Leveduras do gênero Dekkera/Brettanomyces causam sérios problemas ao vinho, afetando as propriedades sensoriais do produto final. O objetivo deste trabalho foi investigar a capacidade de duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae em inibir a atividade de Brettanomyces custersianus na vinificação em tinto e durante a fase inicial de envelhecimento, assim como investigar a capacidade deste microrganismo (Br. custersianus) em inibir a atividade metabólica de Sacch. cerevisiae. Foram realizadas vinificações com 4 inoculações diferentes. O tratamento 1 (T1) foi inoculado com a linhagem neutra Sacch. cerevisiae EMBRAPA 1vvt/97, T2-Sacch. cerevisiae EMBRAPA 91B/84 killer, T3-EMBRAPA 1vvt/97 e Br. custersianus, T4-EMBRAPA 91B/84 killer e Br. custersianus e T5-Br. custersianus. Também foram realizados, testes de velocidade fermentação, inibição ou estímulo do metabolismo e tolerância ao SO2. Durante a fase tumultuosa realizaram-se análises de açúcares redutores totais e etanol. Observou-se que durante todo o período da fermentação, o consumo de substrato de T1 e T2 foi mais rápido, do que em T3 e T4. A velocidade de fermentação da Br. custersianus (T5) foi muito inferior às demais linhagens. Mesmo com uma velocidade de crescimento baixa, a linhagem contaminante quando inoculada juntamente com Sacch. cerevisiae retarda a fermentação tumultuosa, podendo comprometer o processo de vinificação. Br. custersianus (T5) não teve sua atividade metabólica afetada na presença de 125 mg/L de SO2, logo conclui-se que as concentrações normalmente utilizadas no processo de vinificação, 30 a 70 mg/L, não seriam suficientes para impedir sua atividade. / Dekkera/Brettanomyces yeasts cause serious problems to the wine, affecting the sensorial properties of the final product. The objective of this work was to investigate the capacity of two strains of Saccharomyces cerevisiae in inhibiting the activity of Brettanomyces custersianus in the vinification in red wine and during the early stage of aging of the wine, as well as to investigate the ability of this microorganism (Br. custersianus) to inhibit metabolic activity of Saccharomyces cerevisiae. Vinifications were performed with 4 different inoculations. Treatment 1 (T1) was inoculated with the neutral strain Sacch. cerevisiae EMBRAPA 1vvt/97, T2-killer Sacch. cerevisiae EMBRAPA 91B/84, T3-EMBRAPA 1vvt/97 and Br. custersianus, T4-EMBRAPA 91B/84 and Br. custersianus and T5-Br. custersianus. There were also carried out tests of speed fermentation, inhibition or stimulation of metabolism and tolerance to SO2. During the tumultuous phase analysis was performed of total reducing sugars and ethanol. It was observed that throughout the period of fermentation, the substrate consumption in T1 and T2 was faster than in T3 and T4. The speed of fermentation of Br custersianus (T5) was much lower than the other strains. Even with a low rate of growth, the strain contaminant when inoculated with Saccharomyces cerevisiae. delays the tumultuous fermentation, being able to compromise the vinification process. Br. custersianus (T5) did not have its metabolic activity affected in the presence of 125 mg/L of SO2, then it was concluded that the concentrations normally used in the vinification process, 30 to 70 mg/L, would not be enough to prevent their activity.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T05:54:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 296892.pdf: 2488839 bytes, checksum: 83b3fff2eb0a03668a2e0db01a998a09 (MD5) / Leveduras Saccharomyces têm sido utilizadas em processos biotecnológicos para produção de etanol, graças à capacidade de adaptação ao ambiente industrial e à habilidade de fermentar açúcares. Com o intuito de otimizar o processo fermentativo de produção de álcool combustível, foi realizada a caracterização fenotípica e genotípica de linhagens industriais produtoras de etanol combustível no Brasil. Todas as cepas analisadas apresentaram capacidade de utilizar e fermentar maltose, indicando funcionalidade dos genes MAL. Em relação à utilização de maltotriose vários fenótipos foram observados. Algumas cepas apresentaram utilização lenta ou tardia deste açúcar, enquanto que outras foram incapazes de utilizar esta fonte de carbono. Todas a cepas apresentaram apenas o gene SUC2 no cromossoma IX, além de vários genes MALx1 no genoma. Enquanto que algumas linhagens não apresentaram o gene AGT1 no genoma, outras apresentaram pelo menos uma cópia no cromossomo VII, embora este gene, aparentemente, não seja funcional nestas linhagens industriais. Após substituição de