A identificação de novos alvos para controlar o processo inflamatório é, provavelmente, o principal desafio que dificulta o desenvolvimento de novas drogas anti-inflamatórias. Assim, a modulação das vias de sinalização intracelulares em fagócitos desponta como uma forma interessante de alcançar este objetivo. No entanto, isso pode trazer como consequência a diminuição da defesa do hospedeiro contra patógenos. Este estudo teve como objetivo examinar se o nitróxido 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (Tempol) exerce efeito sobre produção de oxidantes por neutrófilos inflamatórios através da regulação da atividade de proteínas quinases e da proteína dissulfeto isomerase (PDI), uma chaperona cujos sítios ativos contêm o motivo Cys-Gly-His-Cys (CXXC) e está envolvida na montagem do complexo enzimático NADPH oxidase (Nox2) de fagócitos. Vias bioquímicas diferentes foram ativadas para a liberação de espécies reativas de oxigênio por neutrófilos inflamatórios, e, paralelamente, a atividade de proteínas quinases foi determinada sob efeito de Tempol nos fagócitos. O nitróxido inibiu significativamente o burst oxidativo dos neutrófilos de maneira dependente da concentração. Este efeito foi detectado pelo consumo de oxigênio, onde a IC50 encontrada foi de 45±4 μM. Utilizando-se ensaios de quimioluminescência dependente de luminol ou de isoluminol, mostramos que o Tempol provocou um atraso no período de resposta latente da ativação de Nox2 dos neutrófilos sob diferentes estímulos. Coerentemente, o nitróxido inibiu a atividade de proteínas quinases de neutrófilos estimuladas por diferentes vias bioquímicas, como quantificado por ensaios quimioluminescentes e por teste dot blot. Nas mesmas condições, Tempol reduziu a atividade fungicida de neutrófilos contra Candida albicans. Na presença de Tempol a atividade redutase de PDI foi reversivelmente afetada tanto in vitro como em neutrófilos inflamatórios estimulados, cuja IC50 de 35±3,3 μM foi calculada através de metodologia de espectrofluorescência. Esta atividade inibitória foi confirmada com o método espectrofotométrico de enovelamento de insulina. Foi utilizada PDI recombinante para ser estudado o mecanismo de inibição que o Tempol exerce sobre a esta tiol óxido-redutase, através de espectrometria de massa. Na análise da proteína total, 1 e 4 moléculas de Tempol foram detectadas ligadas à proteína. No entanto, somente uma molécula do nitróxido foi encontrada ligada covalentemente à PDI. Mais especificamente, a Cys400 foi modificada por Tempol. Em conjunto, os resultados revelam um novo mecanismo do Tempol sobre a regulação de enzimas associadas à atividade do complexo Nox2 de neutrófilos inflamatórios, os quais apresentam aplicações clínicas potenciais para intervenção terapêutica em processos patológicos. Entretanto, o possível uso do Tempol como agente anti-inflamatório deve ser cauteloso, uma vez que este nitróxido diminuiu a resposta microbicida de neutrófilos. / The identification of new targets for controlling inflammatory processes is, almost certainly, the major challenge that hampers the development of new anti-inflammatory drugs. Thus, the modulation of intracellular signaling pathways in phagocytes emerges as an interesting way to achieve this goal. However, this strategy can bring the effect of lowering the host defense against pathogens. This study aimed to examine whether the nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (Tempol) has an effect on production of oxidants by inflammatory neutrophils through regulation of protein kinase activity and protein disulfide isomerase (PDI), a chaperone whose active sites containing the motif Cys-Gly-His-Cys (CXXC) and is involved in the assembly of the NADPH oxidase enzyme complex (Nox2) on phagocytes. Different biochemical pathways were activated for the release of reactive oxygen species by inflammatory neutrophils, and, in parallel, the protein kinase activities were determined under Tempol treatment of phagocytes. The nitroxide significantly inhibited oxidative burst of neutrophils in a concentration dependent manner. This effect was detected by oxygen consumption, where the IC50 was found to be 45±4 µM. By means of chemiluminescence luminol- or isoluminol-dependent assay, we showed that Tempol caused a delay in the lag period of neutrophils Nox2 activation under different stimuli. Accordingly, the nitroxide inhibited the activity of protein kinases in neutrophils stimulated by various biochemical pathways, as quantitated by chemiluminescent assays and dot blot test. Under the same conditions, Tempol reduced neutrophil fungicidal activity against Candida albicans. In the presence of Tempol, PDI reductase activity was reversibly affected both in vitro and in stimulated inflammatory neutrophils, whose IC50 of 35±3.3 µM was calculated by fluorescent methodology. This inhibitory activity was confirmed by the spectrophotometric insulin method. Recombinant PDI was used for the purpose of studying the mechanism of inhibition that Tempol exerts on this thiol oxide reductase enzyme, by mass spectrometry. In the analysis of total protein, 1 and 4 molecules of Tempol were detected bound to the protein. However, only one molecule of the nitroxide was found covalently linked to PDI. More specifically, Cys400 has been changed by Tempol. Together, these results reveal a novel mechanism of Tempol on the regulation of enzymes associated with Nox2 complex inflammatory activity of neutrophils, which have potential clinical applications for therapeutic intervention in pathological processes. However, the promising use of Tempol as an anti-inflammatory agent must be taken with caution, since this nitroxide decreased neutrophil microbicidal response.