Im Zebrafisch (Danio rerio) ist ein Protein identifiziert worden, das eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Brustflossen zu besitzen scheint und als Fibin, dem englischen Akronym für Fin bud initiation factor (Flossenknospeninitiationsfaktor), bezeichnet wurde. Es zeigt keine Verwandtschaft zu anderen bekannten Proteinen, enthält keine typischen Strukturmotive, wird auf nur einem Exon kodiert und ist in allen bisher untersuchten Vertebraten, einschließlich des Menschen, evolutionär hoch konserviert. Ziel der vorliegenden Arbeit war die nähere funktionelle und proteinbiochemische Charakterisierung Fibins. In vielen Geweben adulter Mäuse (Mus musculus), v. a. in zerebralen und muskulären Proben, konnte Fibin mRNA nachgewiesen werden. Im Vergleich zum Adultus war die Expression in Geweben pränataler Mäuse bedeutend höher und unterschied sich in der Region der Vordergliedmaßen kaum von der im Torso. In L929 (Fibroblasten) und HEK Zellen (embryonale Nierenzellen) wurde eine hohe Expression von Fibin nachgewiesen, die in L929 Zellen durch Glukokortikoide und Aktivatoren des Proteinkinase C / MAP-Kinase , Proteinkinase A sowie des NF-κB / AP-1 bzw. Nrf2 / ARE Signalwegs erhöht werden konnte. Die nicht-proteinkodierende 5‘ Region des humanen Fibin Gens zeigte im Luciferase Reporterassay in L929 und HEK Zellen promotogene Eigenschaften, mit einem Aktivitätsmaximum der Sequenz – 836 Basenpaare bezogen auf den Translationsstartpunkt. In L929 Zellen wurde die promotogene Aktivität durch Glukokortikoide und Aktivatoren des Proteinkinase C / MAP-Kinase- sowie des NF κB / AP 1 bzw. Nrf2 / ARE Signalwegs erhöht. Fibin besitzt eine putative N terminale Signalsequenz und eine N Glykosylierungsstelle, die beide experimentell bestätigt wurden. Rekombinantes Fibin zeigte in der Fluoreszenzmikroskopie in COS-7 Zellen (Fibroblasten) eine hohe Kolokalisation mit dem Endoplasmatischen Retikulum, jedoch nur eine geringe mit dem Golgi Apparat. In COS-7 Zellen wurde es nicht über den sekretorischen Weg freigesetzt und zeigte in proteinbiochemischen Untersuchungen eine hohe Tendenz zur Aggregation und Ausbildung von Disulfidbrücken. Es ist anzunehmen, dass Fibin möglicherweise ein bisher unbekanntes Protein für die Ausbildung von Heteromeren benötigt, um erfolgreich sezerniert zu werden.

Berlin, Freie Universität, Thesis (doctoral), 2002.

Ulm, Univ., Diss., 2008.

Stuttgart, Univ., Diss., 2006.

