Destaca-se a Salmonella como um dos mais importantes patógenos veiculados por alimentos, devido ao fato de estar amplamente distribuído na natureza, possuir um grande número de reservatórios, apresentar sorotipos inespecíficos quanto aos hospedeiros e apresentar cepas multiresistentes aos antimicrobianos. Salmonella Enteritidis tornou-se um grande problema de saúde pública no Brasil, a partir da década de 80, quando foi associada a produtos avícolas. Desde 1962, a Salmonella Heidelberg tem sido isolada de aves e produtos derivados e aves no Brasil e tem reconhecida importância para saúde humana e em poedeiras comerciais na América do Norte. O presente trabalho teve por objetivo o estudo de diferentes cepas de Salmonella Heidelberg (SH) em comparação com Salmonella Enteritidis (SE) em pintinhos e frangos de corte no que diz respeito à capacidade de invasibilidade de órgãos, persistência de excreção fecal e alterações na morfometria intestinal. Para o estudo in vivo, 65 isolados de SH foram avaliados quanto à presença dos genes de virulência invA, lpfA e agfA e diferenciados por eletroforese em campo pulsado (PFGE). Outro objetivo foi testar uma mistura de ácidos orgânicos e óleos essenciais no controle de excreção fecal de SE. Duas amostras de SH não relacionadas pelo método de PFGE (SH23 e SH35) e uma cepa de SE padrão foram selecionadas para a inoculação das aves. As três cepas promoveram alteração na medida de vilosidades e criptas dos pintinhos, frente a grupo controle. A cepa SH35 promoveu maior reação inflamatória nos cecos. Ambas as cepas testadas foram capaz de atingir o fígado de pintinhos às 6 horas pós-inoculação. Tanto a SE como a SH demonstram persistência e intermitência de excreção fecal em frangos de corte até os 21dias pós-inoculação. A mistura de ácidos e óleos essenciais foi eficaz na redução da excreção fecal de SE, porém somente com o uso contínuo da mistura na ração. As cepas apresentaram comportamentos diferentes quando inoculadas em frangos de corte e devido à persistência destas nos intestinos dos frangos, prejuízo para as aves podem ocorrer, enquanto a subseqüente contaminação de carcaças, representa risco para a saúde humana. / Salmonella, one of the most important food borne pathogen due to the widely distribution in nature, large number of reservoirs, to show unspecific host serotypes and provide multiresistant strains to antibiotics. Salmonella Enteritidis became a big public health problem in Brasil, since 80’s, when it was correlated with poultry products. Since 1962, Salmonella Heidelberg has been isolated from birds and poultry products in Brazil, with importance in human health and layers in North America. The present work aimed to the study of different strains of Salmonella Heidelberg (SH) and compared with Salmonella Enteritidis (SE) in chicks and broiler chickens with regard to the ability of invasibilidade of organs, persistence of fecal excretion and changes in intestinal morphometry. For the in vivo study, 65 isolates of SH were evaluated for the presence of virulence genes invA, lpfA and agfA and differentiated by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Another objective was to test a organic acids and essential oils mixture for controlling SE fecal excretion. Two not related SH samples by the method of PFGE (SH23 and SH35) and a standard strain of SE were selected to the poultry inoculation. The three strains promoted changes in the measures of villi and crypts of the chicks intestine, when compared to the control group. The SH35strain promoted greater inflammatory reaction in the caeca. Both strains tested were able to achieve the chicks liver at 6 hours post inoculation. Both strains, SE and SH, showed persistence and intermittence of fecal excretion in broiler chickens until the 21days post-infection. The organic acids and essential oils mix was effective in reducing the SE fecal excretion, but only with the continuous use of the mix added to the feed. The strains showed different behavior when inoculated in broiler chickens, and because of the persistence of these strains in the chickens intestines, injury to birds may occur, while the subsequent carcasses contamination represents risk to human health.

