Les infections néonatales tardives (INT, survenant après 3 jours de vie) sont fréquentes et sont associées à une mortalité et une morbidité importantes chez les nouveau-nés prématurés. Dans ce contexte, il a été récemment décrit un clone de Staphylococcus capitis, appelé NRCS-A, impliqué spécifiquement dans ces INT dans différents services de réanimation néonatale (RN) à travers la France, et présentant un profil multirésistant atypique chez cette espèce, incluant notamment une sensibilité diminuée à la vancomycine, qui est pourtant l'antibiotique de première ligne en cas de suspicion d'INT. Dans le cadre de ce travail, nous avons démontré la distribution endémique du clone NRCS-A dans au moins 17 pays à travers le monde, spécifiquement dans les services de RN. De plus des données épidémiologiques issues des services de RN français ont identifié une prévalence élevée du clone dans certains services, illustrant sa capacité à s'implanter puis à persister dans ces services. Une caractérisation génétique du clone NRCS-A a été réalisée afin de mettre en évidence d'éventuels facteurs génétiques pouvant favoriser son implantation dans les services de RN. Cette analyse a démontré le rôle des éléments génétiques mobiles dans l'émergence du phénotype multirésistant du clone NRCS-A. En revanche aucun gène de virulence spécifique du clone n'a pu être mis en évidence. L'analyse des gènes spécifiques du clone a toutefois permis d'identifier le gène nsr codant pour la résistance à la nisine, bactériocine active sur de nombreuses bactéries à Gram positif et sécrétée par les bactéries de la flore commensale digestive. Ce gène pourrait donc conférer un avantage sélectif au clone NRCS-A pour s'implanter dans le microbiote des nouveau-nés prématurés. La persistance du clone dans les services de RN évoque la présence de réservoirs inertes ou humains au sein de ces services. Grâce à la mise au point d'une technique d'identification de S. capitis par gélose chromogénique sélective, nous avons pu démontrer la diffusion et la persistance de S. capitis dans un service de RN, sans toutefois identifier un réservoir unique responsable de cette colonisation. Nous avons également observé une inefficacité partielle des mesures de décontamination. Il n'existe en revanche pas de portage chronique chez le personnel soignant, ni de colonisation vaginale chez les femmes enceintes. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence par repiquages successifs in vitro une capacité particulière du clone NRCS-A à acquérir de façon rapide et stable une résistance à la vancomycine sous pression de sélection par cet antibiotique. Cette capacité constitue un avantage sélectif majeur pour ce clone et pourrait avoir favorisé son implantation et sa persistance dans les services de RN où la pression de sélection par la vancomycine est élevée. Pour compléter ces résultats, une étude de cohorte prospective menée en RN a permis de démontrer que l'administration de vancomycine constituait un facteur de risque indépendant de survenue d'INT à S. capitis. Au-delà de la problématique spécifique des INT à S. capitis en RN, nos travaux illustrent plus largement un des enjeux majeurs de santé publique qui est l'impact écologique potentiel de l'utilisation des antibiothérapies probabilistes à large spectre sur l'émergence et la sélection de bactéries multirésistantes impliquées secondairement dans des infections nosocomiales. Ces travaux ouvrent de nouveaux axes de recherche concernant d'une part la meilleure compréhension de la physiopathologie des INT à S. capitis, et d'autre part plus largement les modalités de prévention des INT en RN et d'amélioration du diagnostic précoce des INT / Pas de résumé en anglais

Les syndromes septiques restent à ce jour un problème majeur de santé publique. Une importante immunodépression est observée lors des syndromes septiques, affectant notamment les lymphocytes T, acteurs majeurs de la réponse immunitaire. En effet, après avoir subi une apoptose massive ils présentent d'importantes altérations fonctionnelles et phénotypiques, associées à un mauvais pronostic. Cependant les mécanismes impliqués dans le développement de ces altérations lymphocytaires induites par le sepsis (ALIS) sont encore mal connus. Le but de ce travail était d'étudier ces mécanismes à travers la mise au point de modèles ex-vivo. Nous avons optimisé un test de mesure de la réponse proliférative des lymphocytes T, utilisable pour le diagnostic des immunodéficiences primaires, comme pour l'étude expérimentale et clinique des ALIS. Nous avons développé un premier modèle ex vivo, reposant sur l'incubation de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) en présence de LPS, suivie d'une stimulation spécifique des lymphocytes T via leur TCR. Ce modèle récapitule des mécanismes indirects potentiellement impliqués dans l'induction des ALIS, impliquant les monocytes. Puis, nous avons mis au point un modèle qui repose sur l'incubation de PBMC en présence d.IL-10, suivie d'une stimulation des lymphocytes T par des anticorps anti-CD2/CD3/CD28. Ce modèle pourrait reproduire des mécanismes directs et indirects impliqués dans l'induction