Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-10-25T03:08:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 342428.pdf: 1782210 bytes, checksum: 64aa57f0c82b2db9772adaba6c071f94 (MD5) Previous issue date: 2016 / O álcool combustível tem adquirido importância nos últimos anos devido ao futuro esgotamento das reservas de combustíveis fósseis, bem como o impacto ambiental pela emissão de poluentes que estes combustíveis fósseis apresentam. Uma atrativa fonte de matéria prima para a obtenção de etanol é a biomassa lignocelulósica, composta de lignina, celulose e hemicelulose, sendo que estes dois últimos polímeros podem ser utilizados nos processos fermentativos para a produção de álcool combustível. Embora a levedura industrial Saccharomyces cerevisiae fermente eficientemente hexoses, esta levedura é incapaz de fermentar pentoses como a xilose, o principal açúcar presente nos hidrolisados de hemicelulose. A enzima xilose redutase (XR) é o primeiro passo no metabolismo da xilose, uma enzima NAD(P)H-dependente que reduz xilose a xilitol, mas o desbalanço causado pela xilitol desidrogenase dependente de NAD+ (a segunda enzima do metabolismo da xilose) pode levar ao acúmulo de xilitol. Então, a seleção de XRs com alta atividade enzimática e afinidade pelos dois cofatores é importante para o aumento da produtividade de etanol a partir da xilose. No presente trabalho foram clonados genes que codificam para possíveis XRs de duas leveduras do gênero Spathaspora (S. passalidarum e S. arborariae), e também foi clonada uma xilitol desidrogenase de S. passalidarum, ambas leveduras naturalmente fermentadoras de xilose. Estes genes foram expressos em uma linhagem de S. cerevisiae para avaliar a funcionalidade das enzimas. Nossos resultados mostraram que um gene anotado no genoma de S. arborariae (também presente em S. passalidarum) como XR, não exibiram atividade com este açúcar, e provavelmente trata-se de aldo-ceto redutases com especificidades desconhecidas. Outro gene foi amplificado de S. arborariae e S. passalidarum, e quando expressos em S. cerevisiae, o gene de S. arborariae apresentou atividade XR com ambos os cofatores (NADH e NADPH), enquanto que o gene obtido de S. passalidarum só exibiu atividade de XR dependente de NADPH. A atividade da xilitol desidrogenase clonada de S. passalidarum, quando expressa em S. cerevisiae, mostrou uma enzima completamente dependente de NAD+. Linhagens de S. cerevisiae recombinantes, expressando as diferentes enzimas do metabolismo da xilose clonadas no presente trabalho, foram capazes de crescer e consumir xilose, porém com baixa produção de etanol, e significativa produção de xilitol. Isto provavelmente se deve a baixa atividade da enzima xilitol desidrogenase nas linhagens recombinantes. De fato, mesmo nas fermentações de xilose em batelada, as células recombinantes produziram mais xilitol do que etanol. Finalmente, durante co-fermentações de xilose/glicose, as leveduras recombinantes produziram mais xilitol e acetato do que etanol a partir da xilose, indicando que provavelmente o desbalanço de cofatores ainda esta determinando o destino dos carbonos provenientes da xilose. Portanto, nossos resultados indicam a presença de diferentes xiloses redutases no genoma das leveduras Spathaspora, que poderão contribuir para otimizar a produção de etanol de segunda geração.<br> / Abstract : The production of fuel álcohol has become importante in recente years due to the future depletion of fóssil fuels stocks and the environmental impact of pollutant emissions. An attractive source of raw material for etanol production is the lignocellulosic biomass, composed of lignina, celulose and hemicellulose. The sugar cane bagasse is an interesting source of celulose and hemicelulose, that can be used in the fermentative process for fuel alcohol production. Although the industrial yeast Saccharomyces cerevisiae efficiently ferments hexoses, this yeast is unable to ferment pentoses such as xylose present in hemicellulose hydrolysates. The enzyme xylose reductase (XR) is the first step in xylose metabolism, a NAD(P)H-dependent enzyme that reduces xylose to xylitol, but cofactor imbalance with the NAD+-dependent xylitol dehydrogenase (the second enzyme in xylose metabolism) can lead to xylitol accumulation. Thus, screening for XR with high catalytic efficiency and dual cofactor affinity is important for increasing the ethanol productivity from xylose. This work, we have cloned xylose reductases from strains of Spathaspora (S. passalidarum and S. arborariae) and cloned xylitol dehydrogenase from Spathaspora passalidarum, which are natural xylose fermenting yeast. These genes were expressed in the S. cerevisiae strain CENPK2-1C to avaliate the enzymes functionality. Our results showed that a gene annotated in the S. arborariae genome (present in S. passalidarum) as xylose reductase does not have activity with this sugar, and probably is a putative aldo-keto reductase of unknown specificity. Another gene was amplified from S. arborariae and S. passalidarum, and when these genes were expressed in S. cerevisiae a xylose reductase enzymatic activity with both NADH and NADPH were observed with the S. arborariae gene, but in the case of the S. passalidarum gene we obtained a NADPH-dependent xylose reductase activity. The activity of xylitol dehydrogenase expressed in S. cerevisiae was completely NAD+-dependent. S. cerevisiae recombinants, enconding the different enzymes of xylose metabolismo, was able to grow on xylose with a xylose comsumption, low yield of ethanol and significative xylitol production. It presumably due the low expression of xylitol dehydrogenase and incresing XR/XDH ration activity. Indeed, in xylose batch fermentation the recombinant cells were able to produce more xylitol than ethanol and xylose/glucose batch fermentation, the recombinant cells produce more xylitol and acetate than ethanol from xylose, that probably indicating the cofactor unbalance determining the carbons from xylose fate. Thus, our results indicate the presence of several different xylose reductases in the genome of Spathaspora yeast could be a contribution to optimize the second-generation ethanol.