Este trabalho teve como objetivo geral avaliar os fatores de risco de disseminação da Doença de Newcastle relacionados ao trânsito de veículos entre empresas integradoras e unidades de produção de frangos de corte. Uma área de grande produção avícola do estado do Rio Grande do Sul foi escolhida para ser objeto de estudo da presente pesquisa, sendo simuladas a partir de uma granja índex, as zonas de proteção e vigilância, como determina o Plano de Contingência para a Influenza Aviária e Doença de Newcastle. A metodologia foi fundamentada em análises espaciais e probabilísticas, associadas a situações reais que fazem parte do processo de logística das empresas. Foi realizada a análise espacial da região, através de técnicas de geoprocessamento, a extração da taxa reprodutiva básica, estudo exploratório da proporção de alojamento de frangos de corte e desenvolvimento do modelo epidêmico clássico de Reed-Frost, avaliando assim, as possibilidades de disseminação da doença na área de estudo. Os resultados obtidos demonstraram que somente o trânsito referente a visitas técnicas e caminhões de ração nas unidades de produção são fatores que podem desencadear um surto da doença. Quanto mais rápido for obtido o diagnóstico definitivo e tomadas medidas de contenção, menor é a probabilidade de disseminação da doença. / This thesis had as general objective to evaluate the factors of risk of spread of the Newcastle Disease related to the traffic of vehicles between companies and poultry farms. An area of great poultry production of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, was chosen to be object of study of the present researches, being simulated starting from a farm index, the protection areas and surveillance, as it determines the Plan of Contingency for Avian Influenza and Newcastle Disease. The methodology was based in space analyses and probability, associated to real situations that are part of the process of logistics of the companies. The space analysis of the area was accomplished, through the use of geographical information systems, the extraction of the basic reproductive rate, study exploratory of the proportion of lodging of cut chickens and development of the model epidemic classic of Reed-Frost, evaluating like this, the possibilities of spread of the disease in the study area. The obtained results demonstrated that only the traffic regarding technical visits and ration trucks in the units of production is factors that can unchain an outbreak of the disease. The more fast it be obtained the definitive diagnosis and sockets contention measures, minor is the probability of spread of the disease.

A Salmonella sp permanece com um dos mais importantes patógenos transmissores de enfermidades veiculadas através dos alimentos em todo mundo. A carne de aves está entre as principais causadoras das toxinfecções alimentares quando contaminadas pelo gênero Salmonella. Neste estudo foram isolados 280 sorovares de Salmonella das carcaças de frango e peru através do Programa de Redução de Patógenos (PRP-MAPA) na região sul do país. A maior prevalência ocorreu para a Salmonella Enteritidis (55,7%). Nas carcaças de frango, a S. Enteritidis alcançou 63,3% dos isolados, porém nas carcaças de peru este sorovar não passou dos 14,0%. Entre os estados do sul (PR, SC e RS), não houve diferenças nos isolados de S.Enteritidis. Foram 25 os sorovares de Salmonella sp isolados das carcaças de aves. Destes apenas 14 em perus e 23 nos frangos. A S. Tennessee e Salmonella enterica subespecie enterica (O: 4,5), foram isoladas somente em carcaças de perus e a S. Hadar foi a mais prevalente, 18,6%. Nos testes de difusão em placas, foram desafiadas 178 cepas frente a 24 antimicrobianos. Todas as cepas de Salmonella sp foram resistentes a bacitracina e a penicilina e 78,2% apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano quando excluídas as drogas anteriormente citadas, sendo que todas as amostras foram sensíveis a amoxicilina + ácido clavulânico, polimixina B, ciprofloxacina e norfloxacina. A maior taxa de resistência das amostras foi observada frente ao ácido nalidíxico de 52,2%, seguido da nitrofurantoína (28,8%), neomicina (14,6), tetraciclina (12,4%) e canamicina (10,1%). Nas amostras isoladas de perus estes índices foram maiores para o ácido nalidíxico (62,8%), tetraciclina (34,9%) e neomicina (30,2%), havendo diferenças significativas para os dois últimos quando comparados aos isolados de frango. Embora o índice de resistência a enrofloxacina de 2,2% no segmento aves seja baixo, chama atenção que, por tratar-se de um antimicrobiano quimicamente modificado a taxa de resistência nas amostras de perus tenha sido de 9,3%.O sorovar S. Enteritidis apresentou a maior taxa de resistência ao ácido nalidíxico (72,0%) e menor para tetraciclina (1,1%). Por outro lado, foi comprovada a presença de cepas multiresistentes em 46,1% dos isolados das carcaças de aves, principalmente nas amostras de perus nos sorovares S. Hadar e S. Saintpaul, que foram resistentes no mínimo a quatro e no máximo onze antimicrobianos. Este estudo demonstrou qual a prevalência e o perfil de resistência aos antimicrobianos dos sorovares de Salmonella sp isoladas das carcaças de aves na região Sul do Brasil e devido a sua importância em saúde animal e saúde pública, pode sugerir a criação de um Programa Nacional de Monitoramento da Resistência Bacteriana aos Antimicrobianos. / Salmonella sp remains as one of the most important foodborne pathogens worldwide. Poultry meat is among the most frequently involved foods regarding human food poisoning cases. In this study, two hundred and eighty Salmonella isolates were detected from broiler and turkey carcasses submitted to the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Supply (MAPA)´s Pathogens Reduction Program (PRPMAPA) in Southern Brazil. Twenty five Salmonella serovars were isolated