Le champ biomédical n’a pas échappé à l’évolution de la technologie, elle cherche aussi à intégrer plusieurs fonctions dans un espace restreint. Un des points forts du développement est la massification de points de service, afin d'obtenir un diagnostic rapide des maladies. Le diagnostique aux premières étapes de son évolution permettra réduire considérablement les coûts associés aux traitements des patients. Le présent document exprimera une alternative à l'évolution de la technologie des biocapteurs qui sont basés sur le phénomène optique appelé résonance par plasmons de surface. Ce projet de recherche vise l’étude de l’intégration monolithique des deux tiers des composants principaux qui conforment normalement à ce type de biocapteurs optiques. Tandis que d'autres projets de recherche ont centré leurs travaux sur l’intégration de la surface de réaction et le détecteur, notre travail a pris en compte l’intégration de la source de lumière et la surface de réaction biologique. Deux types de sources ont été employés au moment de faire la conception, l’étude de matériaux, la fabrication et la caractérisation de la performance de notre dispositif. La première source a employé des puits quantiques à l’intérieur d’une gaufre de GaAs qui nécessitait un pompage optique pour son fonctionnement. La deuxième source a eu une gaufre commerciale employée pour la fabrication des diodes d’émission lumineuse verticale, qui a dû être excitée par un courant électrique. On a découvert que les deux types de sources sont complémentaires. La source avec des puits quantiques a démontré une amélioration de la performance en comparaison à notre système commercial de référence. La deuxième source a démontré la faisabilité d’intégration monolithique en permettant se rapprocher à la fabrication d’un prototype commercial. La porte reste donc ouverte pour la poursuite du développement de cette technologie en cherchant un nouveau système employant ces deux sources, mais usant de meilleures caractéristiques.

The cold gas dynamic spray process developed in the middle of the 80’s reached the industrial stage in development. Even so, many scientific investigations still go on. The nature of the bond between the coating and the substrate is the subject of some controversy. The development of the process will be improved by understanding how the properties of the powder and the mechanical properties of the substrate influence the bonding process. This study analyses the basic dynamics of the process when copper is sprayed. • The one dimensional isentropic model of the gas behaviour in a Laval type nozzle allows evaluating the effect of the gas stagnation pressure P0 and temperature T0 on the impact velocity and temperature of the powder particle. • The analysis of single splats on two substrates (aluminium and steel) shows the influence of the substrate on the deformation of single particles and the influence of the impact speed on the impact shape. • Coatings are made of with powders with a specific size distribution. Two copper powders with a different size distribution are compared based on the deposition efficiency (D.E.) and the mechanical properties of the coating. The mechanical properties tested are the microhardness, the bond strength and the nanohardness. • X-ray diffraction will show that the two powders have an initial very different microstructure. The consequence of this is a different deformation mechanism during the coating build up. • An Auger analysis of the interface has shown the presence of diffusion zone when copper was sprayed on the Al and TA6V substrate. It appears that the size distribution will determine the final impact conditions of the powder. The microstructure of the powder and the oxide content of the powder yield different deformation processes and may explain the differences in D.E. and mechanical properties. The Auger analysis of the interface has yielded diffusion zone that were not expected but some mechanisms under impact loading can explain their presence./ Le procédé de projection thermique à froid a été développé dans le milieu des années 80 et il arrive au stade industriel. Néanmoins, plusieurs développements scientifiques sont encore en cours. La nature du lien entre la poudre et le substrat est toujours l’objet de certaines controverses. Le développement futur du procédé nécessite une bonne compréhension de l’influence de la poudre et des propriétés du substrat sur le mécanisme d’adhérence. Cette étude va mettre en évidence les principaux facteurs influençant la projection de cuivre. • Le modèle unidimensionnel isentropique du gaz parfait dans une buse convergente/ divergente permet de déterminer l’influence de la pression de stagnation et de la température de stagnation sur la vitesse et la température d’impact des particules de poudre. • L’analyse d’impact unique sur les substrats d’acier et d’alliage d’Al (AA2014) montre l’influence du substrat sur la déformation des particules de poudre. La vitesse d’impact a une conséquence importante sur la forme d’une particule projetée sur une surface. . • Les revêtements sont fabriqués à partir de poudre avec une granulométrie donnée. Deux poudres avec une distribution de taille différente sont comparées par leur rendement de déposition et les propriétés mécaniques des revêtements obtenus. Les propriétés mécaniques testées sont la microdureté, l’adhérence et la nanodureté. • La diffraction par rayons-X montre que les deux poudres ont initialement une microstructure très différente. Lors de l’impact, les deux poudres vont se déformer de manière différente et ceci se traduit dans la microstructure. • La spectroscopie Auger montre qu’une zone de diffusion s’est formée à l’interface entre le cuivre et les deux substrats d’Al et de TA6V. La distribution de taille des poudres a une influence considérable sur la vitesse et la température d’impact des particules de poudres mais il apparaît que d’autres facteurs ont aussi énormément d’influence. Le taux d’oxyde dans la poudre a une influence très importante sur le rendement et l’adhérence du dépôt. Les deux poudres projetées ont une microstructure initiale très différente et ceci se traduit par une déformation différente des particules de poudre dans le revêtement.