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-20T17:15:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 197989.pdf: 1029654 bytes, checksum: 80be5a94f789dc228c1ecb590ceebf6c (MD5) / Neste trabalho foram exploradas metodologias alternativas de imobilização de enzimas e microrganismos para a manutenção das atividades e estereosseletividades dos mesmos em meio orgânico. As células de Saccharomyces cerevisiae (FP) foram suportadas em montmorilonita (K10), recobertas ou não com gelatina (G), na presença ou ausência de sacarose (S) ou trealose (T). Estes sistemas foram utilizados para a redução enantiosseletiva do acetoacetato de etila e a-cloroacetofenona em hexano. Para a redução do acetoacetato de etila com os sistemas FP/K10/G/S e FP/K10/G/T o biocatalisador tornou-se mais estável em meio orgânico, formaram-se menos subprodutos e a atividade foi mantida. O S-(+)-álcool foi obtido com ee>99% até a quarta reutilização, com valores de %c de 19 e 20% a 20oC, que foi a temperatura mais adequada para evitar a desativação das células. Para a biorredução do acetoacetato de etila constatou-se que a função principal da sacarose, da mesma forma que a trealose e a água, é de proteção da parede celular do microrganismo. Os valores de ee e %c foram similares com todos os sistemas. Na redução da a-cloroacetofenona obteve-se o R-(-)-2-cloro-1-feniletano após 72h de reação com ee 78-79%, quando o sistema FP/K10/G/S foi utilizado a 20 e 30oC, respectivamente. A biorredução em presença do sistema FP/K10/G/S forneceu %c superiores e valores de ee(%) inferiores aos obtidos em presença do sistema FP/K10/G/T (99%). Estes resultados evidenciam a influência da difusão para este reagente e produtos nos sistemas mais protegidos, ao contrário do observado para o acetoacetato de etila. O sistema FP/T foi o que apresentou a maior conversão em R-(-)-2-cloro-1-feniletanol e após 48h de reação obteve-se o produto com ee 80% e conversão de 45%, a 20oC. Para este substrato pode-se constatar o papel importante da trealose como agente protetor. O FP, imobilizado ou não, não foi eficiente quando utilizado como biorredutor de acetofenonas que não possuíam grupos ativantes próximos à carboníla, e os produtos desejados não foram obtidos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T14:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A fermentação da maltose e maltotriose por Saccharomyces cerevisiae é de fundamental importância para diversas aplicações industriais desta levedura. No presente trabalho foi analisado aspectos do metabolismo destes açúcares relevantes para os processos de panificação e cervejaria. Por exemplo, células de leveduras continuam fermentando a massa do pão mesmo quando submetidas a refrigeração, sendo esta uma característica indesejável nas cepas de panificação. Uma vez que a maltose é o principal açúcar encontrado na massa do pão, a influência do frio (10ºC) na fermentação deste açúcar foi analisada em uma cepa selvagem de S. cerevisiae, e numa cepa csf1. mutante incapaz de transportar glicose e leucina a baixas temperaturas. A baixa temperatura afeta a cinética da fermentação por diminuir a velocidade de crescimento e rendimento celular final, com quase nenhum etanol produzido a partir de maltose pelas células selvagens a 10oC. A cepa csf1. foi incapaz de crescer em maltose a 10oC, indicando que o gene CSF1 é também necessário para a utilização de maltose a baixas temperaturas. Entretanto, o mutante csf1. também mostrou inibição acentuada da fermentação de glicose e maltose por estresse salino, além de uma significativa sensibilidade a uma série de compostos tóxicos, incluindo higromicina B, Ca2+, tetrametilamônio e pH ácido, mas não a altas concentrações de K+. Estes resultados indicam que o gene CSF1 estaria também envolvido na regulação de outros processos fisiológicos, incluindo a homeostase iônica. Em cervejaria a otimização do processo fermentativo depende da eficiente utilização de maltose e maltotriose pelas células de S. cerevisiae. Entretanto, as leveduras têm dificuldade de fermentar a maltotriose, e a incompleta utilização deste açúcar resulta, por exemplo, em uma cerveja de baixa qualidade, com um elevado extrato filtrável e sabor atípico. Para tentar compreender melhor a metabolização da maltotriose, a utilização deste açúcar foi analisada em cepas de S. cerevisiae com genótipos definidos e deletadas, ou não, em permeases específicas. A cepa selvagem analisada cresce lentamente em maltotriose, somente após uma extensa fase lag, sem produzir etanol durante o crescimento. Este fenótipo (crescimento lento e não fermentativo) não