in the poultry carcasses, being 14 in turkey and 23 in broilers. The most prevalent serovar was Salmonella Enteritidis (57,7%). In broiler carcasses, S. Enteritidis reached a 63,3% prevalence, while in turkeys carcasses this serovar presented a comparatively lower index (14,0%). Among the Brazilian Southern States (PR, SC and RS) there were no significative differences in the percentage of isolated S. Enteritidis. S. Tennessee and Salmonella enterica subspecies enterica (O: 4,5) were isolated in turkeys, but not in broiler carcasses. S. Hadar was most prevailing in turkeys (18,6%). Regarding the diffusion test applied to 178 isolates, they were challenged against 24 antimicrobials. As expected, all isolates were resistant to bacitracin and penicillin, while 78,2% presented resistance to at least one antimicrobial drug when the ones above were excluded. All samples were sensitive to amoxicillin + clavulanic acid, polymixin B, cyprofloxacin and norfloxacin. The highest resistance rate was observed against nalidixic acid (52,2%), followed by nitrofurantoin (28,8%), neomycin (14,6%), tetracycline (12,4%) and canamycin (10,1%). In turkeys the rates were higher to nalidixic acid (62,8%), tetracycline (34,9%) and neomycin (30,2%) showing significant differences for the latter two when compared to the ones isolated in broilers. S. Enteriditis isolates showed a higher resistance to nalidixic acid (72,0%) and lower to tetracycline (1,1%). Presence of multiresistant isolates was proven in 46,1% of the isolated poultry carcasses, mainly in the turkey samples related to the presence of S. Hadar and S. Saintpaul serovars, which were resistant to at least four to a maximum of eleven antimicrobials. This study was able to demonstrate the prevalence and the antimicrobial resistance profile of Salmonella serovars isolated from poultry carcasses in Southern Brazil. These findings reinforce the need for the creation of a National Antimicrobial Resistance Monitoring Programme in Brazil, which will be able to contribute to an overdue controlled use of these drugs in food producing animals.

A enterite necrótica causada por Clostridium perfringens é, comprovadamente, um grande problema para frangos de corte, seja sob a forma clínica ou subclínica , com elevados prejuízos produtivos. Em perus, não está claramente identificada a influência deste patógeno sobre os resultados produtivos, e provavelmente por razões econômicas, o volume de pesquisa nesta área é limitado. Em dois experimentos consecutivos, conduzidos em granjas experimentais diferentes, e sobre cama nova e reutilizada, perus de 14 dias, sem medicação com anticoccidianos, foram inoculados, a partir de uma amostra de campo patogênica, com uma superdosagem de aproximadamente 1 x 1010 UFC/ml de Clostridium perfringens, tipo A; bactéria anaeróbica Gram positiva, que compõe a microflora intestinal dos perus. Lesões necróticas severas, com grande destruição da mucosa intestinal, foram observadas após o 4º dia de inoculação. Nos dois experimentos, a resposta dos perus à infecção foi diferente da descrita em frangos de corte. A mortalidade foi muito baixa ou nula e a recuperação das aves, independente da medicação utilizada, foi rápida com pouco ou nenhum comprometimento zootécnico. Escores das lesões histológicas foram desenvolvidos, para tentar correlacionar as lesões macroscópicas com as lesões microscópicas, mas a correlação foi baixa. Frente ao alto desafio observado, não foi possível avaliar adequadamente a ação do antimicrobiano utilizado. As respostas frente aos desafios de Clostridium perfringens nos perus, aparentam ser diferentes em relação às observadas em frangos de corte, sendo necessária cautela ao extrapolar padrões de uma espécie para outra. O uso de critérios subjetivos nas avaliações podem comprometer a tomada de decisão em relação aos tratamentos e as respostas esperadas. / Necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens represents a major challenge in broilers, causing clinical or sub clinical diseases, and results in important economic losses for the poultry industry. In turkeys, however, the importance of this pathogen is not clearly defined, and there are few studies assessing its effects on the performance of turkeys, most probably for economic reasons. In two consecutive trials, conducted in two experimental farms, 14 day old turkey poults were reared on new and reused wood shavings litter, without any anticoccidials in the feed, and were inoculated with an overdose of approximately 1x1010 CFU/ml of a pathogenic field sample of Clostridium perfringens type A. This Gram positive anaerobic bacterium is a normal inhabitant of the gut micro flora in the enteric tract of turkeys. Severe necrotic lesions, with major damage to the intestinal mucosa were observed on Day 4 after inoculation. In both trials, the response to the turkeys to the clostridial infection was clearly different from what is described in the literature for broilers. The mortality rate was very low or inexistent, and the birds in all treatments groups recovered very fast, with little or no impact on performance results. An attempt was made to establish a pattern to correlate histological lesion scores with macroscopic and microscopic lesions, but the resulting correlation was very low. Considering the high level of challenge induced in both trials, it was not possible to evaluate in activity of the antibiotic in proper terms. The response of turkeys to a high level of challenge with Clostridium perfringens seems to be different when compared to what is observed in broilers under similar experimental conditions, and caution should be applied when using the same diagnostic methods for different species. The use of subjective criteria to assess and describe the lesions can lead to erroneous treatments decisions and misinterpretation of the responses to treatment.