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-11-17T03:11:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336047.pdf: 2532161 bytes, checksum: eb3193d707e6ab5dead059b772dd0565 (MD5) Previous issue date: 2015 / Saccharomyces cerevisiae é o principal micro-organismo produtor de etanol, empregado no Brasil. Devido a alta capacidade de adaptação a processos contínuos de produção, esse fungo possui caracterização genética muito bem definida, viabilizando otimizações de isoenzimas. Uma vez que alta concentração de glicose no meio reacional inibe-o, modificações genéticas foram realizadas a fim de que a sacarose fosse incorporada e submetida à hidrólise enzimática intracelular, obtendo glicose e frutose, evitando também contaminações e reduzindo a produção de células. Quantificou-se tais modificações pela Análise de Controle Metabólico (MCA). As entradas de glicose, via difusão facilitada (HXT) ou pelo simporte de sacarose (ATPase) e posterior hidrólise desta, foram avaliadas pelos coeficientes de controle dessas respectivas enzimas. Através das elasticidades de glicose intracelular, frutose-6- fosfato, quantificou-se localmente a influência de NAD e ATP em enzimas reguladoras e produtoras de compostos de interesse. Logo, a preferência entre rotas metabólicas foi identificada pela relação entre tais influências globais e locais, através dos coeficientes de resposta particionado, revelando quantitativamente a contribuição da permease no saldo energético e seu efeito consequente na rede metabólica. A interdisciplinaridade realizada entre MCA e Análise Dinâmica revelou o ganho de processo como uma elasticidade dimensional discreta. Dessa forma, perturbações em degrau na glicose extracelular revelaram as contribuições locais do substrato em cada reação do modelo estruturado, provando que esse recurso in silico deve ser usado paralelamente a análises cinéticas microbianas, para orientar a pesquisa e descrever a lógica metabólica pela técnica da MCA.<br> / Abstract : Saccharomyces cerevisiae is the most useful microorganism in Brazilian ethanol production. Because of its great ability in adaptation to continuous process, this fungus has a complete genetic characterization, allowing optimization of isoenzymes. Once high glucose concentration on reaction media inhibits it, genetic modifications were done in order to embody sucrose and hydrolyze it, freeing glucose and fructose, also avoiding contamination and reducing cell production. Such modifications were quantified by Metabolic Control Analysis (MCA). Glucose incomings, through facilitated diffusion (HXT) or sucrose symport (ATPase) and then its hydrolysis, were evaluated by their respective control coefficients. Through elasticities of intracellular glucose, fructose 6-phosphate, local influences of NAD and ATP over regulatory enzymes and high-value metabolite production were quantified. Therefore, the preference among metabolic routes was identified by the partitioned response coefficients, which are relations between local and global influences, uncovering quantitatively the permease contribution to energetic balance and then its effect at metabolic web. The interdisciplinarity between MCA and Dynamic Analysis defines the static gain as a dimensional and discrete elasticity. In order that, degree perturbations at extracelllular glucose reveal the substrate local contributions at each reaction defined on the estructured model, proving that in silico source must be used with microbian kinetic analysis, guiding the research and unveil the metabolic logic through MCA principles.

During the past 30-years, Biochemical System Theory (BST) has been provided a concrete foundation for the study of the dynamic biological systems, e.g. S-systems models for reverse engineering of metabolic networks (Savageau, 1969; Savageau, 1970; Voit, 2000). One of the remarkable characteristics of these models is its parameters not only quantify the interactions between the components of the network, but also elucidate the networks topology. Automatic procedures for S-system parameterization from biological time series have been developed by many researches, where they assume a noise-free time series and a true estimated first derivative in their methodologies (Chou, et al., 2006; Kikuchi, et al., 2003). Nevertheless, this noise-free data is not a realistic scenario of the real biological experimental world. Methods as artificial neural network (ANN), Support Vectors Machines (SVM) and Saviztsky-Golay filter were proposed to overcome the denoising time series problem with the advantage of a closed form output which allowed determining the first derivative symbolically (Almeida and Voit, 2003; Borges, et al., 2006; Borges, et al., 2004; Voit and Almeida, 2004). However, these solutions showed some problematic artifacts in its first derivative even when they are not visually apparent in the smoothed data, leaving a gap on the issue of a fully automatic method for S-system parameterization from experimental data. The algorithm presented in this work is a proposal to fill this gap up providing an unbiased robust tool for signal extraction and first derivative estimation from noisy time series. / Nos últimos 30 anos, a Teoria dos Sistemas Bioquímicos (Biochemical System Theory - BST) tem fornecido uma fundação concreta para o estudo da dinâmica de sistemas biológicos, por exemplo, Sistemas-S (S-systems) usados em engenharia reversa de vias metabólicas (Savageau, 1969; Savageau, 1970; Voit, 2000). Uma característica marcante desse tipo de modelo é que os parâmetros não só quantificam as interações entres os componentes da rede metabólica, mas também fornecem a sua topologia de regulação. Procedimentos automáticos para a parametrização dos Sistemas-S a partir de séries temporais biológicas vêm sendo desenvolvidos por vários pesquisadores, onde se assume que a série temporal e sua derivada temporal são livres de ruído. Entretando, perfis metabólicos livres de ruído não são um realistas em cenários de experimentos de biologia molecular. Técnicas como Redes Neurais Artificiais (RNA), Máquinas de Vetores de Suporte (MVP) e filtro de Saviztsky-Golay foram propostas como solução do problema de suavização dos perfis metabólicos com a vantagem da obtenção da derivada temporal simbólica (Almeida and Voit, 2003; Borges, et al., 2006; Borges, et al., 2004; Voit and Almeida, 2004). Entretanto, essas soluções apresentaram alguns artefatos problemáticos na derivada até mesmo quando nenhum problema é visualmente detectado no dado suavizado, deixando aberto um espaço vazio na questão de um método automático para a parametrização dos Sistemas-S a partir de dados experimentais. O algoritmo apresentado neste trabalho propõe preencher esse espaço com uma ferramenta robusta para a extração de sinal e de sua derivada temporal a partir de séries temporais