foi alterado pela deleção do gene AGT1, indicando que outro(s) transportador(es) estaria(m) provavelmente envolvido(s) na lenta utilização da maltotriose. Por outro lado uma cepa deletada nos transportadores de hexoses (hxt1-7. gal2.) fermentou eficientemente a maltotriose, mas quando o gene AGT1 foi deletado do genoma a cepa voltou a respirar este açúcar, indicando que a permease codificada pelo AGT1 é fundamental para a fermentação da maltotriose. Uma vez que a expressão constitutiva dos genes MAL é uma característica altamente desejável em cepas de panificação e cervejaria, decidiu-se analisar a contribuição que um gene regulador constitutivo teria na fermentação da maltotriose. Enquanto que algumas cepas MAL constitutivas foram capazes de fermentar eficientemente a maltotriose, a transformação de uma cepa selvagem incapaz de fermentar este açúcar com um plasmídeo contendo o gene MAL63c não melhorou a produção de etanol a partir de maltotriose. Estes resultados indicam a existência de outros fatores necessários para a eficiente fermentação de maltotriose por Saccharomyces cerevisiae. and maltotriose fermentation by Saccharomyces cerevisiae is of prime importance for several industrial applications of this yeast. In this work we have analyzed several aspects of the metabolism of these sugars relevant to the brewing and baking processes. For example, yeast cells still ferment the dough under refrigerated conditions, a characteristic highly undesirable for backing strains. Since maltose is the most abundant sugar in backing dough, we have studied the influence of cold temperature (10oC) on the fermentation of maltose by a S. cerevisiae wild-type strain, and a csf1. mutant impaired in glucose and leucine uptake at low temperatures. Cold temperature affected the fermentation kinetics by decreasing the growth rate and the final cell yield, with almost no ethanol been produced from maltose by the wild-type cells at 10oC. The csf1. strain did not grew on maltose when cultured at 10oC, indicating that the CSF1 gene is also required for maltose consumption at low temperatures. However, this mutant also showed increased inhibition of glucose and maltose fermentation under salt stress, and an increased sensitivity to several toxic compounds, including hygromycin B, Ca2+, tetramethylammonium and acidic pH, but not to high K+ concentrations. These results indicate that the CSF1 gene is probably involved in the regulation of other physiological processes, including ion homeostasis. Fermentation process optimization in the brewing industry depends on the efficient utilization of maltose and maltotriose by S. cerevisiae. However, yeasts have a difficulty to ferment maltotriose, and the incomplete utilization of this sugar results, for example, in a low quality beer with high content of fermentable sugars and atypical flavor profiles. To further understand the utilization of maltotriose, we analyzed the uptake of this sugar in yeasts strains with defined genotypes, deleted or not in specific transporters. The wild-type strain analyzed grows slowly in maltotriose, only after an extensive lag phase, and no ethanol was produce during growth. This phenotype (slow growth with no fermentation) was not affected by deletion of the AGT1 gene, indicating that probably other transporters may be involved in the slow utilization of maltotriose. On the other hand, a strain that was deleted in the hexose transporters (hxt1-7. gal2.) fermented maltotriose efficiently, but when the AGT1 gene was disrupted from the genome the strain started to respired the sugar, indicating that the AGT1 permease is required for maltotriose fermentation. Since the constitutive expression of MAL genes is a desired property of baker#s and brewery#s strains, we analyzed the contribution that a constitutive regulatory gene would have in maltotriose fermentation. While some MAL constitutive strains were capable to efficiently ferment maltotriose , the transformation of a wild-type strain incapable to ferment this sugar with a plasmid harboring the MAL63c gene did not improve ethanol production from maltotriose. These results indicate the existence of other factors required for the efficient fermentation of maltotriose by Saccharomyces.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-03Bitstream added on 2014-11-10T11:57:42Z : No. of bitstreams: 1 000791746_20161230.pdf: 155533 bytes, checksum: 6f18d97bf9f0c9eacd6f64c0cc35283a (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-02T15:03:50Z: 000791746_20161230.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-02T15:05:07Z : No. of bitstreams: 1 000791746.pdf: 908787 bytes, checksum: deb0484311ec8603c54203d7f5c799da (MD5) / Legislações mundiais estão sendo criadas a fim de reduzir a presença de resíduos de antimicrobianos em alimentos e bebidas. Com destaque para as bebidas alcoólicas destiladas, em que micro-organismos inerentes ao processo fermentativo infectam e resultam em decréscimo da qualidade do produto. Objetivou-se avaliar o efeito dos extratos de própolis, antimicrobiano sintético à base de monensina e o prévio tratamento físico-químico do caldo de cana, para o controle de contaminantes no processo fermentativo, destinado à produção de cachaça. Avaliaram-se os efeitos sobre a atividade da levedura Saccharomyces cerevisiae CA-11, sobre os compostos secundários e sobre a qualidade do destilado final. Adotou-se