Com a expansão da avicultura, ocorreu um aumento no número de aves alojadas, concentrando as produções e, consequentemente, facilitando a disseminação de doenças. Entre as doenças transmitidas pelo consumo dos produtos avícolas, a salmonelose tem especial importância. Nos últimos anos tem ocorrido um aumento na prevalência do sorovar Salmonella Enteritidis em todo o mundo, sendo o mais isolado. A patogenia da Salmonella e a forma como ela interage com seu hospedeiro são fenômenos multifatoriais e complexos. Entre os principais fatores de virulência da Salmonella estão os genes de virulência. O objetivo deste trabalho foi a pesquisa de genes associados à virulência em cepas de S. Enteritidis oriundas de diferentes origens avícolas. Realizou-se a pesquisa de nove genes de virulência (lpfA, agfA, sefA, invA, hilA, avrA, sopE, sivH, spvC) em 84 amostras de S. Enteritidis. Os genes invA, hilA, sivH, sefA e avrA estiveram presentes em 100% das amostras (84/84); lpfA e sopE em 99% (83/84); agfA em 96% (81/84); e o gene spvC em 92% (77/84). Foi possível caracterizar as amostras em quatro diferentes perfis genéticos, sendo P1 positivo para todos os genes, P2 negativo apenas para spvC, P3 negativo apenas para agfA e P4 negativo para lpfA, spvC e sopE, sendo o grupo P1 o mais prevalente. Apesar de todas as cepas pertencerem a um mesmo sorovar, observou-se uma variação na presença dos genes de virulência. Os perfis estabelecidos e as frequências obtidas podem servir para a escolha de cepas a serem utilizadas para realização da PFGE e em futuros estudos in vivo. / The poultry industry has been characterized by an increase in the number of housed animals in recent years, concentrating the production and facilitating the spread of many diseases. Among all illness transmitted by food, including meat and eggs, salmonellosis is of particular importance. Currently, there has been an increase in prevalence of islament of Salmonella Enteritidis all around the world. The pathogenesis of Salmonella and how it interacts with the host are a complex and multifactorial phenomenon. Among virulence factors of Salmonella, the virulence genes are the most important. The aim of this survey was to search for genes associated with virulence in strains of S. Enteritidis isolated from different origins, all from poultry. We conducted a search of nine virulence genes (lpfA, agfA, sefA, invA, hilA, avrA, sopE, sivH, spvC) in 84 samples of S. Enteritidis. The genes invA, hilA, sivH, sefA e avrA were present in 100% of samples (84/84); lpfA and sopE in 99% (83/84); agfA in 96% (81/84); and spvC in 92% (77/84) of them. It was possible to characterize the samples in four different genetic profiles, P1 being positive for all genes, P2 negative only for spvC, P3 negative only for agfA and P4 negative for lpfA, sopE and spvC. The P1 was the most prevalent. Despite all the strains belong to the same serovar, it is possible to observe a variation in the presence of virulence genes. These established profiles and gene frequencies obtained are useful to select strains to be used in PFGE and in future in vivo studies.