uma cópia do gene SUC2 do genoma diplóide da levedura industrial CAT-1 com um módulo de transformação contendo um gene marcador (KanMX6), obtido do genoma de uma levedura de laboratório já modificada, verificou-se que a linhagem geneticamente modificada EDH-04 apresentava aproximadamente metade da atividade invertase, mas continuava consumindo e fermentando a sacarose do meio como sua parental, indicando que a atividade invertase não é o fator limitante na fermentação deste açúcar. A seguir, foi desenvolvido um novo módulo de transformação para substituir o gene SUC2 do genoma de leveduras utilizando o gene AGT1 (sob controle de um promotor constitutivo) como marcador. Espera-se que esta estratégia, incluindo o uso de regiões flanqueadoras longas, permita obter linhagens industriais brasileiras utilizadas na produção de álcool combustível sem atividade invertase, porém com transporte e hidrólise intracelular do açúcar pelas células, permitindo eficiente fermentação de sacarose por S. cerevisiae.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-11-17T03:11:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336047.pdf: 2532161 bytes, checksum: eb3193d707e6ab5dead059b772dd0565 (MD5) Previous issue date: 2015 / Saccharomyces cerevisiae é o principal micro-organismo produtor de etanol, empregado no Brasil. Devido a alta capacidade de adaptação a processos contínuos de produção, esse fungo possui caracterização genética muito bem definida, viabilizando otimizações de isoenzimas. Uma vez que alta concentração de glicose no meio reacional inibe-o, modificações genéticas foram realizadas a fim de que a sacarose fosse incorporada e submetida à hidrólise enzimática intracelular, obtendo glicose e frutose, evitando também contaminações e reduzindo a produção de células. Quantificou-se tais modificações pela Análise de Controle Metabólico (MCA). As entradas de glicose, via difusão facilitada (HXT) ou pelo simporte de sacarose (ATPase) e posterior hidrólise desta, foram avaliadas pelos coeficientes de controle dessas respectivas enzimas. Através das elasticidades de glicose intracelular, frutose-6- fosfato, quantificou-se localmente a influência de NAD e ATP em enzimas reguladoras e produtoras de compostos de interesse. Logo, a preferência entre rotas metabólicas foi identificada pela relação entre tais influências globais e locais, através dos coeficientes de resposta particionado, revelando quantitativamente a contribuição da permease no saldo energético e seu efeito consequente na rede metabólica. A interdisciplinaridade realizada entre MCA e Análise Dinâmica revelou o ganho de processo como uma elasticidade dimensional discreta. Dessa forma, perturbações em degrau na glicose extracelular revelaram as contribuições locais do substrato em cada reação do modelo estruturado, provando que esse recurso in silico deve ser usado paralelamente a análises cinéticas microbianas, para orientar a pesquisa e descrever a lógica metabólica pela técnica da MCA.<br> / Abstract : Saccharomyces cerevisiae is the most useful microorganism in Brazilian ethanol production. Because of its great ability in adaptation to continuous process, this fungus has a complete genetic characterization, allowing optimization of isoenzymes. Once high glucose concentration on reaction media inhibits it, genetic modifications were done in order to embody sucrose and hydrolyze it, freeing glucose and fructose, also avoiding contamination and reducing cell production. Such modifications were quantified by Metabolic Control Analysis (MCA). Glucose incomings, through facilitated diffusion (HXT) or sucrose symport (ATPase) and then its hydrolysis, were evaluated by their respective control coefficients. Through elasticities of intracellular glucose, fructose 6-phosphate, local influences of NAD and ATP over regulatory enzymes and high-value metabolite production were quantified. Therefore, the preference among metabolic routes was identified by the partitioned response coefficients, which are relations between local and global influences, uncovering quantitatively the permease contribution to energetic balance and then its effect at metabolic web. The interdisciplinarity between MCA and Dynamic Analysis defines the static gain as a dimensional and discrete elasticity. In order that, degree perturbations at extracelllular glucose reveal the substrate local contributions at each reaction defined on the estructured model, proving that in silico source must be used with microbian kinetic analysis, guiding the research and unveil the metabolic logic through MCA principles.