o delineamento em parcelas subdivididas com três repetições, empregando-se 5 tratamentos principais (biocidas) e 5 tratamentos secundários (ciclos de fermentação). Os tratamentos principais foram constituídos de Controle (caldo sem tratamento); antimicrobiano sintético (Monensina sódica); extrato etanólico de própolis verde (EEPV), extrato etanólico de própolis marrom (EEPM), tratamento físico-químico do caldo (TFQ). O tratamento secundário foi constituído por cinco ciclos fermentativos. Avaliou-se a viabilidade das células e brotos, assim como o índice de brotamento ao longo da fermentação. Para o vinho, determinou-se pH, acidez total, glicerol e teor alcoólico. A composição do destilado (acroleína, acidez volátil, acetaldeído, carbamato de etila, ésteres, metanol, alcoóis superiores, propílico, isobutílico, isoamílico) foi determinada por cromatografia. Os teores de etanol produzidos pela levedura CA-11 foram entre 6 a 7%, sendo não significativos para todos os tratamentos avaliados. Todos os tratamentos contribuíram para melhorar os parâmetros físico-químicos e a qualidade dos vinhos obtidos. Avaliações microbiológicas indicaram que a ... / Regulations are being created worldwide to reduce the amount of antimicrobial residues in food and beverages, especially distilled alcoholic beverages, because contaminant microorganisms from fermentation process may infect and depreciate the product quality. This study aimed to evaluate the effect of propolis extracts, monensin-based synthetic antimicrobial and previous physical-chemical treatment of the broth to control contaminants in the fermentation process for the production of cachaça. We studied the effects on the activity of the Saccharomyces cerevisiae CA-11 and the composition of secondary metabolites and quality of the final distillate. The experiment was arranged in a completely randomized design in split splots with three replications, using main treatments (five antimicrobials) and secondary treatments (fermentation cycles). The main treatments were: control (untreated juice); sodium monensin; green propolis ethanolic extract (GPEE); brown propolis ethanolic extract (BPEE); physical-chemical juice treatment (PCT). Secondary treatments corresponded to five fermentation cycles. The amount of yeast cell and bud viability, and yeast bud rate during the fermentation were evaluated. The wines were analyzed for pH, total acidity, glycerol and alcohol content. Microbiological evaluations indicated that the sugarcane source used, presented with excellent quality, showing low number of contaminants in juice and wine.The compounds of cachaça quantified by gas chromatography were (acetaldehyde, acrolein, esters, ethyl carbamate, higher alcohols, isobutyl, isoamyl, methanol, propyl, volatile acidity). Ethanol levels produced by the yeast strain ‘CA-11’ in the fermentation were found to be around 6 to 7%, which are not statistically significant among treatments. The concentrations of the secondary compounds were met significantly below the limits of the Brazilian legislation ...

Análises de complementação do mutante pso9-1, sensível a psoralenos mono- e bifuncionais fotoativados, UV254nm e nitrosoguanidina, com os mutantes pso1 a pso8, confirmou que este contém uma nova mutação pso. A clonagem molecular a partir de um banco genômico de levedura sugeriu pso9-1 como alelo mutante do gene de checkpoint que responde a danos no DNA MEC3. A não-complementação de vários fenótipos de sensibilidade em diplóides pso9-1/mec3∆ confirmou o alelismo dos dois mutantes. A sensibilidade à calcofluor white e à cafeína não foi aumentada nas linhagens pso9-1 e mec3∆, em relação as suas respectivas selvagens, sugerindo que o mutante pso9-1 não porta uma mutação na região promotora. O fenótipo mutante de mec3∆ foi levemente mais pronunciado para sensibilidade à 8-MOP + UVA e UVC, e para a supressão de mutação para frente induzida por UVC, sugerindo uma função residual para a proteína produzida por este alelo mutante.

As nitrorredutases compreendem uma família de proteínas conservadas evolutivamente e originalmente identificadas em eubactérias. São enzimas capazes de catalisar a redução do grupo nitro e utilizam FMN (flavina mononucleotideo) ou FAD (flavina adenina dinucleotídeo oxidado) como grupo prostético e NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido) ou NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido) como agentes redutores. As nitrorredutases podem ser encontradas em bactérias e em menor extensão em eucariotos. Dois subgrupos de nitrorredutases foram caracterizados em bactérias: oxigênio-insensível ou tipo I e oxigênio-sensível ou tipo II. Na levedura Saccharomyces cerevisiae duas prováveis nitrorredutases, Frm2p/Hbn1p foram identificadas. Em relação às enzimas pertencentes à família das nitrorredutases não se tem conhecimento sobre a sua função biológica, bem como em relação à sua posição filogenética. Tendo isso em vista, o objetivo deste trabalho é esclarecer a possível função das proteínas Frm2 e Hbn1 de Saccharomyces cerevisiae na resposta ao estresse oxidativo, bem como determinar a posição filogenética e a sua presença em outros organismos procariotos e eucariotos. Os resultados da análise filogenética mostram que bactérias possuem seqüências similares a Frm2p/Hbn1p (denominadas Nr1Ap) que formam um clado distinto dentro da família Frm2p/Hbn1p. Análises de agrupamentos