence or inform about the speeds that arise to validate the standardized certifications that are currently stipulated. The result of this study shows tendencies that head collisions on lower slope angle results in a higher impact velocity. The travel speed alone does not affect to the same extent as the slope angle, but in combination the effect is to a greater degree. In one of the eight cases the impact velocity exceeded 5,42 m/s for the absorptions test according to EN-1007:2007 Class B certification, the highest measured value was 5,94 m/s. / <p>Betygsdatum 2023-06-07</p>
|
12 |
Automatically Learning Register Automata from MATLAB Code : A case study in autonomous driving / Automatiskt Learning Register Automata från MATLAB Code : En fallstudie i autonom körningDei Rossi, Marco January 2021 (has links)
The successful verification of the behaviour of an Autonomous driving (AD) vehicle is fundamental for the commercialization of this new technology. Formal verification can be used to exhaustively verify the correctness of a system, but it requires a formal model to do so. An exact mathematical definition of the model description of the system is required. Manually defining a model is daunting, error-prone, and intractable for large systems. Automata learning is a branch of Machine learning (ML) that automatically creates a formal model by dynamically interacting with the system. In prior research, automata learning algorithms have been shown to learn a formal model from AD software implemented in MATLAB. However, practical challenges were highlighted in addressing the state-space explosion problem and in obtaining suitable abstractions to deal with large systems. To obtain valuable insights to scale up automata learning for industrial use, this thesis investigates the topic of automatically learning an extended finite automata formalism, called register automata. The SL* algorithm, an extension of the L* algorithm, is used to learn a register automata model of AD software from MATLAB code. The new algorithm creates a register automaton that manages to deal with the data dependencies intrinsically created from the case study between the input variables. Some approximations to the original model were made to obtain the desired solution. The obtained results are presented, from establishing the learning interface, validation of the interface, and from learning the case study. Evidence has been shown that similar problems to those highlighted for DFA learning are encountered. Future works have been discussed to address the same topic and to improve the proposed methodology. / Den framgångsrika verifieringen av beteendet hos ett autonomt körande fordon är grundläggande för kommersialiseringen av denna innovativa teknik. Formella metoder kan förutses som den sista tekniken för att uppnå detta mål. Den exakta matematiska definitionen av modellbeskrivningen för systemet behövs. Tidigare verk kunde inte skapa en metod för att automatiskt beskriva beteendemodellen för SUL. Nuvarande Lateral State Manager varierar komplexiteten som förhindrade användningen av ramverk som LearnLib eller den normala L * -algoritmen. Den stora mängden ingångar och den exponentiella tillväxten av den observerbara tabellen är några av orsakerna som gör att standardalgoritmerna misslyckas. Tidigare löstes problemet delvis och introducerade viss abstraktion till SUL. I denna avhandling föreslår vi en metod baserad på en innovativ algoritm: SL *. Den är utvecklad tack vare förlängningen av LearnLib-ramverket RALib. Den nya algoritmen skapar en registerautomat som klarar av att hantera databeroendet som skapats ur studiens fall. För att få en lösning inom acceptabel tid gjorde vi en ungefärlig tillnärmning till den ursprungliga modellen som vi tror inte påverkar det slutliga resultatet och skapar en modell som kan användas för de ändamål den var tänkt för. / La corretta verifica del comportamento di un veicolo a guida autonoma è fondamentale per la commercializzazione di questa tecnologia. Diversi metodi formali possono essere previsti come una possibile tecnica al fine di raggiungere parte di questo vasto obiettivo. Al fine di utilizzare tali metodi è necessaria l’esatta descrizione matematica del modello comportamentale del sistema. Precedenti studi non sono stati in grado di creare automaticamente un metodo per descrivere il comportamento del sistema sotto esame. Il Lateral State Manager presenta varie complessità che hanno impedito l’uso di framework come LearnLib o dell’algoritmo L_. La grande quantità di input e la crescita esponenziale della tabella delle osservazioni sono alcune delle principali cause che portano i comuni algoritmi al fallimento. In precedenza il problema è stato parzialmente risolto introducendo alcune astrazioni al caso di studio. In questa dissertazione proponiamo un metodo basato su un algoritmo innovativo: SL *. Lo stesso è sviluppato grazie all’estensione del framework LearnLib, chiamato RALib. Il nuovo algoritmo crea degli automi basati sui registri che riescono a gestire la dipendenza tra i dati intrinsecamente creati dal caso di studio. Per ottenere una soluzione in tempi accettabili si sono rese necessarie alcune approssimazioni del modello originale che riteniamo non influiscano sul risultato finale, creando un modello che possa essere utilizzato per gli scopi per cui è stato pensato.