des ALIS. Nos résultats nous ont permis d'améliorer la compréhension des mécanismes en jeux dans les ALIS et d'en souligner la complexité. Les modèles ex-vivo présentés pourraient permettre d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques / Sepsis remains a major public healthcare issue. During sepsis, an important immunodepression develops, affecting particularly the T lymphocytes, major players of the immune response. Following a massive apoptosis, T lymphocytes display important functional and phenotypical alterations, which are associated with higher risk of secondary infections and higher mortality. Mechanisms involved in the induction of such alterations are not fully understood. The aim of this study was to analyze those mechanisms through the development of ex vivo models. We optimized a test to measure T lymphocytes proliferative response, which can be used for the diagnosis of primary immunodeficiencies, as well as to clinically and experimentally study sepsis induced T lymphocytes alterations (SILA). First, we set up a model consisting in an incubation of PBMC (peripheral blood mononuclear cells) with LPS followed by specific T lymphocytes stimulation via its TCR. This model recapitulates indirect mechanisms likely to participate in SILA induction, mediated by monocytes. Then, we set up a model consisting in PBMC incubation with IL-10 followed by T lymphocytes stimulation with anti-CD2/3/28 antibody coated beads. This model may recapitulate direct and indirect mechanisms involved in SILA induction. Our results allowed us to improve the understanding of the mechanisms involved in SILA induction and to highlight its complexity. The ex-vivo models that we developed could be used for the evaluation of new therapeutic strategies

Le paludisme et le sepsis sont des maladies infectieuses très répandues causant plusieurs centaines de milliers de morts tous les ans. Elles sont toutes deux multifactorielles. Les devenirs de ces infections sont influencés par des facteurs environnementaux, par des facteurs sociaux-économiques, politiques et comportementaux mais aussi par des variables dépendant du patient comme son âge. De nombreux arguments existent en faveur d'un contrôle génétique de la résistance au paludisme et au sepsis. Ces deux maladies sont considérées comme proches par les spécialistes car leur physiopathologie est liée notamment à une inflammation systémique non contrôlée responsable des formes les plus graves. Afin d'identifier de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la résistance à ces deux maladies, nous avons effectué des études génétiques pangénomiques dans deux populations vivant en zone endémique pour le paludisme à Plasmodium falciparum au Burkina-Faso et dans une cohorte de patients atteints de sepsis.Enfin nous avons réalisé les deux premières études d'association pangénomiques identifiant des associations significatives avec la mortalité suite à un choc septique. Nous avons obtenu 32 SNPs significativement associés à la mortalité précoce et 108 significativement associés à la mortalité tardive. Le réseau des interactions protéine-protéine impliquant les protéines codées par les gènes associés a permis d'établir une liste non exhaustive des fonctions altérées durant le choc septique, notamment liées à la réponse immune, et a révélé, malgré les différences au niveau des gènes impliqués, un mécanisme commun participant à la susceptibilité précoce et tardive au choc septique. / Malaria and sepsis are widespread infectious diseases causing hundreds of thousands deaths each year. There is a growing body of evidence for a genetic control of malaria and sepsis resistance. Both diseases are considered close because they are characterized by a systemic inflammation, some common organ dysfunctions, and disorders of coagulation. In order to identify new genes potentially involved in disease resistance, we performed genomewide genetic studies in two populations living in endemic regions for Plasmodium falciparum malaria in Burkina-Faso and in a cohort of septic shock patients. Genetic linkage studies revealed significant genetic linkages on chromosome 6p21.3 and 17p12 with, respectively, mild malaria and asymptomatic parasitaemia. We also performed the first genetic linkage studies concerning immunoglobulin G and their sub-classes against Plasmodium falciparum antigens. We detected significant linkages of IgG3 sub-class with chromosomes 8p22-p21 and 20q13 and between IgG4 sub-class and chromosome 9q34. Finally we performed the first two genomewide association studies identifying significant associations with all-causes mortality after a septic shock. We identified 32 SNPs significantly associated with early mortality and 108 SNPs significantly associated with late mortality. We identified a protein-protein network containing proteins associated with both early and late mortality. Furthermore, the network of protein-protein interactions involving proteins encoded by associated genes allowed us to establish a list of some altered functions during septic shock, most of them being related to the immune responses or the renin-angiotensin-aldosterone system.