hidrofóbicos (HCA) e modelagem tri-dimensional foram realizadas para comparar regiões conservadas entre proteínas Nr1Ap e Frm2p/Hbn1p. A nitrorredutase Frm2p possivelmente esteja atuando na via de sinalização lipídica, enquanto a função da Hbn1p é desconhecida. Entretanto, alguns estudos têm indicado que as nitrorredutases podem estar envolvidas na resposta a estresse oxidativo. Com o objetivo de esclarecer a função de Frm2p e Hbn1p, foi avaliada a sensibilidade de linhagens de levedura proficientes e deficientes em ambas proteínas ao estresse oxidativo, investigando a competência respiratória, as atividades de enzimas antioxidantes, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a peroxidação lipídica. Os resultados mostram uma menor atividade basal de superóxido dismutase (SOD) e elevada sensibilidade a óxido de 4-nitroquinolina (4-NQO) e Nnitrosodietilamina (NDEA), indução de mutantes citoplasmáticos (petites), produção intracelular de EROs e peroxidação lipídica quando expostas a estes agentes geradores de superóxido nas linhagens frm2 , hbn1 e frm2 hbn1 . Ainda podemos observar elevada atividade basal de catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e conteúdo de glutationa (GSH) nas linhagens frm2 e frm2 hbn1. Estas linhagens possuem menor produção de EROs e peroxidação lipídica quando expostas aos agentes geradores de peróxidos H2O2 e t-BOOH. Isso sugere que a ausência da Frm2p é o fator responsável por estas alterações vistas. Portanto, neste trabalho foi mostrada a influência das nitrorredutases Frm2 e Hbn1 na resposta ao estresse oxidativo em S. cerevisiae, pela modulação da atividade das enzimas antioxidantes, SOD, CAT e GPx, bem como do conteúdo de GSH. Adicionalmente também foi constatado que as nitrorredutases Frm2p e Hbn1p provavelmente não atuam na metabolização de nitrocompostos. Estes resultados são consistentes com os dados encontrados na análise filogenética, que apontam estas proteínas como constituindo uma nova família de prováveis nitrorredutases ainda não caracterizada, encontrada em bactérias e fungos. / The nitroreductase family comprises a group of FMN (flavine mononucleotide) ou FAD (flavine adenine dinucleotíde oxidade)-dependent enzymes able to metabolize nitrosubstituted compounds using the reducing power of NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide fosfate reduzide) or NADH (nicotinamide adenine dinucleotide reduzide). The nitroreductases can be found within bacterial species and, in a less extend, in eukaryotes. Two types of nitroreductase subgroups were characterized in bacteria: oxygen-insensitive or type I and oxygen sensitive or type II. In the yeast Saccharomyces cerevisiae two putative nitroreductase proteins, Frm2p and Hbn1p, were described. A feature of the nitroreductase family is our lack of knowledge about its biological function and evolutionary history. Taking into account these considerations, the purpose of this work was to elucidate the possible participation of these enzymes in response to oxidative stress as well as to determine the phylogenetic position of Frm2p and Hbn1p and the presence of homologous sequences in other prokaryotic and eukaryotic species. In order to obtain data about the phylogenetic position of Frm2p/Hbn1p, we performed an in-depth phylogenetic analysis of these proteins. The phylogenetic analysis of these proteins showed that bacterial cells have a Frm2p/Hbn1p-like sequences (termed NrlAp) which form a distinct clade within the fungal Frm2p/Hbn1p family. Hydrophobic cluster analysis (HCA) and three-dimensional protein modeling allowed us to compare conserved regions among NrlAp and Frm2/Hbn1p proteins. While Frm2p appears to act in the lipid signaling pathway, the function of Hbn1p is unknown. However, some works suggests a possible involvement from the nitroreductases in response the stress oxidative. In order to elucidate the functions of Frm2p and Hbn1p, we evaluate the sensitivity of proficient and deficient yeast strains for both proteins for oxidative stress, considering the respiratory competence, antioxidant enzyme activities, intracellular reactive oxygen species (ROS) production and lipid peroxidation. The results showed a weaker basal activity of superoxide dismutase (SOD) and higher sensitivity for 4-nitroquinoline-oxide (4-NQO) and NNitrosodiethylamine (NDEA), induction of petites, ROS production and lipid peroxidation when exposed the these superoxide generating agents. The results showed a higher basal activity of catalase (CAT), glutathione peroxidase (Gpx) and reduced glutathione (GSH) content in the single and double mutant strains frm2 and frm2 hbn1 . These strains were less ROS-producing and lipid peroxidation when exposed to peroxides-generating agents H2O2 and t-BOOH. Thus, the absence of Frm2p may be the event responsible for these alterations. Considering the data gathered in this work, we showed the influence of nitroreductases Frm2p and Hbn1p in response to oxidative stress in S. cerevisae yeast by modulation of antioxidant enzymes activities, such as SOD, CAT, GPx and GSH content. Additionally, it was showed that the nitroreductases Frm2p and Hbn1p are not envolved in the activation of nitrocompounds. Theses results are consistent with those found in the filogenetic analysis that indicated that theses proteins belong to the new bacterial and fungal Frm2p/Hbn1p nitroreductase-like family.