|
13 |
Utvärdering av övervakningsapplikationen DMCG i SL Access / Evaluation of monitor software DMCG in SL AccessFai Yu, Chuen January 2011 (has links)
Syftet med detta examensarbete ”Utvärdering av övervakningsapplikation DMCG i SL Access” är att vara ett underlag för en ny version av programmet. En kartläggning av applikationens uppbyggnad, funktionalitet och gränssnitt gjordes. Synpunkter och förslag från operatörer som använder programmet samlades in och sammanfattas i rapporten.Den nuvarande versionen av programmet har ett antal brister i de tre områdena. Detta presenteras i examensarbetet så att SL kan använda detta för att skriva ett ändringsförslag till leverantören ERG. Flödet för larm från fo-enheterna visas i en schematisk bild. Ett förslag på förändrad uppbyggnad av larmfunktionalitet, övriga funktioner samt gränssnittet presenteras.DMCG är ett verktyg som kommer att användas av personal som övervakar fo-enheterna, Bärbar biljettmaskin, Biljettmaskin (TP5000, bussvarianten och ombudsvarianten), Kortläsaren (CP5000), SL Access biljettautomat samt automatspärrar. Totalt är det över 2000 enheter som skall övervakas. SL Access är tänkt att leva i minst 15 år och mängden enheter medför att existerande funktionalitet behövs ses över för att verktyget blir så optimerat så möjligt.
|
14 |
On Asymptotic Behaviour and Rectangular Band structures in SL(2,R)Wolfgang A.F. Ruppert, Brigitte E. Breckner, Andreas.Cap@esi.ac.at 28 July 2000 (has links)
No description available.
|
15 |
Interdiffusion und Interreaktion in epitaktischen metallischen Schichtsystemen unter dem Einfluß diffusionsinduzierter SpannungenHartung, Frank 21 June 2000 (has links)
No description available.
|
16 |
Version control in engineering design databasesFlorida-James, Barry January 2001 (has links)
This thesis is concerned with lifecycle data support for the design of large made to order products. These products have so many complex functions to perforrn that no one designer will have all of the relevant skills such as in structural design Z): or electrical engineering to produce a comprehensive design. This therefore leads to the utilisation of a team of designers who will not only fulfil logically different design roles but often work at different physical locations. In such a design environment there may be several local models, represented in local Z-- databasesT. hese databases may or may not support versioning either of the data or of the schema which evolves as the product design grows. The interfaces to these databases ID will be varied as they are intended to suit the local needs of the design aIgDe nt. This thesis proposes a model for version control in a desig4nn environment which does not alter the designers existing view. Cý tý A system of distributed co-operatinZg:, aZgD ents is presented whose goal is to manatDg e change and orgCaIDni se version sets in an enrgDin eering environment. The agents are designed for full lifecycle support and inter-operation across heterogeneous networks. The agent communication is based on CORBA but an extra messaging layer is developed which utilises a language built in VDM-SL (Vienna Development Method - Specification Language). A version model is presented in two ways informally based on the assumptions on a general design process and formally in VDM-SL. ZP tP In order to demonstrate the effectiveness of the version model, two industrial case studies are presented. The first of these is a study of offshore process engineering. The second is a study of conceptual ship design.
|
17 |
Guía de acceso para vLex (vLex Global y vLex Perú)Dirección de Gestión del Conocimiento 07 April 2021 (has links)
Proporciona los pasos y procedimientos para acceder al recurso vLex (vLex Global y vLex Perú).
|
18 |
Resolución SL*: Un paradigma basado en resolución lineal para la demostración automáticaCasamayor Rodenas, Juan Carlos 17 July 2009 (has links)
El trabajo incluido en la presente tesis se enmarca dentro del campo de la demostración automática de teoremas y consiste en la estudio, definición y desarrollo de un paradigma de resolución lineal, denominado Resolución SL*. La razón para utilizar la denominación de paradigma reside en el hecho de que en sí misma resolución SL* no es un procedimiento, sino que se puede entender como una forma de razonamiento con ciertos parámetros cuya instanciación da lugar a diferentes procedimientos que son adecuados para el tratamiento de distintos tipos de problemas. Por otro lado, se le ha dado el nombre de resolución SL* porque, como posteriormente se explicará, está muy cercano a Eliminación de Modelos y a resolución SL (de ahí la primera parte del nombre). El asterisco final quiere denotar su parametrización, de forma que los procedimientos instancias de resolución SL* serán denominados con una letra más en vez del asterisco, como posteriormente se verá.
