Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Les protéines capables de lier des ARNs sont essentielles pour les différentes étapes de maturation de l'ARN messager (ARNm), en dirigeant leur localisation et leur devenir dans la cellule, et en formant avec les ARNs des particules ribonucléoprotéiques (mRNPs). Les mRNPS peuvent former des structures cellulaires dynamiques qui sont adressées vers des fonctions spécifiques. Ces granules, tels que les granules de stress formés suite à un stress cellulaire, contiennent des ARNm dont la traduction est inhibée et qui sont stockés transitoirement. Ma thèse a consisté en la caractérisation fonctionnelle de G3BP (RasGAP SH3 binding protein), une RBP exprimée de façon ubiquitaire chez l'homme et la souris, et impliquée dans l'assemblage des granules de stress. Par recombinaison homologue classique, des souris knock-out pour G3BP ont été générées. Ces souris ont une espérance de vie faible et des défauts du comportement associés au Système Nerveux Central, en particulier un phénotype de type ataxie. Des expériences d'électrophysiologie ont aussi montré une altération de la plasticité synaptique dans l'hippocampe des souris KO. J'ai donc réalisé des expériences d'immunoprécipitation après cross-link (Cross-Linking and Immunoprecipitation, CLIP) pour purifier à partir de cerveau de souris un complexe stable contenant G3BP, et les ARNs associés ont été identifiés par séquençage haut débit (High-Throughput Sequencing, HITS-CLIP). De façon surprenante, la plupart des cibles de G3BP correspondent à des transcrits codants mais qui contiennent des séquences introniques, et des ARNs non codants. De plus, mes résultats ont montré que l'absence de G3BP1 affecte la stabilité de ces transcrits pré-matures spécifiquement dans le cervelet, ce qui peut être corrélé au phénotype d'ataxie des souris KO G3BP1. Cela suggère un nouveau mécanisme de régulation qui passe par la stabilisation de transcrits pré-matures, qui pourraient être convertis en transcrits matures par exemple lors d'un stress et de la séquestration de G3BP dans les granules. / RNA binding proteins (RBPs) are essential in the different steps of processing of the messenger RNAs (mRNAs), directing their localization and fate within the cell, and forming with them the ribonucleoprotein particles (mRNPs). mRNPs can assemble into dynamic cellular structures in which they are routed towards specific functions. RNA granules such as stress granules (SGs) contain translationally silenced mRNPs storing transiently repressed mRNAs.My thesis work consisted in the functional characterization of G3BP (RasGAP SH3 binding protein), an RBP that is expressed ubiquitously in both humans and mice and is involved in the assembly of SGs. Using classical homozygous recombination, viable G3BP1 knock out mice were generated that demonstrated short lifespan.and behavioral defects linked to the Central Nervous System (CNS), notably an ataxia phenotype. Electrophysiology experiments showed an alteration of synaptic plasticity in the hippocampus of KO mice. Therefore, I used Cross-Linking and Immunoprecipitation (CLIP) to purify from mouse brain a stable complex containing G3BP, and performed High-Throughput Sequencing (HITS-CLIP) to identify associated RNAs. Strikingly, most of the G3BP targets correspond to intron sequence-retaining transcripts and non-coding RNAs. My results also showed that G3BP1 depletion influences the stability of these premature transcripts in the cerebellum, which can be correlated to the ataxia phenotype of the G3BP1 KO mice. This comprehensive analysis suggests a new mechanism of gene regulation based on stabilization of silenced premature transcripts which might be converted to mature transcripts under stress condition and sequestration of G3BP in SGs.