L’hyperglycémie et l’insulino-résistance constituent les altérations métaboliques des patients septiques associées à un pronostic défavorable, à une augmentation des dysfonctions cardiovasculaires et à une augmentation de la mortalité. Si plusieurs études démontrent quel’insulinothérapie à forte dose diminue la mortalité et prévient la dysfonction multi-organes, elle est souvent controversée car responsable d’hypoglycémies délétères. La Protéine Tyrosine Phosphatase1B (PTP1B) est un régulateur négatif de la voie de signalisation dépendante de l’insuline et de la voie de production du NO.L’idée développée dans le laboratoire est que l’inhibition de la PTP1B pourrait constituer une cible thérapeutique potentielle dans le sepsis en améliorant la sensibilité à l’insuline et ainsi les conséquences sur la fonction endothéliale et cardiaque. Bien qu’il ait été montré que la délétion génétique en PTP1B diminue la dysfonction cardiovasculaire lors du sepsis, les effets de cette délétion sur le métabolisme glucidique dans l’amélioration de la dysfonction cardiovasculaire restent méconnus et constituent l’objectif de notre travail.Dans un modèle de sepsis induit par Ligature et Perforation Caecale, nous avons pu mettre en évidence que la délétion génétique totale de PTP1B limite l’insulino-résistance induite par le sepsis,améliore la voie de signalisation dépendante de l’AMPK et la translocation des GLUT-4 et diminue l’inflammation. Ces effets s’accompagnent d’une diminution de la dysfonction endothéliale induite parle sepsis et améliore la production de NO. La délétion génétique endothéliale de PTP1B permet quant à elle une amélioration significative de la fonction endothéliale et de la sensibilité à l’insuline et au glucose.Ces travaux ont donc permis de mettre en évidence l’effet bénéfique de la délétion génétique en PTP1B dans le sepsis par amélioration de la sensibilité à l’insuline et des conséquences sur la fonction endothéliale et cardiaque. / Hyperglycemia and insulin resistance are septic metabolic alterations associated with poorprognosis, increased cardiovascular dysfunction and mortality. Several studies have demonstrated thathigh-dose insulin therapy reduces mortality and prevents multi-organ dysfunction but is controversialbecause it is often associated with deleterious hypoglycemia. Protein Tyrosine Phosphatase 1B (PTP1B)is a negative regulator of both insulin signaling and NO production.The concept developed in our laboratory is that PTP1B inhibition could be a potentialtherapeutic target in sepsis by improving both insulin sensitivity and these consequences onendothelial and cardiac function. PTP1B genetic deletion has been shown to decrease cardiovasculardysfunction in sepsis but the effects of this deletion on carbohydrate metabolism in the improvementof cardiovascular dysfunction remain unknown and constitute the objective of our work.In a sepsis model induced by Ligature and Caecal Perforation, we have demonstrated that thetotal PTP1B genetic deletion limits insulin resistance induced by sepsis, improves the AMPK signalingpathway, the GLUT-4 translocation and reduces inflammation. These effects are followed by decreasedendothelial dysfunction induced by sepsis and improves NO production. The endothelial PTP1B geneticdeletion, significantly improves endothelial function, insulin and glucose sensitivity.This work demonstrate the beneficial effect of the PTP1B genetic deletion in the sepsis byimprovement of the insulin sensibility and these consequences on endothelial and cardiac function.