ruidosas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos demostram que a hiperalimentação no período pós-natal causa obesidade, alterações cardiometabólicas e resistência à insulina em longo prazo. O objetivo do estudo foi investigar as consequências da hiperalimentação na lactação nos corações de camundongos filhotes e adultos ao longo do desenvolvimento. Para induzir a hiperalimentação na lactação, o tamanho da ninhada foi reduzida a 3 filhotes machos no terceiro dia, grupo hiperalimentado (GH). O grupo controle (GC) permaneceu com 9 filhotes da lactação ao desmame. Avaliamos a massa corporal, gordura epididimária e retroperitoneal, morfologia hepática e cardíaca, ultraestrutura dos cardiomiócitos, peso do PVE/CT, glicemia de jejum, triglicerídeos, colesterol total, insulina plasmática e HOMA-IR. Analisamos o consumo de oxigênio das fibras cardíacas através da respirometria de alta resolução, atividade enzimática da PDH, CS e LDH no coração e glicogênio hepático. Biologia molecular, através das proteínas: IR&#946;, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPK&#945;, pAMPK&#945;, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1&#945;, PPAR&#945;, 4HNE, complexos da CTE (I, II, III, IV e V), &#945;-tubulina, GP91 e VADC. Diferenças entre os grupos analisadas por Two-Way ANOVA, com significância p<0,05. O GH apresentou aumento da massa corporal, gordura epididimária, retroperitoneal e colesterol total em todas as idades; glicemia de jejum, insulina, índice de HOMA-IR e triglicerídeos aos 21 e 90 dias. Aumento do índice de Lee aos 60 e 90 dias. GH apresentou diminuição: do IR&#946; e GLUT4 aos 21 e 60 dias; aumento do IR&#946; aos 90 dias; aumento do IRS1, PTP1B, aos 21 e 90 dias e da AKT, pAMPK/AMPK e GLUT1 aos 21 dias; diminuição da pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/AKT aos 21 e 90 dias; diminuição da HKII aos 21 dias e aumento aos 60 e 90 dias; aumento da PDH aos 90 dias; aumento da LDH aos 21 dias e redução aos 60 dias; aumento da CS aos 21 dias e diminuição aos 60 e 90 dias; aumento da oxidação de carboidratos aos 21 dias e redução aos 90 dias; diminuição na oxidação de ácidos graxos aos 60 e 90 dias. Adicionalmente, aumento do desacoplamento mitocondrial entre a fosforilação oxidativa e a síntese de ATP aos 60 e 90 dias. Diminuição da CPT1 e aumento da UCP2 aos 21 e 90 dias. Diminuição da PGC-1&#945; aos 60 e 90 dias; da FABPm e CD36 em todas idades. Aumento da 4HNE aos 21 e diminuição aos 90 dias. Diminuição na expressão do mRNA para CPT1 aos 21, 60 dias. Diminuição na expressão do mRNA para PPAR&#945; e aumento na expressão do mRNA para UCP2 aos 21 dias; diminuição na expressão do mRNA para UCP2 ao 60 dias. Alterações morfológicas cardíacas e hepáticas, assim como na ultraestrutura dos cardiomiócitos, em todas as idades, maior conteúdo de glicogênio hepático aos 21 e 90 dias. Concluímos que a hiperalimentação na lactação levou à obesidade, com aumento da oxidação de glicose, alterações no metabolismo energético associadas à diminuição da sensibilidade à insulina, redução da capacidade oxidativa mitocondrial, levando ao desacoplamento e alteração da morfologia e ultraestrutura dos cardiomiócitos do desmame até a idade adulta. / Recent studies have shown that overnutrition in the postnatal period lead obesity, cardiometabolic alterations, insulin resistance at long term. The objective of the study was to investigate the consequences of overnutrition lactation in the hearts of mice pups and adults throughout the development. To induce overnutrition during lactation, the litter size was reduced from three male pups at the third day, overnutrition group (OG). The control group (CG) remained with 9 pups per litter at lactation until weaning. We evaluated the body weight, epididymal and retroperitoneal fat, liver and cardiac morphology, ultrastructure of cardiomyocytes, left ventricle weight/ tibia length ratio, fasting glucose, triglycerides, total cholesterol, plasma insulin and HOMA-IR. The oxygen consumption of cardiac fibers was analyzed by high-resolution respirometry. We evaluated the enzymatic activity of PDH, CS and LDH and liver glycogen. Molecular biology, through: IR&#946;, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPK&#945;, pAMPK&#945;, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1&#945;, PPAR&#945;, 4HNE, eletrons transport chain complex (I, II, III, IV and V), &#945;-tubulin, GP91 and VADC. Differences between groups analyzed by Two-way ANOVA, significance level p <0.05. The OG had increased body weight, epididymal and retroperitoneal fat and total cholesterol in all ages. Fasting glucose, insulin, HOMA-IR and triglyceride levels at 21 and 90 days. Increased Lee index at 60 and 90 days. OG showed a decrease: the IR&#946; and GLUT4 at 21 and 60 days; IR&#946; increased to 90 days; increased IRS1, PTP1B, at 21 and 90 days and AKT, pAMPK/ AMPK and GLUT1 to 21 days; decrease of pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/ AKT at 21 and 90 days; HKII decreased at 21 days and increased at 60 and 90 days; PDH increased to 90 days; increased LDH at 21 days and reduced to 60 days; CS increased at 21 days and decreased at 60 and 90 days; increased oxidation of carbohydrates to 21 days and reduced to 90 days; decrease in fatty acid oxidation at 60 and 90 days. Additionally, increased mitochondrial uncoupling oxidative phosphorylation and ATP synthesis at 60 and 90 days. We observed decrease in CPT1 and increased UCP2 at 21 and 90 days. Decreased PGC-1&#945; at 60 and 90 days and FABPm and CD36 in all ages. increased 4HNE at 21 and decrease at 90 days. However, we observed a decrease in the expression of mRNA for CPT1 to 21 and 60 days. Decrease in mRNA expression of PPAR&#945; and increased in mRNA expression of UCP2 at 21 days; decrease in mRNA expression of UCP2 at 60 days. Heart and liver morphological changes, as well as the ultrastructure of cardiomyocytes, in all ages, hepatic glycogen content at 21 and 90 days. We conclude that the overfeeding lactation led to obesity with increased glucose oxidation, changes in energy metabolism, associated with decreased insulin signaling, reduced mitochondrial oxidative capacity, leading to decoupling and changing the morphology and ultrastructure of cardiomyocytes from weaning to adulthood.