Fragment based drug discovery (FBDD) has been applied to two protease drug targets, MMP-12 and HIV-1 protease. The primary screening and characterization of hit fragments were performed with surface plasmon resonance -technology. Further evaluation of the interaction was done by inhibition studies and in one case with X-ray crystallography. The focus of the two projects was different. Many MMP inhibitors contain a strong zinc chelating group, hydroxamate, interacting with the catalytic zinc atom. This strategy may be the cause for the low specificity of MMP inhibitors. Using FBDD we found a fragment with an unusual strong affinity for MMP-12. An inhibition assay confirmed that it was an inhibitor but indicated a stoichiometry of 2:1. Crystallography data revealed that an adduct of the fragment was bound in the active site, with interactions both with the catalytic zinc and the S1’ pocket. This may present a new scaffold for MMP-12 inhibitors. For HIV-1 protease the focus was on identifying inhibitors not sensitive to current resistance mutations. A fragment library for screening with SPR-technology was designed and used for screening against wild type enzyme and three variants with resistance mutations. Many of the hits were promiscuous but a number of fragments with possible allosteric inhibition mechanism were identified. The temperature dependency of the dissociation rate and reported resistance mutations was studied with thermodynamics. A good, but not perfect correlation was found between resistance and both the dissociation data and the free energy for dissociation compared to data from wild type enzyme. However, the type of mutation also influenced the results. The flap mutation G48V displayed thermodynamic profiles not completely correlating with resistance. It was found that dissociation rate and thermodynamics may complement each other when studying resistance, but only one of them may not be enough.

Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is an essential protein in the cell. It is involved in transcription and many types of DNA repair and replication. Homologues of this protein are found in all orders of life. The high level of conservation and essential nature of PCNA infers that it may be a potential drug target for anti-caner drugs in humans and also a potential anti-parasitic target. X-ray structures of PCNA from Homo sapiens (Hs), Schizosaccharomyces pombe (Sp) and Leishmania major (Lm) are now available and can be used as a template for structure based drug design. In this work PCNA from these three species have been prepared in milligram quantities for biochemical and biophysical studies. The previously unknown structure of LmPCNA has been solved in an uncomplexed form and also complexed with a dodecapeptide to a resolution of 3.0Å. A comparison of PCNA structures and their peptide complexes for the three species identifies structural differences which may be relevant in analysing thermodynamic contributions of binding. All eukaryotic PCNA molecules exist as ring shaped trimers which form around DNA. In this work the oligomeric state of LmPCNA has been determined to be hexameric both in solution and in the crystal. It has also been hypothesised that HsPCNA is hexameric however these would seem to form hexamers in which the trimeric rings associate “back-to-back” while LmPCNA trimers would seem to associate “face-to-face”. The binding affinities for these three PCNAs have been determined with a selection of peptides derived from the Hs p21 protein. This work has shown, using a selection of different techniques including Surface Plasmon Resonance (SPR), Isothermal Titration Calorimetry (ITC) and Dynamic Scanning Fluorimetry (DSF); that HsPCNA and SpPCNA have similar affinities for a 12mer peptide (Kd of ~1μM) however LmPCNA shows significantly weaker interactions (Kd of ~10μM). This is most likely due to divergence in the sequence and structure of LmPCNA. A systematic investigation by SPR on the effect of peptide linker length on binding has been carried out using a series of synthesised peptides with different lengths of chemical spacer. The series of streptavidin immobilised peptides show that longer spacers are required for the recovery of the PCNA peptide binding affinity. The results presented in this work indicate that a linker length of at least 20Å is required for measurable protein binding activity. This interaction is improved with longer peptide spacers.