La promiscuité des enzymes joue un rôle primordial pour l’évolution des protéines et la divergence des fonctions catalytiques. Comprendre les déterminants moléculaires qui régissent cette promiscuité enzymatique représente un enjeu scientifique majeur pour identifier les trajectoires évolutives pouvant entrainer l’émergence de nouvelles fonctions. L’objectif de cette thèse a consisté d’une part à sonder la promiscuité catalytique de l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, une transglucosidase d’intérêt biotechnologique majeur, dans le but d’identifier des substrats alternatifs et d’autre part à étendre ses capacités naturelles par des techniques d’évolution moléculaire. Une trentaine de molécules ont été testées et ont permis de mettre en évidence la forte spécificité de l’enzyme pour son substrat donneur ainsi que sa large promiscuité vers les substrats accepteurs. Le rôle des résidus impliqués dans la reconnaissance des substrats a par la suite été considéré au travers d’une stratégie rationnelle basée sur des prévisions de stabilité thermodynamique. Deux histidines (H187 et H392), ont ainsi été ciblées par mutagénèse à saturation. La stabilité de ces mutants a été étudiée ainsi que ainsi que leur activité envers différents substrats. Des enzymes à la stabilité améliorée ou montrant des changements de spécificité de produits ont ainsi été identifiées. Afin d’étudier plus amplement la promiscuité de cette amylosaccharase, une deuxième stratégie d’ingénierie a été menée pour mimer in vitro les mécanismes moléculaires de la dérive génétique neutre. Ce phénomène dit de “Neutral-Drift” a préalablement été décrit comme un facteur impliqué dans les changements de promiscuité catalytique. Quatre cycles de mutagénèse ont ainsi été réalisés et 440 clones ont été sélectionnés pour avoir conservé leur fonction originelle (i.e. leur activité sur saccharose). Des variants aux propriétés catalytiques améliorées envers des substrats alternatifs ont été caractérisés et des groupes de positions corrélées ont été identifiés. L’effet des mutations neutres sur la thermostabilité a également été étudié. Enfin, de façon remarquable, une nouvelle activité envers un substrat non reconnu par l’enzyme native, le méthyl-α-L-rhamnopyranoside, a été détectée. Ce variant possédant quatre substitutions a été caractérisé et la résolution de sa structure tridimensionnelle par cristallographie aux rayons-X permettra d’approfondir les relations unissant séquence, structure et activité de l’enzyme / Investigation of substrate promiscuity is of prime interest to understand the way enzymes evolve. Understanding the molecular determinants involved in substrate promiscuity is challenging to determine the evolutionary trajectories that lead to the emergence of catalytic functions and to take further advantage of their evolvability to develop original biocatalysts. The objective of this thesis aimed to investigate the substrate promiscuity of the amylosucrase from Neisseria polysaccharea, a transglucosidase of prime biotechnological interest, to identify alternative donor and acceptor molecules and further extend its catalytic properties through enzyme engineering. About thirty molecules were assayed and the strong specificity for the natural donor sucrose was emphasized, as well as the broad acceptor promiscuity. The rational engineering of active site residues responsible for substrate recognition was undertaken through thermodynamic stability predictions. Two residues, namely H187 and H392, were rationally targeted for site-directed mutagenesis. The stability of these variants was investigated as well as their activity toward both natural and promiscuous substrates. Variants with enhanced stability or altered product distribution were identified. These results highlighted that mutations responsible for stability changes may also lead to substrate promiscuity or product specificity changes. To further investigate the promiscuity of amylosucrase, we considered another engineering strategy to mimic in vitro the neutral enzyme evolution. Neutral genetic drift was previously shown to be related to promiscuity changes. On this basis, four repeated round of mutagenesis were performed and 440 clones were selected because they maintained the protein original function (i.e. the activity on sucrose). Variants with enhanced properties towards promiscuous donors and acceptors were characterized and clusters of correlated amino acid substitutions were identified. The impact of neutral mutations on thermodynamic stability was also discussed. Remarkably, a totally new activity towards methyl-α-L-rhamnopyranoside, an acceptor not recognized by the parental wild-type enzyme, was detected. The variant harboring four amino acid substitutions was characterized and the determination of its three-dimensional structure by X-ray crystallography will be useful to further investigate the structure-sequence-activity relationships of this enzyme

Les méthodes classiques de résolution des équations de l'élasticité linéaire sont les méthodes éléments finis. Ces méthodes produisent de très bons résultats et sont très largement analysées mathématiquement pour l'étude des déformations solides. Pour des problèmes de couplage solide/fluide, pour des situations réalistes en présence de discontinuités (modélisation des fronts de gel dans les sols humides), ou bien encore pour des domaines de calcul mieux adaptés aux maillages non conformes, il parait intéressant de disposer de solveurs Volumes Finis. Les méthodes Volumes Finis sont très largement utilisées en mécanique des fluides. Appliquées aux problèmes de convection, elles sont bien adaptées à la capture de solutions présentant des discontinuités et ne nécessitent pas de maillages conformes. De plus, elles présentent l'avantage de conserver au niveau discret les flux à travers les interfaces du maillage. C'est pourquoi sont développées et testées, dans cette thèse, plusieurs méthodes de volumes finis, qui permettent de traiter le problème de l'élasticité. On a, dans un premier temps, mis en œuvre la méthode LSGR (Least Squares Gradient Reconstruction), qui reconstruit des gradients par volumes à partir d'une formule de moindres carrés pondérés sur les volumes voisins. Elle est testée pour des maillages tétraédriques non structurés, et montre un ordre 1 de convergence. La méthode des Volumes Finis mixtes est ensuite présentée, basée sur la conservation d'un flux "pénalisé" à travers les interfaces. Cette