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O EuroQol é um instrumento que afere o estado de saúde e vem sendo utilizado na grande maioria dos estudos multicêntricos mundiais em diabetes e tem se mostrado uma ferramenta extremamente útil e confiável. O objetivo desse estudo é avaliar a QV de pacientes com DM1 do Brasil, país de proporções continentais, por meio da análise do EuroQol. Para isso, realizou-se estudo retrospectivo e transversal, no qual foram analisados questionários de pacientes com DM1, respondidos no período de dezembro de 2008 a dezembro de 2010, em 28 centros de pesquisa de 20 cidades das quatro regiões do país (sudeste, norte/nordeste, sul e centro-oeste). Foram também coletados dados sobre complicações crônicas micro e macrovasculares e perfil lipídico. A avaliação da qualidade de vida pelo EuroQol mostra que a nota média atribuída ao estado geral de saúde é nitidamente menor que a encontrada em dois outros estudos populacionais com DM1 realizados na Europa (EQ-VAS da Alemanha, Holanda e Brasil foram de 82,1 ± 14; 81 ± 15 e 72 ± 22, respectivamente). O EuroQol demonstra que a região Norte-Nordeste apresenta melhor índice na avaliação do estado geral de saúde quando comparada a região Sudeste e menor frequência de ansiedade-depressão autorreferidas, quando comparada às demais regiões do país (Norte-Nordeste = 1,53 ± 0,6, Sudeste = 1,65 ± 0,7, Sul = 1,72 ± 0,7 e Centro-Oeste = 1,67 ± 0,7; p <0,05). Adicionalmente, diversas variáveis conhecidas (idade, duração do DM, prática de atividade física, HbA1c, glicemia de jejum e presença de complicações crônicas se correlacionaram com a QV (r = -0,1, p <0,05; r = -0,1, p <0,05; r = -0,1, p <0,05; r = -0,2, p <0,05; r = -0,1, p <0,05 e r= -0,1, p <0,05, respectivamente). Esse é o primeiro estudo a avaliar a qualidade de vida de pacientes com DM1 a nível populacional no hemisfério sul. Nossos dados indicam uma pior qualidade de vida dos pacientes com DM 1 no Brasil quando comparado a dados de países europeus. Apesar de ter sido encontrado uma inferior duração do DM e menor presença de complicações microvasculares na região Norte/ Nordeste, quando comparada à outras regiões, nossos dados sugerem a existência de elementos adicionais responsáveis pela melhor QV e menor presença de ansiedade/depressão encontradas nesta região. Novos estudos são necessários para identificar esses possíveis fatores. / The type 1 diabetes mellitus type 1 (T1DM) is the most common endocrine disease of childhood and adolescence and it negatively impacts the quality of life (QOL). The EuroQol is an instrument that assess the health state. It has been used in most global multicenter studies in diabetes and it has been shown to be an extremely useful and reliable tool. The aim of this study is to evaluate the QOL of patients with T1DM in Brazil, a country of continental proportions, by analyzing the EuroQol. For this purpose, we performed a retrospective and cross-sectional study, which analyzed questionnaires from patients with T1DM, answered in the period of December 2008 to December 2010 in 28 research centers in 20 cities of the four regions (Southeast, North-Northeast, South and Midwest). We also collected data about chronic micro and macrovascular complications and lipid profile. The assessment of quality of life by EuroQol shows that the average score assigned to general health is markedly lower than those found in two other T1DM population studies conducted in Europe (EQ – VAS from Germany, Netherlands and Brazil were 82.1 ± 14, 81 ± 15 and 72 ± 22, respectively). The EuroQol shows that the North-Northeast region has the best index in the assessment of the overall health status compared to the Southeast and lower frequency of self-reported anxiety -depression, compared to other regions of the country (North-Northeast = 1.53 ± 0.6, Southeast = 1.65 ± 0.7, South = 1.72 ± 0.7 and Midwest = 1.67 ± 0.7, p <0.05). Additionally, several known variables (age, duration of diabetes, physical activity, HbA1c, fasting glucose, and presence of chronic complications correlated with QOL (r = -0.1, p <0.05, r = -0.1, p <0.05, r = -0.1, p <0.05, r = -0.2, p <0.05, r = -0.1, p <0.05 and r = -0.1, p <0.05, respectively). This is the first population study to evaluate the quality of life of patients with type 1 diabetes in the south hemisphere. Our data indicates poorer quality of life of patients with T1DM in Brazil when compared to data from European countries. Although we found an inferior diabetes duration and lower presence of microvascular complications in the North -Northeast region compared to other regions, our data suggests the existence of additional factors responsible for better QOL and lower presence of anxiety-depression found in this region. More studies are necessary to identify these possible factors.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação no hospedeiro vertebrado. Os triatomíneos ingerem numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglobina. O heme é uma importante molécula no metabolismo dos organismos. Um mecanismo intracelular importante no controle de sua homeostase é a degradação enzimática pela Heme Oxigenase (HO) formando biliverdina (Bv), monóxido de carbono e ferro. Como esta enzima não está presente no genoma de T. cruzi, esse trabalho tem por objetivo identificar uma atividade funcional de HO neste parasito, uma vez que dados do nosso laboratório mostram a presença de biliverdina nas incubações dessas células com heme. No presente trabalho testamos o efeito do SnPPIX (inibidor da HO-1), CoPPIX (indutor da HO-1) e Bv sobre a proliferação da forma epimastigota do parasito. A adição de SnPPIX diminuiu a proliferação do parasito na tanto na ausência quanto na presença de heme. Quando a Bv foi adicionada à cultura esse efeito foi revertido; a Bv aumenta a proliferação celular na presença de heme. Por outro lado, a adição de CoPPIX não interferiu na proliferação. Posteriormente, mostramos através da técnica de immunoblotting, utilizando anticorpo monoclonal contra a HO-1, um aumento da expressão de uma proteína em resposta ao heme. Diferentemente das HO-1 já descritas