La tesis ha sido dividida en cuatro capítulos que se describen brevemente a continuación.
En el primero se realiza una breve introducción histórica a la demostración automática, que va desde los orígenes de la lógica con el uso de las primeras notaciones matemáticas formales en el siglo XVI hasta la aparición de los resultados más importantes de la lógica descubiertos por Herbrand, Gödel, Church, etc. Se hace un especial hincapié en este capítulo en la demostración automática realizando un recorrido desde sus orígenes a finales del siglo XVIII hasta el momento actual, en el cual es posible ver cuál ha sido la evolución de este campo y qué descubrimientos y resultados se pueden presentar como los principales puntos de inflexión.
En el segundo capítulo se presentan la resolución lineal y algunos de sus principales refinamientos, ya que resolución SL* es un variación de resolución SL y por tanto de resolución lineal. Para ello se introduce el principio de resolución, viendo los problemas de su mecanización, y posteriormente se ven dos refinamientos de resolución: resolución semántica y resolución lineal. Para concluir se estudian los principales refinamientos de resolución lineal: resolución de entrada, resolución lineal con fusión, resolución lineal con subsumción, resolución lineal ordenada, resolución MTOSS y TOSS, Eliminación de Modelos, resolución SL y el sistema MESON.
En el tercer capítulo se presentan y estudian con profundidad las principales aportaciones al campo de la demostración automática que se han producido en los últimos años y que están cercanas a la aproximación del presente trabajo. Se han incluido los siguientes trabajos: el demostrador PTTP de Stickel, el sistema MESON basado en secuencias de Plaisted, el demostrador SATCHMO de Manthey y Bry, los procedimientos Near-Horn Prolog de Loveland y otros autores y, por último, el demostrador SETHEO de Bibel y otros autores. Obviamente no se han incluido todos los demostradores y procedimientos, pero sí aquellos que se han considerado como los más interesantes y cercanos a resolución SL* de manera que sea posible realizar comparaciones, de forma que queden patentes las aportaciones realizadas.
En el cuarto capítulo se presenta resolución SL*. Se da la definición formal de la misma y se introduce el concepto fundamental de elección de ancestros. La elección de ancestros es el mecanismo que permite controlar la aplicación de la resolución de ancestro haciendo posible una reducción del coste de su aplicación y una adecuación de resolución SL* al tipo de problema a tratar. Posteriormente se ven las principales instancias de resolución SL*, los procedimientos SLT y SLP. En este capítulo se hace un especial hincapié en la elección de ancestros, ya que es la principal aportación de resolución SL*, analizando tanto las ventajas que aporta asociadas al incremento de la eficiencia como el hecho de dotar a resolución SL* la capacidad de adaptarse a los problemas que trata. También en este capítulo se presenta una implementación de resolución SL*, en particular del procedimiento SLT, y se incluyen resultados sobre un conjunto extenso de problemas del campo de la demostración automática. En la última sección de este capítulo se realiza una comparación de resolución SL* con los demostradores y sistemas más cercanos, tanto a nivel de características como de resultados. / Casamayor Rodenas, JC. (1996). Resolución SL*: Un paradigma basado en resolución lineal para la demostración automática [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6023
|
19 |
Caracterização bioquímica e biofísica de proteínas específicas envolvidas no SL trans-splicing de Trypanosoma brucei / Biochemical and biophysical characterization of specific proteins involved in Trypanosoma brucei SL trans-splicingSilva, Ivan Rosa e 02 August 2016 (has links)