O uso de antimicrobianos de forma terapêutica, preventiva e promotora de crescimento trouxe inúmeras vantagens para a avicultura mundial, entretanto a utilização excessiva dos antimicrobianos e de maneira indevida tem estimulado um aumento no número de micro-organismos resistentes. Entre eles, destaca-se o Campylobacter jejuni, bactéria frequentemente associada a enterites em humanos, sendo o frango a principal reservatório e fonte de transmissão deste patógeno para o homem. A transmissão de bactérias resistentes entre animais e seres humanos pode resultar em infecções multirresistentes e insucesso no tratamento terapêutico, sendo a exposição continua destes micro-organismos a esses medicamentos o fator mais importante na origem da resistência. Diante desse cenário, objetivou-se nesse trabalho investigar e caracterizar, através de métodos fenotípico e genotípico, a susceptibilidade antimicrobiana de 54 isolados de C. jejuni coletados em diferentes etapas do processamento da carne de frango de matadouro-frigoríficos da região do Rio Grande do Sul. Para a determinação do MIC, os isolados foram testados frente aos seguintes antimicrobianos: ácido nalidíxico, ciprofloxacina, cloranfenicol, eritromicina, gentamicina e tetraciclina. Dos 54 isolados de C. jejuni, 94,4% foram resistentes a ciprofloxacina, 83,3% ao ácido nalidíxico, 51,8% a tetraciclina e 48% a eritromicina. Todos os isolados foram sensíveis a gentamicina e ao cloranfenicol. Doze isolados foram resistentes a três classes diferentes de antibióticos, sendo assim considerados multi-resistentes. Para verificar a presença da mutação gênica da Região Determinante de Resistência à Quinolona (RDRQ) no gene gyrA, foi realizado sequenciamento gênico de 31 isolados considerados resistentes por métodos fenotípicos. Todos os isolados possuíam a mutação Tre-86-Ile na RDRQ do gene gyrA, que confere resistência às fluoroquinolonas, confirmando a predominância dessa mutação em Campylobacter spp. resistentes a esses antimicrobianos. A ocorrência do gene de resistência à tetraciclina foi verificada por PCR. Dos 28 isolados considerados resistentes por métodos fenotípicos, 42,8% possuíam o gene tet(O), que confere resistência as tetraciclinas. Os resultados mostram um alto nível de resistência antimicrobiana em C. jejuni evidenciando a necessidade da implementação de políticas de uso prudente de antimicrobianos na medicina veterinária. / The use of antimicrobials in a therapeutic, preventive and growth promoting way has brought numerous advantages to the world poultry industry; however, the excessive and undue use of antimicrobials has stimulated an increase in the number of resistant microorganisms. Among them, we highlight Campylobacter jejuni, a bacterium frequently associated with enteritis in humans, with chicken being the main reservoir and source of transmission of this pathogen to man. The transmission of resistant bacteria between animals and humans can result in multi resistant infections and failure in therapeutic treatment, and the continued exposure of these microorganisms to these drugs is the most important factor in the source of resistance. Therefore, the aim of this study was to investigate and characterize, through phenotypic and genotypic methods, the antimicrobial susceptibility of 54 C. jejuni isolates collected at different stages of the processing of chicken meat from slaughterhouse in Rio Grande do Sul. For MIC determination, strains were tested against the following antimicrobials: nalidixic acid, ciprofloxacin, chloramphenicol, erythromycin, gentamicin and tetracycline. Of the 54 isolates of C. jejuni, 94.4% were resistant to ciprofloxacin, 83.3% to nalidixic acid, 51.8% to tetracycline and 48% to erythromycin. All isolates were sensitive to gentamicin and chloramphenicol. Twelve strains were resistant to three different classes of antibiotics, thus being considered multi resistant. To verify the presence of the gene mutation of the Quinolone Resistance Determinant Region (QRDR) in the gene gyrA, gene sequencing of 31 strains considered resistant by phenotypic methods was performed. All strains had the Tre-86-Ile mutation in the QRDR of the gyrA gene, which confers resistance to fluoroquinolones, confirming the predominance of this mutation in Campylobacter spp. resistant to these antimicrobials. The occurrence of tetracycline resistance gene was verified by PCR. Of the 28 strains considered resistant by phenotypic methods, 42.8% had the tet(O) gene. The results show a high level of antimicrobial resistance in C. jejuni that evidences the need for implementation of policies in the prudent use of antimicrobials in veterinary medicine.