que possuem massa molecular de 32 kDa, a única banda reconhecida pelo anticorpo apresenta 45 kDa. Analisamos também a expressão da HO-1 na presença de CoPPIX, SnPPIX e biliverdina, e somente o CoPPIX foi capaz de modular os níveis de expressão da HO-1. A análise estrutural através da técnica de imunocitoquímica mostrou uma maior expressão da enzima na presença de heme, e que a HO-1 de T. cruzi pode ter mais de uma localização, apresentando marcação citoplasmática e glicossomal. A fim de investigar a sequência da HO-1 de T. cruzi, o DNA genômico foi extraído para amplificação por PCR do gene da HO-1 utilizando oligonucleotídeos desenhados no genoma de T. cruzi. Os dois pares de oligonucleotídeos utilizados nao foram capazes de amplificar uma sequência equivalente a uma HO. Em seguida, utilizamos a técnica de imunoprecipitação, seguida de immunoblotting, com anticorpo anti-HO-1, com objetivo de concentrar a proteína alvo, e observamos um aumento significativo do imunocomplexo nas células tratadas com heme 300 mM, cerca de 2 vezes em relação ao controle. Dando seguimento à tentativa de identificação da HO-1 de T. cruzi, utilizamos a técnica de espectrometria de massa a partir de eletroforese unidimensional, que mostrou uma grande alteração do perfil protéico na presença de heme, mas futuros experimentos são necessários, como eletroforese 2D, para a identificação da proteína alvo / Trypanosoma cruzi, the ethiologic agent of Chagas disease, is transmitted through triatomine vectors during their blood-meal on vertebrate host. These hematophagous insects ingest blood about 6 to 12 times its original weight, reaching in a single meal about 10 mM heme bound to hemoglobin. Heme (iron protoporphyrin IX) is an important molecule in metabolism of all living organisms. One important intracellular mechanism to control heme homeostasis is its enzymatic degradation by heme oxygenase (HO). HO catalyzes the degradation of heme to biliverdin (Bv), carbon monoxide and iron. HO is absent in T. cruzi genome, thus we have been investigating the presence of a functional HO in this parasite, since our previous results showed a presence of biliverdin in heme-treated epimastigotes. In the present work, we evaluated the effect of SnPPIX, a HO-1 inhibitor, CoPPIX, a HO inducer, and Bv upon T. cruzi epimastigotes proliferation. The addition of SnPPIX decreased the parasite proliferation in the absence or in the presence of heme. When Bv was added to the culture this effect was reversed; Bv increases the parasite proliferation in the presence of heme. On the other hand, CoPPIX did not interfered on proliferation. Furthermore, we showed through immunoblotting, using an anti-HO-1 monoclonal antibody, an increase in the protein expression in heme-treated epimastigotes. Differently of described HO-1 that has a mass molecular of a 32 kDa, we showed a 45 kDa protein, the only band recognize by the HO-1 antibody. HO-1 expression analysis in the presence of CoPPIX, SnPPIX and biliverdin, showed that only CoPPIX was able to modulate its expression level. Ultrastructural immunocytochemistry analysis suggests a higher expression of the enzyme in heme-treated epimastigotes, and that T. cruzi HO-1 might have a dual distribution, since the anti-HO-1 antibody labeled both cytosol and glycosomes. In order to investigate the T. cruzi HO-1 gene sequence, we isolated genomic DNA from T. cruzi for PCR amplification using primers designed as from the parasite genome. Unfortunately, the two pairs of the designed oligonucleotides tested were unable to amplify a sequence equivalent to a HO-1. In order to isolate the target protein, immunoprecipitation was performed and subsequently immunoblotted with anti-HO-1 antibody. The immunocomplex level was two-fold higher in heme-treated cells. Following the attempt to identify a HO-1 in T. cruzi, we used mass spectrometry from unidimensional electrophoresis. We showed a significant protein profile modification in heme-treated epimastigotes, but further experiments will be necessary, such as mass spectrometry from bidimensional electrophoresis, for identification of the target protein

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação no hospedeiro vertebrado. Os triatomíneos ingerem numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglobina. O heme é uma importante molécula no metabolismo dos organismos. Um mecanismo intracelular importante no controle de sua homeostase é a degradação enzimática pela Heme Oxigenase (HO) formando biliverdina (Bv), monóxido de carbono e ferro. Como esta enzima não está presente no genoma de T. cruzi, esse trabalho tem por objetivo identificar uma atividade funcional de HO neste parasito, uma vez que dados do nosso laboratório mostram a presença de biliverdina nas incubações dessas células com heme. No presente trabalho testamos o efeito do SnPPIX (inibidor da HO-1), CoPPIX (indutor da HO-1) e Bv sobre a proliferação da forma epimastigota do parasito. A adição de SnPPIX diminuiu a proliferação do parasito na tanto na ausência quanto na presença de heme. Quando a Bv foi adicionada à cultura esse efeito foi revertido; a Bv aumenta a proliferação celular na presença de heme. Por outro lado, a adição de CoPPIX não interferiu na proliferação. Posteriormente, mostramos através da técnica de immunoblotting, utilizando anticorpo monoclonal contra a HO-1, um aumento da expressão de uma proteína em resposta ao heme. Diferentemente das HO-1 já descritas que possuem massa molecular de 32 kDa, a única banda reconhecida pelo anticorpo apresenta 45 kDa. Analisamos também a expressão da HO-1 na presença de CoPPIX, SnPPIX e biliverdina, e somente o CoPPIX foi capaz de modular os níveis de expressão da HO-1. A análise estrutural através da técnica de imunocitoquímica mostrou uma maior expressão da enzima na presença de heme, e que a HO-1 de T. cruzi pode ter mais de uma localização, apresentando marcação citoplasmática e glicossomal. A fim de investigar a sequência da HO-1 de T. cruzi, o DNA genômico foi extraído para amplificação por PCR do gene da HO-1 utilizando oligonucleotídeos desenhados no genoma de T. cruzi. Os dois