BATISTA, A. B. Potenciais fungicida e inseticida de proteínas presentes em sementes de Dioclea megacarpa Rolfe. 2009. 125 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-09-30T20:59:28Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_abbatista.pdf: 1701467 bytes, checksum: abfe96b694704dbc9dc0aed6b729f9f6 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-10-01T18:50:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_abbatista.pdf: 1701467 bytes, checksum: abfe96b694704dbc9dc0aed6b729f9f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-01T18:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_abbatista.pdf: 1701467 bytes, checksum: abfe96b694704dbc9dc0aed6b729f9f6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Dioclea megacarpa Rolfe é usada como sinonímia de D. relexa var. grandiflora, uma espécie pertencente à família Fabaceae (Leguminosae). Estudos prévios, realizados por nosso grupo de pesquisa, demonstraram a presença em suas sementes de proteínas ativas contra fungos fitopatogênicos, dentre esses Aspergillus niger. Assim, o presente trabalho foi proposto no intuito de avaliar a bioatividade de proteínas de sementes de D. megacarpa contra fungos, conduzindo à sua purificação e caracterização parcial, bem como à investigação de seu mecanismo de ação. Outro objetivo deste trabalho foi examinar o potencial inseticida da lectina com especificidade por glucose-manose, isolada de sementes de D. megacarpa (Moreira et al., 1983), contra o bruquídeo do feijão-caupi Callosobruchus maculatus. Para tanto, farinha de sementes foi posta em contato com NaCl 0,15 M (1:5, p/v), seguida de agitação contínua por 3 h, filtração em pano de trama fina, re-extração por 1 h e centrifugação a 11.500 x g, 30 min, 4 oC. O sobrenadante obtido, denominado de extrato total, se mostrou ativo contra A. niger e apresentou várias proteínas bioativas, compreendendo lectina (129,27 UH/mgP, com eritrócitos tripsinizados de coelho), inibidor de tripsina (18,91 mg de tripsina inibida/gF), urease (47,50 U/gF), toxina (DL50 119,60 mgP/Kg de peso corpóreo de camundongo), quitinase (1,66 nKat/mgP) e β-1,3-glucanase (0,55 nKat/mgP). Por outro lado, atividades peroxidásica e proteolítica não foram detectadas. Para purificação da proteína antifúngica, foram realizadas cromatografias em matrizes de Sephadex G-50, Quitina e Resource-Q, essa última acoplada ao sistema de FPLC. A proteína antifúngica purificada de sementes de D. megacarpa, denominada de Dm-PAF, com massa molecular aparente de 67-68 kDa (PAGE-SDS), não mostrou atividades hemaglutinante e quitinásica e apresentou sua seqüência NH2-terminal bloqueada. Dm-PAF, em concentração baixíssima (0,015 µgP/µL), se mostrou capaz de inibir o crescimento das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida tropicalis, cuja investigação do mecanismo de ação não revelou envolvimento dessa proteína com bombas de H+-ATPase. Em adição, a lectina ligante a glucose-manose, obtida na cromatografia em Sephadex G-50, mostrou potente atividade inseticida contra C. maculatus, interferindo em parâmetros importantes relacionados ao ciclo de vida do inseto. Os dados apresentados mostram as sementes de D. megacarpa como uma rica fonte de proteínas interessantes, possivelmente envolvidas no mecanismo de defesa das plantas. / Dioclea megacarpa Rolfe is the correct synonym for D. relexa var. grandiflora. This species belongs to Fabaceae, the legume family. Previous studies, realized in our research group, showed the presence of active proteins for several phytopathogenic fungi in the seeds of this species, among of them Aspergillus niger. Thus, the present work was proposed with the objective of determining the bioactivity of protein(s) from D.megacarpa seeds against fungi, leading to its/their purification and partial characterization and further investigation of its/their action mechanism. Another approach of this work it was analyze the insecticidal potential of glucose/mannose-specific lectin, isolated from D.megacarpa seeds (Moreira et al., 1983), against the cowpea bruchid Callosobruchus maculatus. For this, seed flour was placed in contact with 0.15 M NaCl (1:5, w/w), followed by stirring for 3 h, filtration through a nylon cloth, re-extraction for 1 h, centrifugation at 11,500 x g, for 30 min, at 4 oC. The supernatant obtained, named total extract, showed antifungal activity against A. niger and presented several bioactive proteins, including lectin (129.27 UH/mgP, using trypsinized rabbit erythrocytes), trypsin inhibitor (18.91 mg de tripsina inibida/gF), urease (47.50 U/gF), toxin (LD50 119.60 mgP/Kg mice body weight ), chitinase (1.66 nKat/mgP) e β-1,3-glucanase (0.55 nKat/mgP). On the other hand, peroxidasic and proteolytic activities were not detected. For purification of antifungal principle, several chromatographies were performed on Sephadex G-50, Chitin and Resource Q, this last connected to an FPLC system. The purified antifungal protein, named Dm-PAF, with apparent molecular mass of 67-68 kDa (SDS-PAGE), did not show any haemagglutinating or chitinolytic activity and presented its NH2-terminal sequence blocked. Dm-PAF, at a very low concentration (0.015 µgP/µL), it was able to inhibit the growth of Saccharomyces cerevisiae and Candida tropicalis yeasts. The investigation of the antifungal action mechanism excluded the possibility of interaction between Dm-PAF and H+-ATPase pumps. In addition, the glucose/mannose-specific lectin, obtained from Sephadex G-50 column, exhibited a potent insecticidal activity against C. maculatus, interfering in important parameters related to life cycle of this insect. These data show to be the D. megacarpa seeds a rich source of biologically interesting proteins, possibly involved in the defense mechanism of plants.