A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

Pasteurella multocida, apesar de ser uma bactéria que compõe a microbiota respiratória, sob algumas circunstâncias pode manifestar-se como um agente patogênico primário ou secundário, causando doença em aves e outros animais. Como agente primário, P. multocida leva a grandes perdas econômicas, causando cólera em aves, rinite atrófica em suínos e septicemia hemorrágica em bovinos e bubalinos. P. multocida é uma espécie heterogênea, e a patogenicidade dos isolados pode ser amplamente variável. A suscetibilidade do hospedeiro à essas cepas varia consideravelmente entre espécies. Inoculações experimentais de P. multocida em camundongos e aves são comumente usadas para avaliar a patogenicidade de diferentes cepas, mas os resultados são geralmente subjetivos e pouco mensuráveis. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma nova metodologia para classificar a patogenicidade de cepas de P. multocida, através da formulação de um índice padrão. Para determinar esse índice, foram usadas 97 amostras de P. multocida, isoladas de cólera em aves e rinite em suínos. Cem microlitros (105 UFC) de uma cultura bacteriana contendo 106 UFC/mL, de cada isolado de P. multocida foram inoculados, por via intraperitoneal, em 10 pintos de um dia. Além da mortalidade causada pela inoculação, o tempo de morte e as lesões macroscópicas foram avaliados. Diferenças significativas foram observadas entre isolados de aves e suínos em relação aos índices de patogenicidade. O número de lesões e a porcentagem de bactérias recuperadas dos animais inoculados também variaram de acordo com a origem do isolado. A partir dos indices observados, os isolados foram distribuídos em três classes de patogenicidade: alta, média e baixa. O índice de patogenicidade desenvolvido neste trabalho permite a mensuração e classificação da patogenicidade de isolados de P. multocida e pode ser uma alternativa aos modelos subjetivos de triagem de patogenicidade usados até o momento. / Pasteurella multocida, despite being a bacteria that makes up the respiratory microbiota, under some circumstances can manifest as primary or secondary pathogenic agent, causing disease in birds and other animals. As primary agent, P. multocida leads to large economic losses, causing fowl cholera in birds, atrophic rinitis in swine and haemorragic septicemia in cattle and buffalos. P. multocida is a heterogeneous specie, and the pathogenicity of the samples can be widely variable. Host susceptibility to these strains varies considerably between species. Experimental inoculations of P. multocida in mice and birds are commonly used to evaluate the pathogenicity of the different strains, but the results are generally subjective and difficult to evaluate them. The aim of this work was to establish a new methodology to classify the pathogenicity of a specific strain, through the formulation of a standard score. To determine this score, we used 97 samples of P. multocida, from fowl cholera in birds and rhinitis in swine. One-hundred microliters (105 CFU) of bacterial culture containing 106 CFU/mL of each P. multocida isolate were inoculated, by intraperitoneal route, in 10 one-day-old chicks. Besides mortality caused by the inoculation, time of death and gross lesions were also evaluated. Significant differences were observed between avian and swine isolates in relation to pathogenicity scores. The number of lesions and the percentage of bacteria recovered from the inoculated animals also varied according to the origin of the isolate. From the observed scores, the isolates were distributed into three pathogenicity classes: high, medium and low. The pathogenicity score developed here allows the measurement and classification of the pathogenicity of P. multocida isolates and can be an alternative to subjective current models of pathogenicity screening used so far.