pares de oligonucleotídeos utilizados nao foram capazes de amplificar uma sequência equivalente a uma HO. Em seguida, utilizamos a técnica de imunoprecipitação, seguida de immunoblotting, com anticorpo anti-HO-1, com objetivo de concentrar a proteína alvo, e observamos um aumento significativo do imunocomplexo nas células tratadas com heme 300 mM, cerca de 2 vezes em relação ao controle. Dando seguimento à tentativa de identificação da HO-1 de T. cruzi, utilizamos a técnica de espectrometria de massa a partir de eletroforese unidimensional, que mostrou uma grande alteração do perfil protéico na presença de heme, mas futuros experimentos são necessários, como eletroforese 2D, para a identificação da proteína alvo / Trypanosoma cruzi, the ethiologic agent of Chagas disease, is transmitted through triatomine vectors during their blood-meal on vertebrate host. These hematophagous insects ingest blood about 6 to 12 times its original weight, reaching in a single meal about 10 mM heme bound to hemoglobin. Heme (iron protoporphyrin IX) is an important molecule in metabolism of all living organisms. One important intracellular mechanism to control heme homeostasis is its enzymatic degradation by heme oxygenase (HO). HO catalyzes the degradation of heme to biliverdin (Bv), carbon monoxide and iron. HO is absent in T. cruzi genome, thus we have been investigating the presence of a functional HO in this parasite, since our previous results showed a presence of biliverdin in heme-treated epimastigotes. In the present work, we evaluated the effect of SnPPIX, a HO-1 inhibitor, CoPPIX, a HO inducer, and Bv upon T. cruzi epimastigotes proliferation. The addition of SnPPIX decreased the parasite proliferation in the absence or in the presence of heme. When Bv was added to the culture this effect was reversed; Bv increases the parasite proliferation in the presence of heme. On the other hand, CoPPIX did not interfered on proliferation. Furthermore, we showed through immunoblotting, using an anti-HO-1 monoclonal antibody, an increase in the protein expression in heme-treated epimastigotes. Differently of described HO-1 that has a mass molecular of a 32 kDa, we showed a 45 kDa protein, the only band recognize by the HO-1 antibody. HO-1 expression analysis in the presence of CoPPIX, SnPPIX and biliverdin, showed that only CoPPIX was able to modulate its expression level. Ultrastructural immunocytochemistry analysis suggests a higher expression of the enzyme in heme-treated epimastigotes, and that T. cruzi HO-1 might have a dual distribution, since the anti-HO-1 antibody labeled both cytosol and glycosomes. In order to investigate the T. cruzi HO-1 gene sequence, we isolated genomic DNA from T. cruzi for PCR amplification using primers designed as from the parasite genome. Unfortunately, the two pairs of the designed oligonucleotides tested were unable to amplify a sequence equivalent to a HO-1. In order to isolate the target protein, immunoprecipitation was performed and subsequently immunoblotted with anti-HO-1 antibody. The immunocomplex level was two-fold higher in heme-treated cells. Following the attempt to identify a HO-1 in T. cruzi, we used mass spectrometry from unidimensional electrophoresis. We showed a significant protein profile modification in heme-treated epimastigotes, but further experiments will be necessary, such as mass spectrometry from bidimensional electrophoresis, for identification of the target protein

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos demostram que a hiperalimentação no período pós-natal causa obesidade, alterações cardiometabólicas e resistência à insulina em longo prazo. O objetivo do estudo foi investigar as consequências da hiperalimentação na lactação nos corações de camundongos filhotes e adultos ao longo do desenvolvimento. Para induzir a hiperalimentação na lactação, o tamanho da ninhada foi reduzida a 3 filhotes machos no terceiro dia, grupo hiperalimentado (GH). O grupo controle (GC) permaneceu com 9 filhotes da lactação ao desmame. Avaliamos a massa corporal, gordura epididimária e retroperitoneal, morfologia hepática e cardíaca, ultraestrutura dos cardiomiócitos, peso do PVE/CT, glicemia de jejum, triglicerídeos, colesterol total, insulina plasmática e HOMA-IR. Analisamos o consumo de oxigênio das fibras cardíacas através da respirometria de alta resolução, atividade enzimática da PDH, CS e LDH no coração e glicogênio hepático. Biologia molecular, através das proteínas: IR&#946;, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPK&#945;, pAMPK&#945;, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1&#945;, PPAR&#945;, 4HNE, complexos da CTE (I, II, III, IV e V), &#945;-tubulina, GP91 e VADC. Diferenças entre os grupos analisadas por Two-Way ANOVA, com significância p<0,05. O GH apresentou aumento da massa corporal, gordura epididimária, retroperitoneal e colesterol total em todas as idades; glicemia de jejum, insulina, índice de HOMA-IR e triglicerídeos aos 21 e 90 dias. Aumento do índice de Lee aos 60 e 90 dias. GH apresentou diminuição: do IR&#946; e GLUT4 aos 21 e 60 dias; aumento do IR&#946; aos 90 dias; aumento do IRS1, PTP1B, aos 21 e 90 dias e da AKT, pAMPK/AMPK e GLUT1 aos 21 dias; diminuição da pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/AKT aos 21 e 90 dias; diminuição da HKII aos 21 dias e aumento aos 60 e 90 dias; aumento da PDH aos 90 dias; aumento da LDH aos 21 dias e redução aos 60 dias; aumento da CS aos 21 dias e diminuição aos 60 e 90 dias; aumento da oxidação de carboidratos aos 21 dias e redução aos 90 dias; diminuição na oxidação de ácidos graxos aos 60 e 90 dias. Adicionalmente, aumento do desacoplamento mitocondrial entre a fosforilação oxidativa e a síntese de ATP aos 60 e 90 dias. Diminuição da CPT1 e aumento da UCP2 aos 21 e 90 dias. Diminuição da PGC-1&#945; aos 60 e 90 dias; da FABPm e CD36 em todas idades. Aumento da 4HNE aos 21 e diminuição aos 90 dias. Diminuição na expressão do mRNA para CPT1 aos 21, 60 dias. Diminuição na expressão do mRNA para PPAR&#945; e aumento na expressão do mRNA para UCP2 aos 21 dias; diminuição na expressão do mRNA para UCP2 ao 60 