Im Zebrafisch (Danio rerio) ist ein Protein identifiziert worden, das eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Brustflossen zu besitzen scheint und als Fibin, dem englischen Akronym für Fin bud initiation factor (Flossenknospeninitiationsfaktor), bezeichnet wurde. Es zeigt keine Verwandtschaft zu anderen bekannten Proteinen, enthält keine typischen Strukturmotive, wird auf nur einem Exon kodiert und ist in allen bisher untersuchten Vertebraten, einschließlich des Menschen, evolutionär hoch konserviert. Ziel der vorliegenden Arbeit war die nähere funktionelle und proteinbiochemische Charakterisierung Fibins. In vielen Geweben adulter Mäuse (Mus musculus), v. a. in zerebralen und muskulären Proben, konnte Fibin mRNA nachgewiesen werden. Im Vergleich zum Adultus war die Expression in Geweben pränataler Mäuse bedeutend höher und unterschied sich in der Region der Vordergliedmaßen kaum von der im Torso. In L929 (Fibroblasten) und HEK Zellen (embryonale Nierenzellen) wurde eine hohe Expression von Fibin nachgewiesen, die in L929 Zellen durch Glukokortikoide und Aktivatoren des Proteinkinase C / MAP-Kinase , Proteinkinase A sowie des NF-κB / AP-1 bzw. Nrf2 / ARE Signalwegs erhöht werden konnte. Die nicht-proteinkodierende 5‘ Region des humanen Fibin Gens zeigte im Luciferase Reporterassay in L929 und HEK Zellen promotogene Eigenschaften, mit einem Aktivitätsmaximum der Sequenz – 836 Basenpaare bezogen auf den Translationsstartpunkt. In L929 Zellen wurde die promotogene Aktivität durch Glukokortikoide und Aktivatoren des Proteinkinase C / MAP-Kinase- sowie des NF κB / AP 1 bzw. Nrf2 / ARE Signalwegs erhöht. Fibin besitzt eine putative N terminale Signalsequenz und eine N Glykosylierungsstelle, die beide experimentell bestätigt wurden. Rekombinantes Fibin zeigte in der Fluoreszenzmikroskopie in COS-7 Zellen (Fibroblasten) eine hohe Kolokalisation mit dem Endoplasmatischen Retikulum, jedoch nur eine geringe mit dem Golgi Apparat. In COS-7 Zellen wurde es nicht über den sekretorischen Weg freigesetzt und zeigte in proteinbiochemischen Untersuchungen eine hohe Tendenz zur Aggregation und Ausbildung von Disulfidbrücken. Es ist anzunehmen, dass Fibin möglicherweise ein bisher unbekanntes Protein für die Ausbildung von Heteromeren benötigt, um erfolgreich sezerniert zu werden.:INHALTSVERZEICHNIS BIBLIOGRAPHISCHE BESCHREIBUNG ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS EINFÜHRUNG IN DIE THEMATIK 1. Wachstumsfaktoren und ihre Bedeutung für den Organismus 2. Fibin – ein neuer Wachstumsfaktor ? 3. Rationale der Charakterisierung von Fibin 4. Analyse der Fibinexpression und regulatorische Einflüsse auf die Expression in vitro 5. Notwendigkeit der rekombinanten Expression 6. Fibin als sekretorisches Protein 7. Untersuchungen zur molekularen Architektur von Fibin 8. Zusammenfassung und Ausblick 9. Literaturverzeichnis PUBLIKATION ZUSAMMENFASSUNG ANLAGEN I. Ergänzungsunterlagen zur Publikation II. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Dissertation III. Curriculum vitae cand. med. Christian Seyer IV. Danksagung

KCNE-Hilfsuntereinheiten assoziieren mit Spannungs-abhängigen K+-Kanälen und verändern dadurch deren subzelluläre Lokalisation, Regulation sowie deren biophysikalische Eigenschaften. Bei heterologer Expression interagiert KCNE3 mit mehreren Poren-bildenden K+-Kanal-Hauptuntereinheiten, deren Ströme dadurch stark modifiziert werden. Aufgrund dieser in vitro-Experimente wurden verschiedenste Funktionen von KCNE3 in den verschiedenen Geweben, wie Gehirn, Herz, Muskel, Kolon und Niere, vermutet. Außerdem wurden Variationen im kcne3-Gen mit menschlichen Skelettmuskelpathologien in Verbindung gesetzt (Abbott et al. 2001). In der gegenwärtigen Literatur wird die physiologische Funktion von KCNE3 eher als komplex und heterogen dargestellt. Auch die direkte Beteiligung von KCNE3 an Krankheiten ist immer noch spekulativ. Zur Untersuchung der physiologischen Funktion von KCNE3 in vivo sowie der potentiellen Rolle bei Krankheiten generierten wir ein kcne3-/- Mausmodell. Die vorliegende Arbeit unterstützt die kritische Rolle der KCNQ1/KCNE3-Kanäle beim Salz- und Flüssigkeitstransport über intestinale und respiratorische Epithelien. Insbesondere fanden wir für die KCNQ1/KCNE3-Heteromere eine basolaterale Lokalisation in Darm- und Trachea-Epithelzellen, wo sie die transepitheliale Cl--Sekretion über basolaterales Recycling von K+-Ionen sowie über Erhöhung der elektrochemischen Triebkraft für apikalen Cl--Austritt fördern. Da weder Veränderungen in der KCNQ1-Expressionsmenge noch in dessen subzellulärer Lokalisation festgestellt wurden, ist die durch KCNE3 verursachte Modifikation der KCNQ1-Kanaleigenschaften essenziell für die hier beschriebene physiologische Rolle im Intestinal- und Trachealtransport. Ferner wird von unserer Arbeit die postulierte Funktion von KCNE3-Heteromeren im Skelettmuskel, Herz und zentralen Nervensystem nicht unterstützt und erweckt somit erhebliche Zweifel über den Beitrag von KCNE3 zu menschlichen Krankheiten, die mit diesen Organen in Verbindung stehen. / When overexpressed in heterologous systems, KCNE3 is able to interact with several pore-forming K+ channel alpha subunits greatly modifying their currents. Based on these in vitro evidences, KCNE3 has been proposed to serve different roles in multiple tissues, including brain, heart, muscle, colon and kidney. Additional reports have also linked sequence variations in the KCNE3 gene to cardiac and skeletal muscle pathologies in human. Based on the literature, the overall picture of KCNE3 physiological function is rather complex and heterogeneous, and its direct involvement in pathologies is still speculative and far from being conclusively proven. In order to study the physiological role of KCNE3 in vivo and to address its potential pathological implications, we generated kcne3-/- mice. The present analysis of kcne3-/- mice strongly supports a crucial role of KCNQ1/KCNE3 channels in salt- and fluid secretion across intestinal and airway epithelia. In particular, we found that KCNQ1/KCNE3 heteromers are present in basolateral membranes of intestinal and tracheal epithelial cells where they facilitate transepithelial Cl- secretion through basolateral recycling of K+ ions and by increasing the electrochemical driving force for apical Cl- exit. Because the abundance and subcellular localization of KCNQ1 was unchanged in kcne3-/- mice, the modification of biophysical properties of KCNQ1 by KCNE3 is essential for its role in intestinal and tracheal transport. In addition, our work does not support the postulated role of KCNE3 heteromers in skeletal muscle, heart and CNS physiology, and raises considerable doubts concerning its implication in human pathologies which affect these tissues.