Membros termofílicos do gênero Campylobacter são reconhecidos como importantes enteropatógenos para o ser humano e animais. A grande diversidade ecológica destes microorganismos em diferentes habitats tais como: água, animais e alimentos predispõem ao aparecimento de novos fatores de virulência. Este trabalho teve por objetivo detectar os genes codificantes da Toxina Distensiva Citoletal (CDT) por meio da técnica de PCR, pesquisar a atividade de hemolisinas e a influência de soluções quelantes e de íons nesta atividade. Foram utilizadas 45 amostras de C. jejuni de origem avícolas para pesquisa de atividade hemolítica, cultivadas em Caldo Triptona de Soja (TSB). Após o crescimento bacteriano, as amostras foram semeadas em Ágar tríptico de soja (TSA) contendo 5% de sangue de ovino, equino e bovino, sendo cada sangue testado isoladamente. Para verificar a influência de agentes quelantes e solução de íons na atividade hemolítica, as amostras de C. jejuni foram cultivadas em TSB contendo separadamente os quelantes EDTA, ácido acético, soluções de íons CaCl2 , MgCl2 e FeCl3, em atmosfera de microaerofilia. Quanto à atividade de hemolisina de Campylobacter jejuni em placas de TSA – sangue, foi possível observar que houve hemólises em 48,89% das amostras quando utilizado sangue eqüino, em 40% em sangue de bovino e em 31,11% quando de ovino. Quanto à influência de agentes quelantes e íons em caldo TSB na atividade de hemolisinas em amostras de Campylobacter jejuni semeadas em placas de TSA – sangue ovino, foi observada atividade hemolítica em 26,67% quando utilizado CaCl2, 15,55% (FeCl3), 22,22% (EDTA), 11,11% (MgCl2) e apenas 2,22% (ácido acético). No tocante à atividade hemolítica, o TSA - sangue bovino apresentou 15,55% (CaCl2), 24,44% (FeCl3), 26,26% (EDTA), 20% (MgCl2) e 11,11% (ácido acético). A atividade hemolítica para o sangue equino foi de 24,44% (CaCl2), 22,22% (FeCl3), 28,89% (EDTA), 28,89% (MgCl2) e 8,89% (ácido acético). Para detecção dos genes cdtA, cdtB e cdtC através da técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR), foram utilizadas 119 amostras de C. jejuni de origem avícolas. Foi possível observar que 38% possuíam os três genes, e foram identificados somente os genes cdtA e cdtC em 19% do total de amostras, sendo que o gene cdtB foi encontrado em 14%, o gene cdtC foi observado em 12%, os genes cdtA e cdtB em somente 1%, os genes cdtB e cdtC em 1% e para cdtA em 1%. Observou-se que os resultados são dignos de atenção, pois demonstraram em amostras avícolas a presença de estirpes de C. jejuni com potencial virulento. A atividade hemolítica apresentou significativo aumento quando utilizado sangue de origem equina. A mesma foi diminuída quando utilizados agentes quelantes ou íons, nos três tipos de sangue. / Thermophilic members of the Campylobacter genus are recognized as important enteropathogenics for humans and also for other animals. The great diversity of ecological habitats in different organisms such as water, food, and animals may promote new virulence factors. This study aimed at detecting the distending cytolethal toxin (CDT) encoding genes by PCR, studying the activity of hemolysin and also the influence of chelation solutions and ions. A total of 45 samples of C. jejuni from poultry origin, grown in Tryptone Soy Broth (TSB) were used for investigating hemolytic activity. After bacterial growth, samples were plated on Tryptic Soy Agar (TSA) containing 5% sheep, equine or bovine blood, being each blood tested individually. In order to check the influence of chelation agents and ions solution on the hemolytic activity, samples of C. jejuni strains were grown in TSB containing chelation agents individually: EDTA, acetic acid, CaCl2 ion, MgCl2 and FeCl3 solutions, all in microaerophilic atmosphere. Regarding the detection of Campylobacter jejuni hemolysin activity on TSA plates, blood hemolysis were observed in 48.89 % of samples when equine blood was used; in 40% of samples when bovine blood was used and in 31.11 % when the blood used was of sheep origin. The influence of ions and chelation agents in hemolysin activity in TSB when Campylobacter jejuni was plated on TSA with sheep blood can be described as: hemolytic activity was observed at 26.67% of samples when CaCl2 was used, at 15.55 % for FeCl3, 22 22 % for EDTA, 11.11 % for MgCl2 and only 2.22% when acetic acid was used. The hemolytic activity detected when bovine blood - TSA was used indicated 15.55% for CaCl2, 24.44% for FeCl3, 26.26 % for EDTA, 20 % for MgCl2 and 11.11% for acetic acid. In terms of the hemolytic activity when equine blood was used, the results indicated 24.44% for CaCl2, 22.22 % for FeCl3, 28.89 % for EDTA, 28.89 % for MgCl2 and 8.89% for acetic acid. Finally, regarding the detection of cdtA, cdtB and cdtC through PCR, 119 samples of C. jejuni from poultry origin were used. The results indicated that all three genes were present in 38 % of the samples, whereas only two genes were identified in 19 % of samples, while the cdtB gene was singly found in 14%, the cdtC gene was independently observed in 12%, cdtA and cdtB genes together were found in 1% of the samples; the cdtB and cdtC genes associated were detected in 1%, while cdtA alone answered for 1% of detections. The results also showed the presence of C. jejuni strains with virulence potential. The hemolytic activity increased significantly when blood of equine origin was used, and that this activity was reduced when ions or chelating agents were used in combination with the three types of blood cells.