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2017 / Made available in DSpace on 2017-09-05T04:13:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347265.pdf: 1526198 bytes, checksum: adeecf9682013839161cd5fac4bd2a12 (MD5) Previous issue date: 2017 / Uma das vantagens da utilização de células imobilizadas em processos fermentativos é a facilidade de separação da célula do meio de cultivo. As alterações que a imobilização causará no crescimento celular ou na atividade metabólica das células são imprevisíveis. Como suporte de imobilização celular, utiliza-se amplamente o alginato de cálcio. A utilização de material magnético em imobilização se destaca pela sua utilização em reatores de leito fluidizados estabilizados magneticamente, configuração esta, que permite grande flexibilidade operacional. Sendo assim, o presente trabalho possui como objetivo geral a imobilização celular por aprisionamento em alginato de cálcio da levedura Saccharomyces cerevisiae com nanopartículas magnéticas de magnetita. Após a síntese da magnetita, constatou-se a escala nano das partículas por microscopia eletrônica de transmissão. Para a etapa de imobilização celular preparou-se 10 mL de solução de alginato de sódio e adicionou-se as partículas magnéticas e Saccharomyces cerevisiae. Esta mistura foi gotejada na solução de cloreto de cálcio, formando-se assim, as esferas de células imobilizadas. Com base nos resultados do estudo de absorção de água pela célula imobilizada, constatou-se que a absorção de água pela esfera não causa as rachaduras presentes no suporte durante a fermentação, concluindo que estas rachaduras são causadas pelo crescimento celular no interior da esfera. A análise da microscopia eletrônica de varredura indicou a eficiência da ligação entre as nanopartículas de magnetita, o alginato e as células de levedura. Os resultados obtidos pelo magnômetro da amostra vibrante indicaram que o alginato e a levedura não interferem nas propriedades magnéticas da magnetita, e que o suporte sintetizado neste trabalho possui propriedades magnéticas válidas para ser aplicadas em reator de leito fluidizado magneticamente estabilizado. Para a condução da fermentação alcoólica, os erlenmeyers contendo o meio e as esferas de células imobilizadas foram mantidos em incubadora por 24 h. Pela análise cinética do consumo de substrato durante a fermentação alcoólica, é possível afirmar que a presença da nanopartícula magnética no suporte não possui influência significativa no processo fermentativo. Pela análise qualitativa do estudo da influência da concentração de levedura e do teor de alginato na integridade das esferas, constatou-se pelo teste Qui-Quadrado, que apenas o teor de alginato possui evidência estatística de possuir associação com a integridade do suporte imobilizado. A análise quantitativa indicou que a variação na concentração de levedura e no teor de alginato utilizados na imobilização não interfere na produtividade da fermentação. Sendo assim, para a determinação das condições de imobilização promissoras para futuros trabalhos, considerou-se ambas as análises. As melhores condições de imobilização consideradas são 1% de alginato de sódio e 100 g L-1 de levedura, que manteve a integridade das esferas por 2 ciclos, ambos com rendimento acima de 70%; e 2% de alginato de sódio e 50 g L-1 de levedura, que manteve a integridade das esferas por 4 ciclos, porém apenas 2 ciclos resultaram em rendimento superior a 70%. / Abstract: One of the advantages of using immobilized cells in fermentative processes is the facility of cell separation from the culture medium. The changes that immobilization causes in cell growth or in cell metabolic activity are unpredictable. As cell immobilization support, the calcium alginate is largely use. The magnetic supports are distinguished by their use in magnetically stabilized fluidized bed reactors, a configuration that allows great operational flexibility. Therefore, this work has as main objective the cell immobilization by imprisonment in calcium alginate of yeast Saccharomyces cerevisiae with magnetite magnetic nanoparticles. After the magnetite synthesis, the nanoscale of the particles synthesized was determined by transmission electron microscopy. For the cell immobilization step it was prepared 10 mL of sodium alginate solution and then the magnetic particles and Saccharomyces