O SL trans-splicing (do inglês, spliced leader trans-splicing) catalisado pelo spliceossomo em Trypanosoma brucei é responsável pelo processamento dos pré-mRNAs policistrônicos em mRNAs maduros. Esta maquinaria é associada a partir de pequenas partículas ribonucleoproteicas nucleares (snRNPs) U1, U2, U4/U6 e U5 constituídas de pequenos RNAs nucleares (snRNAs), um complexo canônico de sete proteínas Sm (SmB, SmD3, SmD1, SmD2, SmE, SmF e SmG) e fatores proteicos específicos. O núcleo de proteínas Sm de T. brucei apresenta variações com funções desconhecidas, como a substituição do heterodímero SmD3/SmB por Sm16,5K/Sm15K na snRNP U2, e de SmD3 por SSm4 na snRNP U4. Na primeira parte deste trabalho, investigou-se a interação destes diferentes complexos Sm recombinantes com os snRNAs U2, U4 e U5 obtidos por transcrição in vitro. Todos os complexos apresentaram alta afinidade pelo snRNA cognato. Observou-se, ainda, que apenas o núcleo Sm que contém Sm16,5K/Sm15K associado ao snRNA U2 interage com alta afinidade com U2A/U2B. Adicionalmente, foi obtida a estrutura cristalográfica de U2A/U2B de T. brucei, que revela uma organização similar àquela já descrita para ortólogas de Homo sapiens. Entretanto, há um desvio de pelo menos 6 Å no ponto médio da alça carregada positivamente no domínio RRM de U2B para a acomodação do snRNA U2. Além disso, observou-se uma longa hélice-α adicional na extremidade C-terminal de U2A. A análise dos três núcleos Sm de T. brucei a partir da combinação de modelagem molecular e espalhamento de raios-X a baixo ângulo revela estruturas de barril-β altamente torcido com interior carregado positivamente para interação com snRNAs. A principal diferença entre as estruturas encontra-se nas extremidades C- e N-terminal dos variantes de proteínas Sm, possivelmente para interação com U2A no braço 1 do spliceossomo, no caso de Sm15K/Sm16,K, e com U5-220K e U5-200K no corpo do spliceossomo, no caso de SSm4. Na segunda parte deste trabalho, a expressão homóloga da proteína U5-200K de T. brucei completa e do produto truncado no seu cassete helicase/ATPase/Sec63 N-terminal levou à copurificação de um subcomplexo de snRNP U5 composto por U5-220K, U5-116K, U5-40K e U5-Cwc21, sendo que a proteína recombinante completa ainda copurificou as proteínas Sm. Experimentos de imunolocalização mostraram que a proteína U5-200K truncada não é direcionada ao núcleo, como é o caso da proteína completa. As células que expressam a proteína truncada apresentaram um defeito de crescimento significativo, e os processamentos de pré-mRNA por cis- e SL trans-splicing foram ligeiramente afetados, já que a proteína truncada não entra no núcleo, onde deveria exercer sua atividade. Os resultados apresentados indicam a formação de um subcomplexo de snRNP U5 ainda no citoplasma, sendo que as proteínas Sm devem ser um sinal para o seu transporte nuclear mediado por importina-β. Em leveduras, a proteína Aar2 substitui U5-200K no citoplasma, regulando assim a biogênese de snRNP U5, porém esta proteína não foi identificada em T. brucei. Os resultados apresentados neste trabalho contribuem como o primeiro estudo estrutural de proteínas spliceossomais de um parasita do homem e também com novas informações sobre a biogênese das partículas ribonucleoproteicas U2 e U5 de T. brucei. / The spliced-leader (SL) trans-splicing catalyzed by the spliceosome in Trypanosoma brucei is responsible for processing polycistronic pre-mRNAs into mature mRNAs. The spliceosome machinery is assembled by small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) U1, U2, U4/U6 and U5 that are composed by small nuclear RNAs (snRNAs), a canonical complex of Sm proteins (SmB, SmD3, SmD1, SmD2, SmE, SmF, SmG) and specific factors. The Sm core peculiarly varies in T. brucei, where SmD3/SmB are replaced by Sm16.5K/Sm15K in U2 snRNP and SmD3 is substituted by SSm4 in U4 snRNP. In the first part of this thesis, we investigated the interaction of the different recombinant Sm cores with U2, U4 and U5 snRNAs obtained by in vitro transcription. All the protein complexes bind the cognate snRNA with high affinity. Only the Sm core that contains Sm16.5K/Sm15K associated with U2 snRNA interacts with the recombinant U2A/U2B subcomplex. Additionally, the crystallographic structure of T. brucei U2A/U2B was obtained, showing an overall organization similar to the one observed in the human counterpart. However, we observed a 6 Å deviation in the medium point of a positively charged turn in the RRM motif of U2B to accommodate U2 snRNA. Besides, a long α -helix was observed in the