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Der Sekretionsweg ist essenziell für die Funktion von Zellen und beginnt, wenn mRNAs, die für Membran- und Sekretionsproteine codieren, an das endoplasmatische Retikulum (ER) gebracht werden. Allerdings ist wenig darüber bekannt, inwiefern RNA-bindende Proteine zur Erkennung und Translation von ER lokalisierten mRNAs beitragen. In dieser Arbeit haben wir das humane RNA-bindende Protein HDLBP charakterisiert. Wir haben durch PAR-CLIP-, Zellfraktionierungs- und RNA-Seqeuenzierexperimente festgestellt, dass HDLBP an mehr als 80% aller ER lokalisierten mRNAs bindet. Analysen zu HDLBPs Bindungsmotiv haben gezeigt, dass HDLBP vorwiegend an ein CU-haltiges Motiv in der codierenden Sequenz (CDS) hauptsächlich von ER lokalisierten mRNAs bindet. Im Gegensatz dazu enthalten zytosolische HDLBP gebundene mRNAs weniger Bindungsstellen und diese treten sowohl in der CDS als auch in 3‘ untranslatierten Regionen auf. Dies zeigt, dass sich ER lokalisierte mRNAs von Zytosol lokalisierten mRNAs in ihrer Sequenzzusammensetzung hinsichtlich der HDLBP Bindungsstellen unterscheiden. Weitere Analysen des PAR-CLIP-Experiments ergaben, dass HDLBP mit RNA-Komponenten des Signalerkennungspartikels (SRP) und der 40S ribosomalen Untereinheit interagiert. Durch BioID-Experimente haben wir Proteine in unmittelbarer Nähe zu HDLBP bestimmt und konnten damit die Assoziation von HDLBP mit Komponenten des Translationsapparates und des SRPs bestätigen. Funktionelle Studien, bei denen wir CRISPR-Cas9 erzeugte HDLBP Knockout (KO) Zelllinien in Kombination mit Ribosomen-Profiling verwendet haben, haben gezeigt, dass HDLBP die Translation von mRNAs fördert, die an HDLBP gebunden und am ER lokalisiert sind. Letztlich haben in vivo Experimente mit Nacktmäusen ergeben, dass HDLBP KO eine Abnahme der Lungentumorbildung verursacht, was die Relevanz von HDLBP für die Tumorprogression hervorhebt. Insgesamt zeigt unsere Arbeit eine generelle Funktion von HDLBP bei der Translation von ER lokalisierten mRNAs. / The secretory pathway is essential for proper cell functioning and starts when mRNAs encoding membrane and secretory proteins are targeted to the endoplasmic reticulum (ER). However, little is known about the contribution of RNA-binding proteins to the recognition, localization and translation of ER-localized mRNAs. In this work, we characterized the human RNA-binding protein HDLBP. We identified that HDLBP binds to more than 80% of all ER-localized mRNAs by PAR-CLIP, cell fractionation and RNA-sequencing experiments. Analysis of the HDLBP binding motif showed that it predominantly binds to a CU-containing motif and forms high affinity multivalent interactions primarily in the coding sequence (CDS) of ER-localized mRNAs. In contrast, we identified that cytosolic HDLBP mRNA targets show less HDLBP binding sites randomly distributed between the CDS or 3’ untranslated regions. This indicates that ER-localized mRNAs per se differ from cytosol-localized mRNAs in their sequence composition with regard to HDLBP binding sites. Further PAR-CLIP analysis revealed that HDLBP interacts with RNA components of the signal recognition particle (SRP) and the 40S ribosomal subunit. We identified by BioID experiments proteins in close proximity to HDLBP and confirmed the association of HDLBP with components of the translational apparatus and the SRP. Functional studies using CRISPR-Cas9 HDLBP knockout (KO) cell lines in combination with ribosome profiling demonstrated that HDLBP promotes the translation of its ER-localized target mRNAs. We validated this finding by pSILAC experiments and detected the corresponding decrease in protein synthesis of proteins encoded by mRNAs that are bound by HDLBP and ER-localized. Lastly, in vivo experiments with nude mice showed that HDLBP KO resulted in a decrease of lung tumor formation highlighting the relevance of HDLBP for tumor progression. Overall, these results demonstrate a general function for HDLBP in the translation of ER-localized mRNAs.