A Doença Infecciosa da Bolsa de Fabrício (DIB) é uma doença viral altamente contagiosa que afeta as galinhas nas primeiras semanas de vida. Ela pode causar altas taxas de morbidade e mortalidade dependendo da cepa viral envolvida no surto. Como o vírus é muito resistente no ambiente, a vacinação é requerida em alta pressão de infecção. Devido às variações no grau de virulência das vacinas disponíveis para o controle da DIB, o presente estudo objetivou avaliar a patogenicidade e imunogenicidade de três vacinas comerciais: as vacinas recombinante, complexo-imune e intermediária. Quatro grupos com 55 aves specific pathogen free (SPF) cada foram imunizadas no primeiro dia e desafiadas aos 25 dias com a cepa muito virulenta G11 para verificar o grau de proteção conferido pelas vacinas. As aves foram examinadas, sangradas, eutanaziadas e necropsiadas aos 25, 30 e 35 dias de idade. As bolsas de Fabrício (BF) foram coletadas, pesadas, mensurados seus diâmetros e pesos relativos e submetidas ao exame histopatológico para verificar a presença de lesões. Amostras de soro foram submetidas ao teste de ELISA para quantificação dos anticorpos contra a DIB. Aos 23 dias de idade, as aves SPF foram submetidas à prova de hipersensibilidade cutânea à fitohemaglutinina para avaliar o efeito das vacinas sobre a imunidade celular. Os resultados mostraram que a vacina complexo-imune induziu a maior redução no peso relativo e diâmetro e o maior grau de lesões nas BF. A vacina recombinante foi a que apresentou os melhores resultados, preservando a integridade tecidual e celular das BF. A vacina intermediária apenas induziu um discreto grau de atrofia nas BF. As análises sorológicas, antes do desafio, revelaram que as três vacinas testadas induziram com a mesma intensidade a imunidade humoral das aves SPF, apresentando semelhantes títulos de anticorpos. A avaliação da imunidade celular mostrou que a resposta à fitohemaglutinina das aves SPF imunizadas com as vacinas recombinante e complexo-imune foi menor do que as aves do grupo não vacinado. Nas condições em que o experimento foi conduzido verificou-se que a vacina complexo-imune é a mais patogênica, causando lesões em maior número e severidade nas BF. Todas as vacinas, quando administradas no primeiro dia, são eficazes em proteger as aves SPF contra o desafio com a cepa muito virulenta G11. / Infectious Bursal Disease (IBD) is a highly contagious viral disease that affects chickens in their first weeks of life. It may cause high morbidity and mortality depending on the strain involved in the outbreak. As the virus is very resistant to the environment, vaccination is required under high pressure of infection. Hence, due to variations in the degree of the virulence of vaccines available to control DIB, this study aimed to evaluate the pathogenicity and immunogenicity of three vaccines against Infectious Bursal Disease (IBD): recombinant, immune-complex and intermediate vaccines. Four experimental groups, with fifty-five specific pathogen free (SPF) chickens each, were vaccinated on the first day and challenged on the twenty-fifth day with the very virulent G11 strain in order to verify the protection conferred by the vaccines. The Chickens were examined, bled, euthanized and necropsied on the twenty-fifth, thirtieth and thirty-fifth days of age, and the Bursas of Fabricius (BF) were collected, weighed, having their diameter and relative weight measured, were subjected to histological examination to verify the presence of lesions, Serum samples were subjected to ELISA for the quantification of antibodies against IBD. On the twenty-third day of age, the chickens were submitted to cutaneous basophil hypersensitivity test at phytohemagglutinin to evaluate the immunosuppressive effect of the vaccines on the cell-mediated immunity. The results indicated that the immune-complex vaccine induced not only the greatest reduction in relative weight and diameter, but also the greatest lesion degree on the BF. The recombinant vaccine showed the best results, preserving the tissue and cellular integrity of the BF. The intermediate vaccine induced only a slight degree of atrophy on the BF. The intermediate vaccine induced only a slight degree of atrophy on the BF. The serological analyses, before the challenge, revealed that the three tested vaccines induced humoral immunity of SPF chickens with the same intensity, presenting similar antibody titers. In addition, the evaluation of the cellmediated immunity demonstrated that the cellular reaction to phytohemagglutinin of the immunized SPF chickens with the recombinant and immune-complex vaccines was smaller than the unvaccinated group. Thus, these results have indicated that, under the conditions of the experiment, the immune-complex vaccine is the most pathogenic, causing the highest atrophy degrees on the BF. Therefore, all vaccines, when administered on the first day, are considered effective to protect SPF chickens against the challenge with the very virulent G11 strain.