C-terminal region of U2A. Structural analysis of Sm core variations in T. brucei was proceeded using molecular modelling techniques associated with small angle X-ray scattering. The quaternary structure models show seven Sm proteins as β-barrels with positively charged interior for cognate snRNA interaction. The main difference among these Sm core structures resides in the C- and N-terminal regions of the variant proteins, probably enabling the interaction of Sm15K/Sm16,5K with U2A in the spliceosomes arm 1, and the association of SSm4 with U5-220K and U5-200K in the spliceosomes body. In the second part of this thesis, homologous expression of full-length and N-terminally truncated U5-200K from T. brucei led to the copurification of a U5 snRNP subcomplex containing U5-220K, U5-116K, U5-40K and U5-Cwc21. The full-length U5-200K construct also copurified Sm proteins. Immunolocalization experiments showed that the truncated U5-200K protein is not directed to the nucleus as is the case for the full-length protein. Cells that expressed the truncated protein showed a significant growth defect and the pre-mRNA processing by cis- and SL trans-splicing was negatively affected since the truncated protein did not enter the nucleus where it should be active. The results suggest that a subcomplex of U5 snRNP begins to be assembled in the cytoplasm and the Sm proteins may be the signal for the nuclear transport mediated by β-importin. In yeast, Aar2 replaces U5-200K in the cytoplasm in another regulation step. However, Aar2 has not been identified in T. brucei. The results presented here contribute with the first structural study of spliceosomal proteins of a human parasite and give new insights into the biogenesis of U2 and U5 snRNPs in T. brucei.
|
20 |
Caracterização bioquímica e biofísica de proteínas específicas envolvidas no SL trans-splicing de Trypanosoma brucei / Biochemical and biophysical characterization of specific proteins involved in Trypanosoma brucei SL trans-splicingIvan Rosa e Silva 02 August 2016 (has links)
O SL trans-splicing (do inglês, spliced leader trans-splicing) catalisado pelo spliceossomo em Trypanosoma brucei é responsável pelo processamento dos pré-mRNAs policistrônicos em mRNAs maduros. Esta maquinaria é associada a partir de pequenas partículas ribonucleoproteicas nucleares (snRNPs) U1, U2, U4/U6 e U5 constituídas de pequenos RNAs nucleares (snRNAs), um complexo canônico de sete proteínas Sm (SmB, SmD3, SmD1, SmD2, SmE, SmF e SmG) e fatores proteicos específicos. O núcleo de proteínas Sm de T. brucei apresenta variações com funções desconhecidas, como a substituição do heterodímero SmD3/SmB por Sm16,5K/Sm15K na snRNP U2, e de SmD3 por SSm4 na snRNP U4. Na primeira parte deste trabalho, investigou-se a interação destes diferentes complexos Sm recombinantes com os snRNAs U2, U4 e U5 obtidos por transcrição in vitro. Todos os complexos apresentaram alta afinidade pelo snRNA cognato. Observou-se, ainda, que apenas o núcleo Sm que contém Sm16,5K/Sm15K associado ao snRNA U2 interage com alta afinidade com U2A/U2B. Adicionalmente, foi obtida a estrutura cristalográfica de U2A/U2B de T. brucei, que revela uma organização similar àquela já descrita para ortólogas de Homo sapiens. Entretanto, há um desvio de pelo menos 6 Å no ponto médio da alça carregada positivamente no domínio RRM de U2B para a acomodação do snRNA U2. Além disso, observou-se uma longa hélice-α adicional na extremidade C-terminal de U2A. A análise dos três núcleos Sm de T. brucei a partir da combinação de modelagem molecular e espalhamento de raios-X a baixo ângulo revela estruturas de barril-β altamente torcido com interior carregado positivamente para interação com snRNAs. A principal diferença entre as estruturas encontra-se nas extremidades C- e N-terminal dos variantes de proteínas Sm, possivelmente para interação com U2A no braço 1 do spliceossomo, no caso de Sm15K/Sm16,K, e com U5-220K e U5-200K no corpo do spliceossomo, no caso de SSm4. Na segunda parte deste trabalho, a expressão homóloga da proteína U5-200K de T. brucei completa e do produto truncado no seu cassete helicase/ATPase/Sec63 N-terminal levou à copurificação de um subcomplexo de snRNP U5 composto