cerevisiae were added. This mixture was dropped into the calcium chloride solution, thus forming the beads. Regarding water absorption study by the immobilized cell, it was verified that the water absorption by the beads does not induce the cracks present in the support during the alcoholic fermentation, leading to the conclusion that these cracks are caused by the cell growth inside the beads. The scanning electron microscopy indicated the bond efficiency between magnetite nanoparticles, alginate and yeast cells. The results obtained by the vibrating sample magnetometer indicated that alginate and yeast do not interfere in the magnetic properties of the magnetite, and that the support synthesized in this work has valid magnetic properties to be applied in a magnetically stabilized fluidized bed reactor. For the alcoholic fermentation, the erlenmeyer flasks containing the medium and the beads were placed in an incubator for 24 h. By the kinetic analysis of the substrate consumption during the alcoholic fermentation, it is possible to affirm that the presence of the magnetic nanoparticle in the support does not have significant influence in the fermentative process. By the qualitative analysis of the yeast concentration and the alginate content influence study on the beads integrity, it was verified by the Chi-Square test that only the alginate content has statistical evidence of having an association with the integrity of the immobilized support. The quantitative analysis indicated that the variation in yeast concentration and alginate content used in immobilization does not interfere in the fermentation productivity. Thus, both analyzes were considered for the determination of the promising immobilization conditions for future work. The best immobilization conditions considered are 1% of sodium alginate and 100 g L-1 of yeast, condition that maintained the beads integrity for 2 cycles, both with yield above 70%; and 2% of sodium alginate and 50 g L-1 of yeast, which maintained the beads integrity for 4 cycles, but only 2 cycles resulted in yields above 70%.

O vinho é a bebida obtida por meio da fermentação alcoólica do mosto simples de uva sã, fresca e madura. Durante o processo fermentativo, realizado por leveduras Saccharomyces cerevisiae, ocorre uma sucessão de microrganismos. Espécies pertencentes aos gêneros Brettanomyces e Dekkera permanecem no produto final podendo influenciar de forma negativa ao produzirem compostos fenólicos voláteis. Estas leveduras apresentam como uma de suas características a lenta taxa de crescimento. Com isto, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de meio de cultivo para isolamento e detecção destas leveduras e de metodologia molecular para detecção independente de cultivo. O meio de cultivo desenvolvido permitiu o isolamento e também a diferenciação de leveduras dos gêneros Brettanomyces e Dekkera das demais leveduras comumente encontradas em vinho. Uma metodologia molecular, baseada em PCR convencional, foi desenvolvida para a detecção dos gêneros em vinhos. Inicialmente foram construídos dois pares de oligonucleotídeos. Um par universal para leveduras e outro específico para D. bruxellensis. O primeiro par apresentou ampla aplicabilidade na avaliação da efetividade de diferentes processos de extração de DNA e na detecção de compostos inibidores presentes em amostras de vinho. A utilização de ambos os pares permitiu o desenvolvimento de um protocolo de extração e amplificação de DNA diretamente de amostras de vinho, facilitando a identificação de leveduras D. bruxellensis e permitindo a tomada de decisão em tempo hábil de evitar perdas econômicas. / The wine is a beverage obtained by alcoholic fermentation of simple must of healthy, fresh and mature grape. During the fermentation process, carried out by Saccharomyces cerevisiae yeasts, these is a succession of microorganisms. Species belonging to the genera Brettanomyces and Dekkera remain in the final product can influence negatively by producing volatile phenolic compounds. These yeasts present as one the features of the slow rate of growth. This work aimed at the development of culture media for isolation and detection of these strains and molecular methods for detection of independent culture. The medium developed also allowed the isolation and differentiation of yeasts of the genera Brettanomyces and Dekkera yeasts from other commonly found in wine. A molecular approach, based on conventional PCR, was developed for the detection of genera in wines. Initially we constructed two sets of primers. A universal pair for yeast and other specific for D. bruxellensis. The first pair showed a broad applicability in evaluating the effectiveness of various procedures for DNA extraction and detection of inhibitory compounds present in wine samples. The use of both pairs allowed development of a protocol for extracting and amplifying DNA directly from wine samples, facilitating the identification of yeasts D. bruxellensis and allowing the decision-making in a timely manner to avoid economic losses.