A resistência ao cloreto estanoso (SnCl2) nas células eucarióticas de levedura Saccharomyces cerevisiae é um produto de vários processos metabólicos. O mutante rad52 , deficiente no mecanismo de reparação recombinacional, incapaz de reparar quebras simples e duplas no DNA, foi o mais sensível ao íon metálico Sn²+. A resistência relativa dos mutantes rad e rad4 , deficientes na reparação por excisão de nucleotídeos (NER), mostrou-se significativamente elevada, indicando a participação dessa via na reparação dos danos causados pelo SnCl2. Uma série de mutantes defectivos na via de reparação por excisão de bases (BER), combinada com mutantes defectivos em NER, foi utilizada para determinar indiretamente o tipo de lesão causada pelo SnCl2 ao DNA. A DNA N-glicosilase (Ntg2p) mostrou-se, por sua vez, indispensável à reparação das lesões ao DNA induzidas pelo íon metálico Sn²+. A ausência do fator de transcrição Yap1, responsável pela resposta ao estresse oxidativo em leveduras, ocasionou o aumento da sensibilidade ao íon metálico Sn²+. Além disso, a sensibilidade dos mutantes sod1 e sod2 revelou a importância das enzimas antioxidantes Sod1p e Sod2p na resposta aos danos gerados pelo íon metálico Sn²+. A sensibilidade mais elevada ao SnCl2 foi observada quando as células estavam na fase exponencial de crescimento (fase LOG), o que sugere que há dois sistemas independentes (um mediado pela repressão/desrepressão catabólica, e outro, pela ativação da transcrição de genes envolvidos nas vias de defesa contra espécies reativas de oxigênio (EROs)), que atuam em conjunto e contribuem para a resistência aos danos causados pelo íon metálico Sn²+. Para determinar a concentração do íon metálico Sn²+ captada nas células da levedura S. cerevisiae e correlacioná-la com a toxicidade desse íon metálico, foi determinado o conteúdo de metal intracelular pelo método de Emissão de Raios-X Induzida por Partículas Carregadas, ou Particle Induced XRay Emission (PIXE), desenvolvendo-se um protocolo para as análises. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem diplóide XS2316 captou 60% da quantidade total do íon metálico Sn²+, captada pela linhagem haplóide XV184-14c. Isso indica que a linhagem haplóide capta maior quantidade do íon metálico Sn²+ do que a linhagem diplóide, o que pode explicar a citotoxicidade diferenciada de ambas as linhagens quando tratadas com SnCl2. Por fim, utilizando-se a mesma metodologia, foi realizada uma análise multielementar para avaliar se havia uma interação entre o íon metálico Sn²+ e outros elementos químicos essenciais para a célula. De acordo com as análises por PIXE, após tratamento com SnCl2, a linhagem haplóide XV185-14c apresentou um decréscimo significativo nas quantidades de Mg, Zn, S e Fe, e, por outro lado, um aumento na quantidade de P. Para verificar como o íon metálico Sn²+ é captado, distribuído e destoxificado, foram associadas técnicas moleculares, incluindo ensaios de citotoxicidade e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), com a metodologia do PIXE. Os ensaios de sobrevivência mostraram que Fet4 e Zrt2, ambas proteínas de transporte de baixa afinidade do ferro e zinco, respectivamente, podem internalizar o íon metálico Sn²+. Por sua vez, qRT-PCR mostrou um aumento da expressão gênica de CCH1 e MID1, os quais codificam as proteínas Cch1 e Mid1, envolvidas no transporte de Ca²+ na membrana plasmática, sugerindo que essas duas proteínas também podem estar envolvidas na captação do íon metálico Sn²+. Os resultados indicaram que, uma vez dentro da célula, o íon metálico Sn²+ pode ser armazenado no vacúolo através da ação da proteína P-type ATPase Pmc1 e quelado no citoplasma pela metalotioneína Crs5. Alternativamente, o íon metálico Sn²+ pode gerar EROs, em especial o ânion superóxido (O2 -), o qual pode ser dismutado pela proteína Sod1, formando peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (.OH). Consequentemente, as EROs podem induzir a transcrição de vários genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo, como SOD1, YAP1 e APN1. Para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na genotoxicidade do íon metálico Sn²+, foi avaliada a indução de quebras causadas pelo SnCl2 na presença de formamidopirimidina (FPG) e endonuclease III (ENDO III), bem como a interferência desse íon na reparação das lesões induzidas pelo agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS) em células de pulmão de hamster chinês (V79) pelo ensaio cometa. Os resultados mostraram que, em concentrações tóxicas, o íon metálico Sn²+ induziu somente uma limitada elevação nos sítios sensíveis de FPG e ENDO III, sugerindo que o íon metálico Sn²+ preferencialmente não induz lesões oxidativas nas bases nitrogenadas. Embora a concentração de 50 μM de SnCl2 não tenha produzido um aumento significativo na quantidade de danos ao DNA, ela foi capaz de inibir a reparação dos danos provocados pelo agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS) durante o período de pós-tratamento de 24h. Os resultados demonstraram o efeito genotóxico e comutagênico do SnCl2 em células V79. O efeito inibitório do íon metálico Sn²+ na reparação dos danos induzidos pelo MMS no DNA sugeriu que esse metal também pode interferir em sistemas de reparação do DNA, que contribuem para o aumento de mutações pela alteração do equilíbrio entre o processo de reparação livre de erro e o sujeito a erro. / Resistance to stannous chloride (SnCl2) of the yeast Saccharomyces cerevisiae is a product of several metabolic pathways of this unicellular eukaryote. The recombination deficient rad52 mutant, unable to repair DNA single and double strand breaks was the most sensitive. The relative resistance of mutant strains rad2 e rad, deficient in nucleotide excision repair (NER), was rather high, indicating a minor but significant contribution to repair of Sn²+ -induced DNA lesions by this repair pathway. A series of mutants defective in different base excision repair (BER) pathway, combined with NER were used to indirectly determine the type of SnCl2-produced DNA lesion. The Ntg2p DNA N-glycosylase seems to be indispensable for repair of Sn²+ -induced DNA lesions. Lack of transcription factor Yap1p, responsible for the oxidative stress response in yeast, led to increase in Sn²+ -sensitivity. In addition, sensitivity of the superoxide dismutase mutants sod1 and sod2 revealed the importance of these anti-oxidative defence enzymes against Sn²+ -imposed DNA damage. The highest SnCl2 -sensitivity, however, was observed in glucose-repressed pre-diauxic shift exponentially growing