A variety of HIV-1 protease inhibitors and their interactions with the enzyme have been characterized in order to identify novel and improved drugs against AIDS. The investigated inhibitors were represented by clinical and non-clinical inhibitors, active site and allosteric inhibitors, transition-state analogues and metal-ions. In addition, different enzyme variants were used to investigate the contribution of different amino acid residues to the interaction with different ligands. The problem of resistance has been addressed by exploring novel types of inhibitors, and resistant mutants of HIV-1 protease. A study resolving the inhibition of HIV-1 protease by Cu2+ showed that the enzyme can be allosterically inhibited and that copper inhibition is a result of an interaction with His-69 and a subsequent conformational change. Several types of transition-state analogues were analyzed with respect to their inhibition of wild-type and resistant mutants of HIV-1 protease. Unfortunately cyclic compounds were not found to be better than linear compounds. Moreover, it was not possible to identify structure-activity relationships that clearly correlated with efficacy towards mutants and a biosensor based method for more detailed kinetic studies was therefore adopted. By cross-linking the immobilized enzyme on the biosensor matrix, a stable surface was obtained and kinetic rate constants could be determined for the interaction between the enzyme and inhibitors. Additional improvements in the methodology involved identification of a more representative interaction model, allowing more detailed studies of interactions with resistant mutants and varying conditions. Finally, absorption to lipid membranes and interaction with human serum albumin and α1-glycoprotein by clinical drugs were studied in a simplified ADME model system for improvement of the earlier stages of drug development. These studies have revealed important characteristics of these drugs that can potentially be modeled into new compounds that have improved efficacy of both wild-type and resistant mutants of HIV-1 protease.

<p>Bacterial outer membrane vesicles (OMVs) are spherical buds of the outer membrane (OM) containing periplasmic lumenal components. OMVs have been demonstrated to play a critical part in the transmission of virulence factors, immunologically active compounds, and bacterial survival, however vesiculation also appears to be a ubiquitous physiological process for Gram-negative bacteria. Despite their characterized biological roles, especially for pathogens, very little is known about their importance for the originating organism as well as regulation and mechanism of production. Only when we have established their biogenesis can we fully uncover their roles in pathogenesis and bacterial physiology. The overall goal of this research was to characterize bacterial mutants which display altered vesiculation phenotypes using genetic and biochemical techniques, and thereby begin to elucidate the mechanism of vesicle production and regulation. One part of this work elucidated a synthetic genetic growth defect for a strain with reduced OMV production (&#916;nlpA, inner membrane lipoprotein with a minor role in methionine transport) and envelope stress (&#916;degP, dual function periplasmic chaperone/ protease responsible for managing proteinaceous waste). This research showed that the growth defect of &#916;nlpA&#916;degP correlated with reduced OMV production with respect to the hyprevesiculator &#916;degP and the accumulation of protein in the periplasm and DegP substrates in the lumen of OMVs. We further demonstrated that OMVs do not solely act as a stress response pathway to rid the periplasm of otherwise damaging misfolded protein but also of accumulated peptidoglycan (PG) fragments and lipopolysaccharide (LPS), elucidating OMVs as a general stress response pathway critical for bacterial well-being. The second part of this work, focused on the role of PG structure, turnover and covalent crosslinks to the OM in vesiculation. We established a direct link between PG degradation and vesiculation: Mutations in the OM lipoprotein nlpI had been previously established as a very strong hypervesiculation phenotype. In the literature NlpI had been associated with another OM lipoprotein, Spr that was recently identified as a PG hydrolase. The data presented here suggest that NlpI acts as a negative regulator of Spr and that the &#916;nlpI hypervesiculation phenotype is a result of rampantly degraded PG by Spr. Additionally, we found that changes in PG structure and turnover correlate with altered vesiculation levels, as well as non-canonical D-amino acids, which are secreted by numerous bacteria on the onset of stationary phase, being a natural factor to increase OMV production. Furthermore, we discovered an inverse relationship between the concentration of Lpp-mediated, covalent crosslinks and the level of OMV production under conditions of modulated PG metabolism and structure. In contrast, situations that lead to periplasmic accumulation (protein, PG fragments, and LPS) and consequent hypervesiculation the overall OM-PG crosslink concentration appears to be unchanged. Form this work, we conclude that multiple pathways lead to OMV production: Lpp concentration-dependent and bulk driven, Lpp concentration-independent.</p> / Dissertation