Nos últimos anos, é crescente a busca por tecnologias que permitam que a produção de álcool gerado a partir de fontes renováveis substitua os principais combustíveis utilizados atualmente, que são provenientes do petróleo. A utilização dos resíduos gerados a partir dos processos agrícolas, que são ricos em açúcares, é uma alternativa para a produção de bioetanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Os processos utilizados com esse fim, como a hidrólise ácida diluída, geram uma diversidade de açúcares (pentoses e hexoses), como glicose, manose, xilose e arabinose. Além dos açúcares, ocorre a geração de compostos tóxicos às células, como furfural, 5-hidroximetilfurfural (HMF), compostos fenólicos e ácidos orgânicos, e também alta pressão osmótica. Além disso, S. cerevisiae não é capaz de utilizar pentoses como fonte de carbono para fermentação, e a viabilidade econômica desse processo depende da conversão quase total de todos os açúcares a etanol. Com isso é necessário o uso de linhagens fermentadoras de pentoses e hexoses que sejam resistentes às toxinas geradas, para que o hidrolisado seja utilizado sem um processo prévio de destoxificação. Nesse trabalho, foi obtida por engenharia evolutiva uma linhagem de de S. cerevisiae resistente ao HMF, nomeada P6H9. Foi avaliada a indução da expressão gênica na presença de HMF e observou-se que os genes ADH7 E ARI1 são responsáveis pela resistência a esse composto. Também foi possível observar que as mudanças no metabolismo dessa levedura para destoxificação do meio não possibilitam o aumento na produção de etanol. Também foi obtida uma linhagem da levedura fermentadora de pentoses Wickerhamomyces anomalus resistente a furfural e HMF, nomeada WA-HF5,5. Foi possível definir a grande importância das enzimas álcool desidrogenases na destoxificação desses compostos. Finalmente, essas duas leveduras foram avaliadas quanto à capacidade de produção de etanol em hidrolisados lignocelulósicos de casca de soja e casca de arroz, isoladamente, ou em sistemas de co-cultivos em frascos agitados. As melhores produtividades em etanol foram apresentadas em hidrolisado de casca de arroz, e os cultivos foram escalonados para sistemas de biorreatores. Foi observado que o sistema de co-cultivo possui vantagens e grande potencial para a produção de etanol de segunda geração. / In recent years, there is a crescent interest for technologies that enable the production of alcohol originated from renewable sources, in replacement of the fossil fuels. The use of waste generated from agricultural processes, which are rich in sugars, is an alternative for the production of bioethanol by the yeast Saccharomyces cerevisiae. The processes used for this purpose, such as dilute acid hydrolysis, releases a diversity of sugars (pentoses and hexoses), such as glucose, mannose, xylose and arabinose. In addition to sugars, toxic compounds to cells are also generated, such as furfural, 5-hydroxymethylfurfural (HMF), phenolic compounds, organic acids, and also high osmotic pressure. The economic feasibility of the process depends of the complete conversion of major sugars present ih the medium to ethanol. As S. cerevisiae is not able to metabolize pentoses, it is necessary to use strains that ferment pentoses and hexoses to ethanol, which are resistant to the toxins formed, in order to the hydrolyzate be fermented without previous detoxification processes.In this work, a strain of S. cerevisiae resistant to HMF, named P6H9, was obtained by evolutionary engineering. It was observed that the ARI1 and ADH7 genes are responsible for HMF resistance. It was also observed that the detoxification process causes changes in the metabolism of this yeast. Because of that, it is not possible increase the ethanol production. A strain of the fermenting pentoses yeast Wickerhamomyces anomalus was also obtained by evolutionary engineering, that is resistant to furfural and HMF. This strain is named WA-HF5, 5. On physiological evaluations, it was clear that alcohol dehydrogenase activity possesses importance in furaldehydes detoxification. Finally, the ability of these two strains produce ethanol in lignocellulosic hydrolysates was investigated. Best yields of ethanol were presented in rice hull hydrolysate. It was observed that the co-culture system shows advantages and have potential for the production of second generation ethanol.