pénalisation impose une contrainte sur le type de maillage utilisé, et des tests sont réalisés en 2d avec des maillages structurés et non structurés de quadrangles. On étend ensuite la méthode des Volumes Finis diamants à l'élasticité. Cette méthode détermine un gradient discret sur des sous volumes associés aux interfaces à partir de l'interpolation de la solution aux sommets du maillage. La convergence théorique est prouvée sous réserve de vérifier une condition de coercivité. Les résultats numériques, en 2d pour des maillages non structurés, conduisent à un ordre de convergence meilleur que celui prouvé. Enfin, la méthode DDFV (Discrete Duality Finite Volume), qui est une extension de la méthode Diamant, est présentée. Elle est basée sur une correspondance entre plusieurs maillages afin d'y construire des opérateurs discrets en "dualité discrète". On montre que la méthode est convergente d'ordre 1. Les illustrations numériques, réalisées en 2d et en 3d pour des maillages non structurés, montrent une convergence d'ordre 2, ce qui est fréquemment observé pour cette méthode. / Finite element methods are conventionally used for solving linear elasticity equations. These methods produce very good results and are widely analyzed from a mathematical point of view to study solid deformations. It seems interesting to have Finite Volume solvers for coupled solid/fluid problems, realistic situations in presence of discontinuities (freezing fronts modeling in wet soils), or even to compute fields better suited to non-conforming meshes. Finite Volume methods are widely used in fluid mechanics. Applied to convection problems, they are well suited to compute solutions with discontinuities and do not require mesh conformity. Moreover, they have the advantage of preserving discrete flows across the interfaces of the mesh. Therefore, we develop and test in this thesis several finite volume methods for solving the elasticity problem. First of all, we implement the LSGR method (Least Squares Gradient Reconstruction), which reconstructs gradients by volume from a weighted least squares formula on neighboring volumes. This method has been successfully tested for unstructured tetrahedral meshes, and shows a first-order convergence rate. Then, we present the Mixed Finite Volume method, based on the conservation of a "penalized" flow across the interfaces. The penalty term imposes a constraint on the type of meshes, and numerical tests are performed in 2D with structured and unstructured quadrangles. Afterwards, we extend the diamond-cell Finite Volume method to the elasticity. This method computes a discrete gradient on sub-volumes related to the interfaces from the interpolation of the solution at vertices. The theoretical convergence is proved under a coercivity condition. The numerical results, achieved in 2d for unstructured meshes, give a second-order convergence rate. Finally, we present the DDFV method (Discrete Duality Finite Volume), which is an extension of the precedent one. This method is based on a correspondence between several meshes in order to construct discrete operators on "discrete duality". We show that the DDFV scheme is a first-order convergent method. The 2d and 3d numerical tests on unstructured meshes show a second-order convergence rate, which is a classical result for this method.

La câblerie est un secteur industriel gros consommateur de polymères. Dans ce domaine, les normes imposent cependant de limiter le risque incendie et donc d'ignifuger les matériaux polymères utilisés, sources importantes de combustibles. De nombreux travaux ont porté sur leur ignifugation par utilisation d'additifs retardateurs de flammes, mais peu d'entre eux ont étudié l'influence de la morphologie des mélanges polymères chargés sur la stabilité thermique et le comportement au feu. Cette thèse fait suite à un précédent projet qui avait démontré une influence significative de la morphologie sur le comportement au feu d'un mélange polymère binaire (PC/PBT). Elle a pour but d'améliorer la compréhension de cette influence dans le cas de formulations plus complexes (ternaires ou quaternaires) à matrice éthylène méthylacrylate (EMA). Pour cela, la première stratégie adoptée a été l'identification d'un système ignifugeant comprenant un polyester capable de charbonner lors de l'ajout d'un RF. Une fois ce système identifié (PBT+MDH), il a été incorporé en matrice EMA en faisant varier la composition et la morphologie (dispersion sélective, taille des particules…). Cette approche a mis en évidence des différences significatives entre les différentes formulations et des résultats très intéressants ont été obtenus en termes de réaction au feu à l'échelle laboratoire. Cependant, le passage à l'échelle pilote (test de propagation de flamme) n'a pas permis de valider ces formulations pour des applications câbles. Au vu de ces constatations, une dernière partie a été proposée pour essayer d'améliorer la cohésion du résidu par ajout de polyphosphate d'ammonium. / The cable industry is a major consumer of industrial polymers. In this area, the standards impose to limit the fire risk and thus to enhance the fireproof of the polymeric materials which are important sources of fuel. Many studies have focused on their flame retardancy by using additive flame retardants, but few of them have studied the influence of the morphology of filled polymer blends on the thermal stability and the fire behavior. This thesis follows a previous project which demonstrated a significant influence of the morphology on the fire behavior of a binary polymer blend (PC / PBT). It aims to improve the understanding of this influence in the case of more complex formulations (ternary or quaternary) with ethylene methylacrylate (EMA) matrix. The first strategy was the identification of a flame retardant system including polyester that is able to char when a flame retardant is added. Once the system is identified (PBT + MDH), it was incorporated in EMA matrix by varying the composition and the morphology (selective dispersion, particle size ...). This approach showed significant differences between the different formulations and very interesting results have been obtained in terms of fire reaction at the laboratory scale. However, the scale-up approach (flame spread test) did not validate these formulations for cables applications. Therefore, the last part has been proposed to try to improve the cohesion of the residue by adding ammonium polyphosphate.