The complement system is a major component of innate immunity and an effector of antibody-mediated immune responses. Unlike the other two activation pathways of the complement system, the alternative pathway is permanently switched on. Discrimination by complement between self and foreign is therefore achieved by selective protection of healthy host tissue and cells. This study investigated the alternative pathway regulator factor H (FH), which is crucial for protection of self surfaces from complement. FH engages via its N- and C- terminal ends with activation-specific fragments of C3, C3b and C3d. The middle region of FH has no binding sites for complement components. It presumably ensures that the binding sites at either end of the extended and flexible FH molecule cooperate in recognizing C3b in fluid phase or on self surfaces, but not on foreign targets. This study was aimed at achieving an atomic level understanding of the structure of the middle portion of FH, thereby testing hypotheses as to how it promotes the overall biological efficacy of the intact protein. High-resolution NMR-derived structures of two module pairs FH-10-11 and FH-11-12 were solved and combined with SAXS data to produce a model of FH-10-12. This was combined, in silico, with the previously solved FH-12-13 structure, then the model of FH-10-13 was used to revisit SAXS data for FH-10-15 and FH-8-15. A unique structure emerged, unlike any other encountered previously in the family of complement regulators, in which CCPs 13, 14 and 15 have a highly compacted organization that has repercussions for function. While devoid of binding affinity for host ligands, this central region is a binding site for PspC, a virulence factor of S. pneumoniae. It has been speculated that the bacteria use this interaction to sequester FH in a conformation that resembles the one adopted by FH on self cells and makes it particularly good at regulating complement. Structural and functional investigations of this interaction were performed to establish the molecular basis of the use of FH by this pathogen in order to avoid complement-mediated elimination. It was found that PspC and FH form a near-irreversible complex, while FH-8-15 binds PspC almost as tightly as intact protein. When bound to PspC, FH has a higher affinity for some of its targets, supporting the theory that this bacterial protein stabiles a particularly active conformation of the regulator.