cells (LOG cells). It has been suggested that two independently acting anti-ROS protective systems (one mediated by glucose repression/de-repression, the other via ROS-inducible transcription activators) are working together, and that both contribute to Sn²+ -resistance. To determine the concentration of Sn²+ ions cells of the S. cerevisiae and to correlate their quantity with the toxicity, the intracellular metal content of yeast cells was determined by Particle Induced X-ray emission (PIXE). A thick target protocol was developed for PIXE analysis. The PIXE analysis suggested that diploid (XS2316) cells absorbed about 60% of the total amount of Sn²+ absorbed by the haploid (XV185-14c) yeast cells. This indicates that Sn²+ absorption is better in haploid yeast cells and agrees well with published toxicity results. Finally, we performed a screening in order to know the putative interactions between Sn²+ and other essential elements. According to PIXE analysis, the results for XV185-14c yeast cells indicate a significant loss of intracellular elements such as Mg, Zn, S, Fe and an increase of P levels after 1 h exposure to 25 mM SnCl2 in STAT phase. In order to verify how Sn²+ is uptaken, distributed and detoxified, we associated molecular techniques including survival assay and quantitative real time PCR (qRT-PCR) with PIXE. The survival assay showed that Fet4p and Zrt2p both low-affinity iron and zinc transporters, respectively, may internalize Sn²+. By its turn, qRT-PCR showed an increased in CCH1 and MID1 gene expression, which encode for the cytoplasmic transmembrane Ca²+ transporters Cch1p and Mid1p, suggesting that both proteins may also take up Sn²+. Our data also indicated that once inside the cell, Sn²+ may be taken up from the cytosol by a P-type ATPase to the vacuole (Pmc1p) or may be chelated by Crs5p metallothionein in the cytosol. Alternatively, Sn²+ may generate reactive oxygen species (ROS), especially O2 - which can be dismutate to form H2O2 and the highly reactive OH. In consequence, ROS can induce cellular injury and stress-generated activation of many genes, e.g., SOD1, YAP1, and APN1. In order to clarify the molecular mechanisms of Sn²+ genotoxicity, we evaluated the induction of strand breaks, FPG and ENDO III sensitive sites, and the interference with the repair of MMS-caused DNA damage in V79 Chinese hamster lung fibroblasts exposed to stannous chloride by comet assay. Our results demonstrated that Sn²+ induced only a limited elevation in FPG and ENDO III sensitive sites in toxic concentrations. This suggests that stannous ion does not preferentially induce base modifications that are the substrate of FPG and ENDO III enzymes in V79 cells. Although 50 µM SnCl2 concentration did not increase significantly the DNA migration by itself in comet assay, it was capable to inhibit the repair of MMSinduced DNA damage during the pos-treatment period of 24h. Our results demonstrate the genotoxic and comutagenic effects of stannous chloride in V79 cells. The inhibitory effect of Sn²+ on repair of MMS-induced DNA damage suggests that this metal can also interfere in DNA repair systems thus contributing to increased mutation by shifting the balance from error-free to error-prone repair processes.

Leveduras do gênero Dekkera/Brettanomyces causam sérios problemas ao vinho, afetando as propriedades sensoriais do produto final. O objetivo deste trabalho foi investigar a capacidade de duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae em inibir a atividade de Brettanomyces custersianus na vinificação em tinto e durante a fase inicial de envelhecimento, assim como investigar a capacidade deste microrganismo (Br. custersianus) em inibir a atividade metabólica de Sacch. cerevisiae. Foram realizadas vinificações com 4 inoculações diferentes. O tratamento 1 (T1) foi inoculado com a linhagem neutra Sacch. cerevisiae EMBRAPA 1vvt/97, T2-Sacch. cerevisiae EMBRAPA 91B/84 killer, T3-EMBRAPA 1vvt/97 e Br. custersianus, T4-EMBRAPA 91B/84 killer e Br. custersianus e T5-Br. custersianus. Também foram realizados, testes de velocidade fermentação, inibição ou estímulo do metabolismo e tolerância ao SO2. Durante a fase tumultuosa realizaram-se análises de açúcares redutores totais e etanol. Observou-se que durante todo o período da fermentação, o consumo de substrato de T1 e T2 foi mais rápido, do que em T3 e T4. A velocidade de fermentação da Br. custersianus (T5) foi muito inferior às demais linhagens. Mesmo com uma velocidade de crescimento baixa, a linhagem contaminante quando inoculada juntamente com Sacch. cerevisiae retarda a fermentação tumultuosa, podendo comprometer o processo de vinificação. Br. custersianus (T5) não teve sua atividade metabólica afetada na presença de 125 mg/L de SO2, logo conclui-se que as concentrações normalmente utilizadas no processo de vinificação, 30 a 70 mg/L, não seriam suficientes para impedir sua atividade. / Dekkera/Brettanomyces yeasts cause serious problems to the wine, affecting the sensorial properties of the final product. The objective of this work was to investigate the capacity of two strains of Saccharomyces cerevisiae in inhibiting the activity of Brettanomyces custersianus in the vinification in red wine and during the early stage of aging of the wine, as well as to investigate the ability of this microorganism (Br. custersianus) to inhibit metabolic activity of Saccharomyces cerevisiae. Vinifications were performed with 4 different inoculations. Treatment 1 (T1) was inoculated with the neutral strain Sacch. cerevisiae EMBRAPA 1vvt/97, T2-killer Sacch. cerevisiae EMBRAPA 91B/84, T3-EMBRAPA 1vvt/97 and Br. custersianus, T4-EMBRAPA 91B/84 and Br. custersianus and T5-Br. custersianus. There were also carried out tests of speed fermentation, inhibition or stimulation of metabolism and tolerance to SO2. During the tumultuous phase analysis was performed of total reducing sugars and ethanol. It was observed that throughout the period of fermentation, the substrate consumption in T1 and T2 was faster than in T3 and T4. The speed of fermentation of Br custersianus (T5) was much lower than the other strains. Even with a low rate of growth, the strain contaminant when inoculated with Saccharomyces cerevisiae. delays the tumultuous fermentation, being able to compromise the vinification process. Br. custersianus (T5) did not have its metabolic activity affected in the presence of 125 mg/L of SO2, then it was concluded that the concentrations normally used in the vinification process, 30 to 70 mg/L, would not be enough to prevent their activity.