O Ácido Valproico (AV) é um fármaco antiepiléptico amplamente utilizado. Além disso, estudos recentes demonstram interessantes atividades antitumorais do AV contra diferentes tipos de tumores relacionado a sua atividade no remodelamento da cromatina. Entretanto, o uso do AV em pacientes possui limitações devido à sua reconhecida toxicidade sistêmica. Desta forma, é reforçada a necessidade do descobrimento de novos medicamentos com menor toxicidade e/ou maior efeito terapêutico. Para tanto, a estratégia mais sensata e econômica para se obter novos fármacos consiste em modificar quimicamente drogas já conhecidas. A síntese de complexos metálicos é uma abordagem recente para a obtenção de fármacos. Assim, neste trabalho foi analisado a citotoxicidade, mutagenicidade para o valproato de sódio (NaValp) e complexos de AV com Cu(II), Mg(II), 1,10-fenantrolina (Phen): [Cu2(Valp)4], [Cu(Valp)2Phen] e [Mg(Valp)2Phen] na levedura Saccharomyces cerevisiae proficientes e deficientes em vias de reparo de excisão de base – BER (apn1Δ, apn2Δ, ogg1Δ, rad27Δ, ntg1Δ, ntg2Δ mag1Δ), de excisão de nucleotídeos – NER (rad1Δ, rad4Δ, rad10Δ, rad14Δ), síntese de translesão – TLS (rev1Δ, rev3Δ, rad30Δ), reparação pós-replicação – PRR (rad6Δ, rad18Δ), recombinação homóloga – HR (rad52Δ) e junção final não homóloga – NHEJ (rad50Δ). Os resultados indicam que os complexos organometálicos têm maior citotoxicidade e são mais mutagênicos do que NaValp em fase de crescimento da levedura. Nos ensaios de mutagênese, não houve indução de mutação com NaValp, e os complexos organometálicos induziram substituições de pares de bases, identificadas pelo aumento da frequência de mutação nos loci his1 e lys1 na linhagem XV185-14C. As linhagens deficientes em proteínas da via BER foram sensíveis ao NaValp. Além disso, os danos no DNA causados pelo NaValp também podem ser tolerados pelas vias NER e TLS. As vias BER, NER, TLS, PRR e HR contribuíram com a tolerância ao dano induzido pelos complexos de cobre. O dano ao DNA induzido pelo complexo [Mg(Valp)2Phen] pode ser tolerado pelas vias NER, TLS, PRR, HR e NHEJ, enquanto a presença de endonucleases de BER resulta em morte celular. Desta forma, nosso estudo revela uma importante contribuição das vias de reparo do DNA sobre a sensibilidade ao NaValp e aos complexos organometálicos, indicando sua potencial aplicação como agentes citotóxicos. Os mecanismos de reparação diferiram para os compostos, sugerindo que induzem diferentes lesões no DNA. / Valproic Acid (VA) is an antiepileptic drug largely used. In addition, recent studies present interesting antitumor activities of VA against different types of tumors related to its activity in chromatin remodeling. However, the use of VA in patients has limitations due to its recognized systemic toxicity. Thus, it is necessary to discover new drugs with less toxicity and/or greater therapeutic effect. For that, the most sensible and economical strategy to obtain new drugs is to chemically modify known drugs. The synthesis of metal complexes is a recent approach to obtaining drugs. Therefore, the cytotoxicity and mutagenicity were analyzed for sodium valproate (NaValp) and VA complexes with Cu(II), Mg(II) and 1,10-phenantroline (Phen): [Cu2(Valp)4], [Cu(Valp)2Phen] and [Mg(Valp)2Phen] in Saccharomyces cerevisiae strains deficient in repair pathways, like base excision repair – BER (apn1Δ, apn2Δ, ogg1Δ, rad27Δ, ntg1Δ, ntg2Δ mag1Δ), nucleotide excision repair – NER (rad1Δ, rad4Δ, rad10Δ, rad14Δ), translesion synthesis – TLS (rev1Δ, rev3Δ, rad30Δ), post replicative repair – PRR (rad6Δ, rad18Δ), homologous recombination – HR (rad52Δ) e non-homologous end joining – NHEJ (rad50Δ). The results show that the organometallic complexes have higher cytotoxicity and are more mutagenic than NaValp in yeast growth phase. In the mutagenesis assay, there was not induction of mutation by the NaValp, whereas the organometallic complexes induced base pair substitutions, identified by the increase of mutation frequency in his1 and lys1 loci in the XV185-14C strain. The protein-deficient strains of the BER pathway were sensitive to NaValp. In addition, NER and TLS pathways can also tolerate DNA damage caused by NaValp. The BER, NER, TLS, PRR and HR pathways contributed to the damage tolerance induced by the copper complexes. DNA damage induced by [Mg(Valp)2Phen] complex can be tolerated by the NER, TLS, PRR, HR and NHEJ pathways, while the presence of BER endonucleases results in cell death. In this way, our study reveals an important contribution of the DNA repair pathways on sensitivity to NaValp and organometallic complexes, indicating the potential application as cytotoxic agents. The repair mechanisms are distinct for the compounds, suggesting that different lesions are induced in the DNA.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnologico / Made available in DSpace on 2016-01-08T19:20:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 101469.pdf: 9050869 bytes, checksum: 333d51f5dc75c2d617641b5544d4135b (MD5) Previous issue date: 1995 / O trabalho visa a maximização da produção de Saccharomyces cerevisiae, em um processo fed-batch, fazendo o controle do etanol produzido na fermentação. Nos experimentos, utilizou-se um sensor à membrana colocado no reator e acoplado a um cromatógrafo em fase gasosa. O sistema é ligado a um microcomputador, o qual quantifica o etanol produzido durante o processo. A partir deste dado, emprega-se uma estratégia de controle, manipulando-se a alimentação do principal substrato carbonado, a glicose. Os resultados obtidos experimentalmente revelam um aumento considerável da produção da levedura.