Les estrogènes contribuent au contrôle de l'expression de nombreux gènes cibles en interagissant avec les Récepteurs aux Estrogènes (RE). Ces récepteurs sont des facteurs de transcription qui interagissent avec une séquence cis-régulatrice, appelée Elément de Réponse aux Estrogènes (ERE). Un criblage de molécules capables de lier les RE et de moduler l'expression génique apporte un intérêt thérapeutique (ménopause, cancers hormonodépendant) et des intérêts dans les domaines de la santé publique et de l'écologie (perturbateurs endocriniens). Nous avons développé deux modèles de biocapteurs reposant sur le principe de Résonance Plasmonique de Surface. Une telle démarche permet de réduire le coût et le temps expérimental nécessaire au criblage d'une chimiothèque. Par ailleurs, la validation de l'utilisation de tels outils nécessite la corrélation des résultats à ceux obtenus à l'aide d'un modèle biologique plus complexe. Ainsi, nous avons développé, un modèle de cellules humaines de cancer du sein (MCF-7) transfectées par un vecteur rapporteur. La mise en place en parallèle de ces deux modèles a permit d'identifier un nouveau phytoestrogène agoniste de REa : la 7-O-ß-Dglucopyranolychrysine. L'un de nos biocapteurs est compatible avec l'étude des interactions protéines/protéines. Nous avons donc appliqué ce modèle à la recherche de partenaires de la protéine GEC1 codé par un gène régulé par les estrogènes. En conclusion, nous avons développé en parallèle des biocapteurs ADN/protéine et un modèle cellulaire permettant l'identification de xénoestrogènes (7-O-ß-D-glucopyranolychrysine), ainsi qu'un biocapteur protéines/protéines permettant le criblage de partenaires protéiques.

Ce travail de thèse s'inscrit dans la recherche et le développement de capteurs chimiques. Il est motivé par un besoin toujours croissant d'outils de détection dans des domaines aussi variés que la santé, la sécurité et l'environnement. Nous présentons l'étude de capteurs basés sur le principe de résonance plasmons de surface - SPR. L'intérêt de ce type de capteurs est principalement lié à leur grande sensibilité, leur réponse rapide en temps réel et leur grande précision sans l'utilisation de marqueurs. L'originalité de notre approche est l'utilisation de fibres optiques. Celles-ci offrent de nouveaux attraits tels la simplification de l'instrumentation et sa miniaturisation. <br />Dans une première partie, nous présentons une revue théorique sur les plasmons de surface à l'interface métal – diélectrique. Nous présentons ensuite une étude expérimentale en deux parties : la première décrit la réalisation et la caractérisation des capteurs SPR à fibre optique, la seconde présente l'analyse de la réponse SPR des transducteurs ainsi réalisés. En particulier nous avons caractérisé par des études systématiques l'influence de paramètres physiques importants liés au métal, à la fibre optique et au traitement de surface de la partie sensible par le greffage d'une couche de thiols.<br />Enfin, nous proposons une étude numérique simulant la réponse du capteur en fonction de différents stimuli. Ce modèle, basée sur le calcul de la réflectance de la lumière à l'interface d'un ensemble multicouches nous a permis de valider l'étude expérimentale et d'étendre les recherches en prenant en compte différent type de molécules cibles. En particulier, nous présentons des résultats sur des molécules absorbants ou non absorbants, greffées ou non à la surface du transducteur. Une comparaison entre résultats expérimentaux et simulations numériques valide l'ensemble du travail et nous permet finalement de proposer une configuration optimisée du capteur, en fonction de la nature de la couche métallique et de la fibre optique, ainsi que des molécules cibles à détecter.

Les biopuces sont des systèmes miniaturisés qui permettent des analyses en parallèle et à haut débit. Ainsi, les puces à protéines/peptides sont très utiles dans l'étude des interactions entre diverses molécules biologiques. Nous avons réalisé des puces à protéines et peptides en se basant sur la technologie des polymères conducteurs : la méthode consiste à immobiliser les molécules sondes (protéines ou peptides) sur des supports par électrocopolymérisation à partir d'un mélange de pyrrole et de pyrrole lié à la molécule sonde. Le support consiste en un prisme recouvert d'un film d'or permettant l'analyse des interactions protéine-protéine ou antigène-anticorps par imagerie de la résonance plasmonique de surface. Cette méthode optique, compatible avec des mesures en parallèle, permet une analyse directe, en temps réel et donne accès aux paramètres cinétiques des interactions. Ces puces, de réalisation facile, présentent une très bonne spécificité et une bonne sensibilité. Elles peuvent être régénérées un grand nombre de fois et sont compatibles avec l'analyse d'échantillons biologiques complexes tels que du sérum non dilué. Ces caractéristiques permettent un champ d'application très large, en recherche fondamentale ou clinique mais aussi en diagnostic.