dias. Alterações morfológicas cardíacas e hepáticas, assim como na ultraestrutura dos cardiomiócitos, em todas as idades, maior conteúdo de glicogênio hepático aos 21 e 90 dias. Concluímos que a hiperalimentação na lactação levou à obesidade, com aumento da oxidação de glicose, alterações no metabolismo energético associadas à diminuição da sensibilidade à insulina, redução da capacidade oxidativa mitocondrial, levando ao desacoplamento e alteração da morfologia e ultraestrutura dos cardiomiócitos do desmame até a idade adulta. / Recent studies have shown that overnutrition in the postnatal period lead obesity, cardiometabolic alterations, insulin resistance at long term. The objective of the study was to investigate the consequences of overnutrition lactation in the hearts of mice pups and adults throughout the development. To induce overnutrition during lactation, the litter size was reduced from three male pups at the third day, overnutrition group (OG). The control group (CG) remained with 9 pups per litter at lactation until weaning. We evaluated the body weight, epididymal and retroperitoneal fat, liver and cardiac morphology, ultrastructure of cardiomyocytes, left ventricle weight/ tibia length ratio, fasting glucose, triglycerides, total cholesterol, plasma insulin and HOMA-IR. The oxygen consumption of cardiac fibers was analyzed by high-resolution respirometry. We evaluated the enzymatic activity of PDH, CS and LDH and liver glycogen. Molecular biology, through: IR&#946;, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPK&#945;, pAMPK&#945;, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1&#945;, PPAR&#945;, 4HNE, eletrons transport chain complex (I, II, III, IV and V), &#945;-tubulin, GP91 and VADC. Differences between groups analyzed by Two-way ANOVA, significance level p <0.05. The OG had increased body weight, epididymal and retroperitoneal fat and total cholesterol in all ages. Fasting glucose, insulin, HOMA-IR and triglyceride levels at 21 and 90 days. Increased Lee index at 60 and 90 days. OG showed a decrease: the IR&#946; and GLUT4 at 21 and 60 days; IR&#946; increased to 90 days; increased IRS1, PTP1B, at 21 and 90 days and AKT, pAMPK/ AMPK and GLUT1 to 21 days; decrease of pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/ AKT at 21 and 90 days; HKII decreased at 21 days and increased at 60 and 90 days; PDH increased to 90 days; increased LDH at 21 days and reduced to 60 days; CS increased at 21 days and decreased at 60 and 90 days; increased oxidation of carbohydrates to 21 days and reduced to 90 days; decrease in fatty acid oxidation at 60 and 90 days. Additionally, increased mitochondrial uncoupling oxidative phosphorylation and ATP synthesis at 60 and 90 days. We observed decrease in CPT1 and increased UCP2 at 21 and 90 days. Decreased PGC-1&#945; at 60 and 90 days and FABPm and CD36 in all ages. increased 4HNE at 21 and decrease at 90 days. However, we observed a decrease in the expression of mRNA for CPT1 to 21 and 60 days. Decrease in mRNA expression of PPAR&#945; and increased in mRNA expression of UCP2 at 21 days; decrease in mRNA expression of UCP2 at 60 days. Heart and liver morphological changes, as well as the ultrastructure of cardiomyocytes, in all ages, hepatic glycogen content at 21 and 90 days. We conclude that the overfeeding lactation led to obesity with increased glucose oxidation, changes in energy metabolism, associated with decreased insulin signaling, reduced mitochondrial oxidative capacity, leading to decoupling and changing the morphology and ultrastructure of cardiomyocytes from weaning to adulthood.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_tatiane_lotufo_leite.pdf: 2051891 bytes, checksum: e4c441e2609b224ad75ff5b6b7b0d609 (MD5) Previous issue date: 2010-11-22 / The growing demand for energy and attempt to replace the energy matrix based on fossil fuels causes exist multiple searches in the search for alternative fuels. Hydrogen gas, which has potential energy 2.5 times larger than any hydrocarbon, and when burned releases only water, being their combustion free greenhouse gas potentializing. Several processes have been used for the production of biohydrogen. Of these processes is based on anaerobic degradation of waste, especially rich in carbohydrates. The parboiling is a process hydrothermal treatment of rice in the husk, which aims to improve the nutritional quality of the product. The rice parboiling generates approximately 4 L of effluent per kilogram of rice. This effluent presents a high content of organic substances and nutrients such as nitrogen and phosphorus, showing significant concentrations of carbohydrates also. The potential of hydrogen production from the effluent of parboiling rice was tested on reactors with anaerobic sludge of UASB heat-treated with sludge acidogenic hydrogen producer. Also studied the need for addition of nutrients to effluent parboiled for hydrogen production. The pH of the experiment was kept 5.5 to avoid growth of arquea metanogenic, that consume hydrogen. The temperature of the reactor was maintained at 20 ± 5 ºC. The experiment was mounted in batch of 48 hours, using sucrose as substrate control. The effluent from parboiled rice presents an average concentration of COD gross 4988.6 mg L-1 and carbohydrate 1030.0 mg L-1. Of the UASB anaerobic sludge heat-treated produced hydrogen with maximum rate of 62, 3 mL. g-1 COD removed, while the slime acidogenic produced 217.5 mL g-1 COD removed. The acidogenic reactor fed with effluent from parboiling presented removing 32.9% COD and 77.8% carbohydrates. Maximum production of hydrogen from the effluent was 9, 61 mL. Hydrogen gas production per gram of SSV in acidogenic reactor fed with sucrose was superior to reactor fed with effluent from parboiling. Reactors with three different gradients of addition of nutrients have been tested, showing that the hydrogen production was not significantly increased with increasing concentration of nutrient solution, indicating that the effluent from parboiling has potential for hydrogen production by anaerobic processes without the need for addition