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-04-15T13:16:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337882.pdf: 2441331 bytes, checksum: ce3356aff8c74def3834a04f62b8f3bf (MD5) Previous issue date: 2015 / Na produção de etanol de segunda geração o transporte dos açúcares para o interior da levedura Saccharomyces cerevisiae constitui um passo limitante, principalmente no caso da pentose xilose, o segundo açúcar mais abundante na biomassa lignocelulósica. Para caracterizar o efeito de diferentes transportadores na fermentação de xilose, neste trabalho foi utilizada uma linhagem hxt-null de S. cerevisiae (hxt1-hxt7? e gal2?), mas capaz de metabolizar xilose devido à sobre-expressão dos genes XYL1, XYL2 e XKS1 que codificam as enzimas xilose redutase, xilitol desidrogenase e xilulocinase, respectivamente. Essa linhagem hxt-null foi utilizada para expressar transportadores de S. cerevisiae e de leveduras fermentadoras de xilose Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae e Spathaspora passalidarum. Os resultados indicam que nenhuma das permeases de S. cerevisiae analisadas (Hxt1, Hxt2, Hxt5 e Hxt7) possui propriedades adequadas para captação de xilose, quando esta é a única fonte de carbono ou em misturas de xilose/glicose. Uma biblioteca genômica de S. stipitis foi inserida na linhagem hxt-null, resultando na clonagem de três permeases que realizam o transporte de xilose: o já conhecido transportador Xut1 e duas novas permeases (Hxt2.6 e Qup2) que ainda não tinham sido caracterizadas nessa levedura. No entanto, nenhuma dessas proteínas mostrou-se específica para xilose, pois também captam hexoses presentes no meio. O genoma sequenciado das leveduras S. arborariae e S. passalidarum foi analisado na busca por genes com homologia à transportadores de xilose, e três genes selecionados foram clonados e expressos na linhagem hxt-null. Desses, apenas a permease Sut1 de S. passalidarum realizou transporte de xilose (além de outras hexoses) e, quando o gene HXT4 de S. arborariae era expresso, não houve consumo ou fermentação de nenhum dos açúcares testados. Outra permease dessa levedura (Get1) apresentou uma característica peculiar, ocorrendo a captação de xilose apenas quando maltose ou outras fontes de carbono estavam presentes. Os resultados indicam que a caracterização de novos transportadores de açúcares presentes no genoma de leveduras fermentadoras de xilose é necessária para desenvolver novas estratégias para otimizar a fermentação de hidrolisados lignocelulósicos por linhagens de S. cerevisiae recombinantes.<br> / Abstract : The internalization of sugars in Saccharomyces cerevisiae during second generation ethanol production is a limiting step, primarily because of xylose, the second most abundant sugar in lignocellulosic biomass. To typify the influence of different transporter in the xylose fermentation, in this work it was used a hxt-null S. cerevisiae strain, deleted in its main hexoses permeases (hxt1-hxt7? e gal2?), but capable of metabolize xylose, due to the overexpression of genes XYL1, XYL2 and XKS1, that code of the enzymes xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulokinase. This hxt-null strain was used to express transporters from the genome of S. cerevisiae and from xylose-fermenting yeasts Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae and Spathaspora passalidarum. The results show that none of the S. cerevisiae permeases analyzed (Hxt1, Hxt2, Hxt5 and Hxt7) had properties suitable for xylose fermentation or xylose/glucose mixtures. In order to obtain new transporters, a genomic library from S. stipitis was transformed into the hxt-null strain, which resulted in cloning three permeases that allowed growth and fermentation of xylose: the already known Xut1, and two new permeases (Hxt2.6 and Qup2) that were not characterized before in this yeast. However, none of these proteins was specific for xylose, since they also allowed efficient fermentation of hexoses in the hxt-null strain. Regarding S. arborariae and S. passalidarum, both yeasts had their genome sequenced and were used to search genes homologues to xylose transporters. Three gene selected were cloned and expressed in the hxt-null S. cerevisiae strain. Of these permeases coded, only Sut1 from S. passalidarum restored xylose (and hexoses) fermentation, and when HXT4 from S. arborariae was expressed, there were no uptake or fermentation of any sugar tested. Another permease from this yeast (Get1) had a peculiar characteristic: it consumed xylose only in co-fermentation, with maltose or other carbon source. The results indicate that the characterization of new sugar transporters present in the genome of xilose-fermenting yeasts is needed to develop new strategies to optimize lignocellulosic hydrolisates fermentations by recombinants S. cerevisiae strains.