por U5-220K, U5-116K, U5-40K e U5-Cwc21, sendo que a proteína recombinante completa ainda copurificou as proteínas Sm. Experimentos de imunolocalização mostraram que a proteína U5-200K truncada não é direcionada ao núcleo, como é o caso da proteína completa. As células que expressam a proteína truncada apresentaram um defeito de crescimento significativo, e os processamentos de pré-mRNA por cis- e SL trans-splicing foram ligeiramente afetados, já que a proteína truncada não entra no núcleo, onde deveria exercer sua atividade. Os resultados apresentados indicam a formação de um subcomplexo de snRNP U5 ainda no citoplasma, sendo que as proteínas Sm devem ser um sinal para o seu transporte nuclear mediado por importina-β. Em leveduras, a proteína Aar2 substitui U5-200K no citoplasma, regulando assim a biogênese de snRNP U5, porém esta proteína não foi identificada em T. brucei. Os resultados apresentados neste trabalho contribuem como o primeiro estudo estrutural de proteínas spliceossomais de um parasita do homem e também com novas informações sobre a biogênese das partículas ribonucleoproteicas U2 e U5 de T. brucei. / The spliced-leader (SL) trans-splicing catalyzed by the spliceosome in Trypanosoma brucei is responsible for processing polycistronic pre-mRNAs into mature mRNAs. The spliceosome machinery is assembled by small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) U1, U2, U4/U6 and U5 that are composed by small nuclear RNAs (snRNAs), a canonical complex of Sm proteins (SmB, SmD3, SmD1, SmD2, SmE, SmF, SmG) and specific factors. The Sm core peculiarly varies in T. brucei, where SmD3/SmB are replaced by Sm16.5K/Sm15K in U2 snRNP and SmD3 is substituted by SSm4 in U4 snRNP. In the first part of this thesis, we investigated the interaction of the different recombinant Sm cores with U2, U4 and U5 snRNAs obtained by in vitro transcription. All the protein complexes bind the cognate snRNA with high affinity. Only the Sm core that contains Sm16.5K/Sm15K associated with U2 snRNA interacts with the recombinant U2A/U2B subcomplex. Additionally, the crystallographic structure of T. brucei U2A/U2B was obtained, showing an overall organization similar to the one observed in the human counterpart. However, we observed a 6 Å deviation in the medium point of a positively charged turn in the RRM motif of U2B to accommodate U2 snRNA. Besides, a long α -helix was observed in the C-terminal region of U2A. Structural analysis of Sm core variations in T. brucei was proceeded using molecular modelling techniques associated with small angle X-ray scattering. The quaternary structure models show seven Sm proteins as β-barrels with positively charged interior for cognate snRNA interaction. The main difference among these Sm core structures resides in the C- and N-terminal regions of the variant proteins, probably enabling the interaction of Sm15K/Sm16,5K with U2A in the spliceosomes arm 1, and the association of SSm4 with U5-220K and U5-200K in the spliceosomes body. In the second part of this thesis, homologous expression of full-length and N-terminally truncated U5-200K from T. brucei led to the copurification of a U5 snRNP subcomplex containing U5-220K, U5-116K, U5-40K and U5-Cwc21. The full-length U5-200K construct also copurified Sm proteins. Immunolocalization experiments showed that the truncated U5-200K protein is not directed to the nucleus as is the case for the full-length protein. Cells that expressed the truncated protein showed a significant growth defect and the pre-mRNA processing by cis- and SL trans-splicing was negatively affected since the truncated protein did not enter the nucleus where it should be active. The results suggest that a subcomplex of U5 snRNP begins to be assembled in the cytoplasm and the Sm proteins may be the signal for the nuclear transport mediated by β-importin. In yeast, Aar2 replaces U5-200K in the cytoplasm in another regulation step. However, Aar2 has not been identified in T. brucei. The results presented here contribute with the first structural study of spliceosomal proteins of a human parasite and give new insights into the biogenesis of U2 and U5 snRNPs in T. brucei.
|
Page generated in 0.023 seconds