Das Typ III Sekretionssystem (T3SS) ist ein Proteinkomplex den Gramnegative Bakterien nutzen um in einem Schritt Effektorproteine (Effektoren) aus dem Zytosol über die Doppelmembran zu sekretieren. Für viele Bakterien ist das T3SS ein essenzieller Virulenzfaktor, der es ihnen erlaubt mit ihrem Wirt zu interagieren und diesen zu manipulieren. Charakteristisch für das T3SS ist die strukturelle Komponente, der Nadelkomplex. Dieser ähnelt strukturell einer Spritze, deren Basalkörper die bakteriellen Membranen und das Periplasma durchspannt und einer Nadel, die vom Basalkörper aus dem Bakterium ragt. Basierend auf dem Modell einer Spritze wird angenommen, dass Effektoren entfaltet und anschließend durch Basalkörper und Nadelkanal sekretiert werden. Trotz der kontinuierlichen Forschung an T3SS entbehrt dieses Modell einer experimentellen Grundlage und der Mechanismus ist nicht vollständig erklärt. Ziel der Arbeit war es, eine experimentelle Basis für den Sekretionsmechanismus des T3SS zu schaffen. Um zu verstehen, wie das T3SS Effektoren sekretiert, wurden zunächst Fusionsproteine konstruiert, welche aus einem Effektor und einem stabil gefalteten Knotenprotein bestehen. Aufgrund des Knotens in der Fusion ist davon auszugehen, dass dieser während der Sekretion nicht entfalten kann. Die Effektordomäne wird sekretiert während der Knoten im Kanal verbleibt und diesen verstopft. Nach unseremWissen ist diese Arbeit die erste Visualisierung von Effektorfusionen an isolierten Nadelkomplexen. Die Effektorfusion wird N-terminal voran durch den Kanal sekretiert, wobei der Kanal das Substrat umschließt und gegen Proteasen und chemische Modifikationen abschirmt. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern eine Grundidee der Funktionsweise des T3SS und liefern eine vielversprechende Strategie für in situ-Strukturanalysen. Dieser Ansatz lässt sich auch auf andere Proteinsekretionssysteme übertragen, bei welchen Substrate vor dem Transport entfaltet werden müssen. / The Type III Secretion System (T3SS) is a complex used by Gram-negative bacteria to secrete effector proteins from the cytoplasm across the bacterial envelope in a single step. For many pathogens, the T3SS is an essential virulence factor that enables the bacteria to interact with and manipulate their respective host. A characteristic structural feature of the T3SS is the needle complex (NC). The NC resembles a syringe with a basal body spanning both bacterial membranes and a long needle-like structure that protrudes from the bacterium. Based on the paradigm of a syringe-like mechanism, it is generally assumed that effectors are unfolded and secreted from the bacterial cytoplasm through the basal body and needle channel. Despite extensive research on T3SS, this hypothesis lacks experimental evidence and the mechanism of secretion is not fully understood. This work aimed to provide an experimental basis for the model of the T3SS mechanism. In order to elucidate details of the effector secretion mechanism, fusion proteins consisting of an effector and a bulky protein containing a knotted motif were generated. It is assumed that the knot cannot be unfolded during secretion of the chimera. Consequently, these fusions are accepted as T3SS substrates but remain inside the NC channel and obstruct the T3SS. This is, to our best knowledge, the first time effector fusions have been visualized together with isolated NCs and it demonstrates that effector proteins are secreted directly through the channel with their N-terminus first. The channel encloses the substrate and shields it from a protease and chemical modifications. These results corroborate an elementary understanding of how the T3SS works and provide a powerful tool for in situ-structural investigations. This approach might also be applicable to other protein secretion systems that require unfolding of their substrates prior to secretion.

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