of nutrients tested. / A crescente demanda por energia e a tentativa de substituir a matriz energética baseada nos combustíveis fósseis faz com que existam várias pesquisas na busca de combustíveis alternativos. O gás hidrogênio, que possui potencial energético 2,5 vezes maior que qualquer hidrocarboneto, e que quando queimado libera somente água, sendo sua combustão livre de gases potencializadores do efeito estufa. Vários processos têm sido utilizados para a produção de biohidrogênio. Um desses processos é baseado na degradação anaeróbia de resíduos, principalmente os ricos em carboidratos. A parboilização é um processo hidrotérmico do arroz com casca, que tem por objetivo melhorar a qualidade nutritiva do produto. A parboilização do arroz gera cerca de 4L de efluente por quilo de arroz produzido. Esse efluente apresenta taxas elevadas de substâncias orgânicas e nutrientes como nitrogênio e fósforo, apresentando também concentrações consideráveis de carboidratos. O potencial de produção de hidrogênio do efluente da parboilização do arroz foi testado em reatores com lodo anaeróbio de UASB tratado termicamente e com lodo acidogênico produtor de hidrogênio. Também se estudou a necessidade de adição de nutrientes ao efluente de parboilizado para produção de hidrogênio. O pH do experimento foi mantido a 5,5 para evitar o crescimento de árqueas metanogênicas, consumidoras de hidrogênio. A temperatura do reator foi mantida a 20± 5°C. O experimento foi montado em batelada de 48 horas, utilizando sacarose como substrato controle. O efluente da parboilização do arroz apresenta uma concentração média de DQO bruta de 4988,6 mg.L-1 e de carboidratos de 1030,0 mg L-1. O lodo anaeróbio de UASB tratado termicamente produziu hidrogênio com taxa máxima de 62,3mL.g-1 DQO removida, enquanto o lodo acidogênico produziu 217,5 mL.g-1 DQO removida. O reator acidogênico alimentado com efluente da parboilização apresentou remoção de 32,9% de DQO e de 77,8% de carboidratos. A produção máxima de hidrogênio do efluente foi de 9,61mL. A produção de gás hidrogênio por grama de SSV no reator acidogênico alimentado com sacarose foi superior ao reator alimentado com efluente da parboilização. Os reatores com três diferentes gradientes de adição de nutrientes foram testados, mostrando que a produção de hidrogênio não foi aumentada significativamente com o aumento da concentração da solução de nutrientes, indicando que o efluente da parboilização tem potencial de produção de hidrogênio por processos anaeróbicos, sem a necessidade de adição dos nutrientes testados.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:50:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marcovilela.pdf: 1029491 bytes, checksum: 1fca2ef79139cc03706b7b62c5e682e5 (MD5) Previous issue date: 2007-03-26 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior / During the past 30-years, Biochemical System Theory (BST) has been provided a concrete foundation for the study of the dynamic biological systems, e.g. S-systems models for reverse engineering of metabolic networks (Savageau, 1969; Savageau, 1970; Voit, 2000). One of the remarkable characteristics of these models is its parameters not only quantify the interactions between the components of the network, but also elucidate the network s topology. Automatic procedures for S-system parameterization from biological time series have been developed by many researches, where they assume a noise-free time series and a true estimated first derivative in their methodologies (Chou, et al., 2006; Kikuchi, et al., 2003). Nevertheless, this noise-free data is not a realistic scenario of the real biological experimental world. Methods as artificial neural network (ANN), Support Vectors Machines (SVM) and Saviztsky-Golay filter were proposed to overcome the denoising time series problem with the advantage of a closed form output which allowed determining the first derivative symbolically (Almeida and Voit, 2003; Borges, et al., 2006; Borges, et al., 2004; Voit and Almeida, 2004). However, these solutions showed some problematic artifacts in its first derivative even when they are not visually apparent in the smoothed data, leaving a gap on the issue of a fully automatic method for S-system parameterization from experimental data. The algorithm presented in this work is a proposal to fill this gap up providing an unbiased robust tool for signal extraction and first derivative estimation from noisy time series. / Nos últimos 30 anos, a Teoria dos Sistemas Bioquímicos (Biochemical System Theory - BST) tem fornecido uma fundação concreta para o estudo da dinâmica de sistemas biológicos, por exemplo, Sistemas-S (S-systems) usados em engenharia reversa de vias metabólicas (Savageau, 1969; Savageau, 1970; Voit, 2000). Uma característica marcante desse tipo de modelo é que os parâmetros não só quantificam as interações entres os componentes da rede metabólica, mas também fornecem a sua topologia de regulação. Procedimentos automáticos para a parametrização dos Sistemas-S a partir de séries temporais biológicas vêm sendo desenvolvidos por vários pesquisadores, onde se assume que a série temporal e sua derivada temporal são livres de ruído. Entretando, perfis metabólicos livres de ruído não são um realistas em cenários de experimentos de biologia molecular. Técnicas como Redes Neurais Artificiais (RNA), Máquinas de Vetores de Suporte (MVP) e filtro de Saviztsky-Golay foram propostas como solução do problema de suavização dos perfis metabólicos com a vantagem da obtenção da derivada temporal simbólica (Almeida and Voit, 2003; Borges, et al., 2006; Borges, et al., 2004; Voit and Almeida, 2004). Entretanto, essas soluções apresentaram alguns artefatos problemáticos na derivada até mesmo quando nenhum problema é visualmente detectado no dado suavizado, deixando aberto um espaço vazio na questão de um método automático para a parametrização dos Sistemas-S a partir de dados experimentais. O algoritmo apresentado neste trabalho propõe preencher esse espaço com uma ferramenta robusta para a extração de sinal e de sua derivada temporal a partir de séries temporais ruidosas.