Resumo não disponível

Os polímeros do tipo poli-hidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres bacterianos que apresentam as propriedades de termoplásticos e elastômeros biodegradáveis. A síntese deste polímero em plantas de interesse agroindustrial tem sido vista como uma área promissora dentro da biotecnologia de polímeros para a produção em grande escala com baixos custos. Contudo, esta tarefa requer o aprimoramento de diferentes metodologias bioquímicas e moleculares, além de maximizar os processos de extração destes polímeros biológicos. A produção de PHAs em peroxissomos ou no citoplasma de Saccharomyces cerevisiae, por meio da expressão de uma PHA-sintase bacteriana, pode servir como indicador e modulador do fluxo de carbonos que percorre vias biossintéticas como a síntese de novo de ácidos graxos e a β-oxidação. Esta levedura tem sido usada como eucarioto modelo para manipular as rotas envolvidas na síntese de PHAs do tipo MCL (PHA com um número médio de carbonos), um polímero menos cristalino e com menor ponto de fusão quando comparado ao PHA-SCL (PHA com um número pequeno de carbonos). A enzima PhaG (3-hidroxidecanoil-ACP-CoA transacilase) é responsável pela conexão entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em bactérias do gênero Pseudomonas, em meios de cultura contendo uma fonte de carbono nãorelacionada como gliconato, etanol ou acetato. Para tentar estabelecer esta rota metabólica em S. cerevisiae, o presente trabalho avaliou a coexpressão de PhaGPa e PhaC1Pa (PHA-sintase) de P. aeruginosa para a síntese de PHA-MCL a partir de uma fonte de carbono não-relacionada em leveduras. Contudo, a presença de PhaGPa não alterou a composição ou a quantidade de PHA-MCL em relação à cepa controle contendo apenas PhaC1Pa citoplasmática ou direcionada ao peroxissomo, independentemente da fonte de carbono utilizada (rafinose ou ácido oléico). Este resultado permite sugerir que a ligação entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em S. cerevisiae não foi estabelecida, provavelmente devido à ausência de algum passo enzimático que limita o desvio de substratos da síntese de ácidos graxos para a produção de PHA-MCL em organismos que não são capazes de acumular naturalmente este polímero quando cultivados em fontes de carbono não-relacionadas.A levedura S. cerevisiae tem sido usada como um sistema modelo para estudar a β-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos. A produção de PHA-MCL pela expressão de PhaC1Pa em peroxissomos de cepas selvagens e mutantes nulos de S. cerevisiae para as enzimas auxiliares da β-oxidação (Eci1p, Sps19p e Dci1p), multiplicadas em meio de cultivo contendo um ácido graxo insaturado como fonte de carbono, permitiu monitorar o fluxo de carbonos que percorre as vias dependente de isomerase, redutase e di-isomerase. Desta forma, o presente estudo permitiu avaliar a β- oxidação in vivo dos ácidos graxos linoléico conjugado, 9-cis,11-trans-CLA (ácido rumênico) ou 10-cis,13-cis-nonadecadienóico, para determinar a contribuição das vias alternativas na degradação destes substratos pela utilização de cepas selvagens, mutantes nulos e linhagens contendo um plasmídio multicópia para os genes ECI1 (Δ3- Δ2-enoil-CoA isomerase), SPS19 (2,4-dienoil-CoA redutase) e DCI1 (Δ3,5-Δ2,4-dienoil- CoA isomerase). As linhagens selvagens foram capazes de sintetizar PHA-MCL quando cultivadas em ácido rumênico, mas a atividade da enzima Eci1p foi essencial para a degradação deste CLA, indicando que a via dependente de isomerase é a única rota in vivo necessária para a β-oxidação do ácido rumênico em peroxissomos de S. cerevisiae. A contribuição da enzima di-isomerase (Dci1p) para a degradação do ácido 10- cis,13-cis-nonadecadienóico foi avaliada em cepas selvagens, mutantes nulos dci1Δ e linhagens de S. cerevisiae contendo os plasmídeos multicópia. De acordo com o conteúdo e a quantidade de PHA formado, a β-oxidação de ácidos graxos cisinsaturados em um carbono ímpar é, in vivo, independente da di-isomerase. Embora este resultado possa indicar o mesmo padrão de envolvimento de Dci1p na degradação de ácidos graxos cis-insaturados em um carbono ímpar em mitocôndrias de mamíferos, esta via alternativa deve ser mais bem investigada em eucariotos superiores.