Die Sepsis ist ein gefürchtetes Krankheitsbild, das in hochentwickelten Industrienationen mit einer hohen Mortalität verknüpft ist und damit zu den häufigsten Todesursachen gehört. Die Pathomechanismen dieses komplexen und heterogenen Krankheitsbildes zu entdecken, gehört momentan zu den Hauptinteressengebieten der Sepsisforschung. Da die Interpretation klinischer Studien aufgrund der Heterogenität des Patientenguts schwierig ist, kommt der Entwicklung adäquater Tiermodelle eine entscheidende Bedeutung zu. Die hierbei gängigen Tiermodelle in Mäusen weisen jedoch Unzulänglichkeiten auf, die die Übertragung der in Tierexperimenten gewonnen Daten auf den klinischen Kontext nur teilweise ermöglichen. Eine Brücke kann hierbei das Tiermodell der humanisierten Maus schlagen, in der, durch Transplantation mit humanen hämatopoetischen Stammzellen, ein humanes Immunsystem reift. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Fragestellung, inwieweit die humanen Immunzellen in der humanisierten Maus in der Lage sind, auf LPS als Stimmulus zu reagieren. Darüberhinaus wird die Nutzung der Endotoxämie in der humanisierten Maus als alternatives Sepsismodell im Bezug zum klinischen Kontext untersucht. Hierbei ergab sich eine mögliche Nutzung des Endotoxämiemodells in der humanisierten Maus zur genaueren Erforschung des Zytokinmilieus, sowie neuer Surrogatmarker wie Pentraxin 3. Bezüglich der Reaktion einzelner immunologischer Subpopulationen und deren Bedeutung für die Klinik scheint eine Untersuchung an Modellen, die eine B- und T-Zell-Reifung nachvollziehen können und in der murine Residualzellen möglichst gering vorhanden sind, als sinnvoll.

Sepsis is the most common cause of death in the intensive care units worldwide. Despite the undeniable progress in pre- and clinical research, the effective causal therapeutic strategy still does not exist. Given to extremely complex and heterogenic host response to presence of infection, the paradigm "one disease, one drug" is obviously flawed and combination of multiple targets that involves early immunomodulation and cellular protection are needed. Cellular therapy using mesenchymal stem cells represents strategy that brought positive results in experiments with rodent septic models. Part of this thesis is dedicated to evaluation of safety and efficacy of stem cells intravenous administration to well-established large animal model of progressive peritoneal sepsis. Affecting of the neuroinflammatory reflex through the vagus nerve stimulation showed potential to attenuate sepsis in rodents. Rest of the text is dedicated to evaluation of vagus nerve stimulation effectivity in our model. KEYWORDS Sepsis, sepsis-associated acute kidney injury, mesenchymal stem cells, vagus nerve stimulation

Användningsområdena för artificiell intelligens ökar ständigt vilket är inte förvånande då AIs förmåga att lösa komplicerade problem många gånger överstiger den mänskliga motsvarigheten. Implementeringen av AI-system har ibland gått så långt att utvecklarna själva inte längre vet hur systemet har tagit fram en slutsats; vilket har gjort att möjligheten att undersöka, förstå och felsöka utfall är näst intill icke-existerande. Eftersom dagens AI-system inte erbjuder förklaringar till utfallen har det resulterat i en ovilja hos slutanvändaren. Forskningsområdet eXplainable AI (XAI) menar att genom att använda genererade förklaringar kan AI-systemen bli mer förståeliga för slutanvändaren. Ett område som är i stort behov av AI-system är sjukvården, speciellt inom sepsis där en snabb diagnostisering drastiskt minskar sjukdomens mortalitet. Syftet med denna studie var att ta fram designriktlinjer vid utveckling av förklaringar som är ämnade att främja tillit till och förståelse för AI-baserade kliniska beslutsstöd menade för diagnostisering av sepsis. Studien påbörjades med en förstudie som bestod av en enkät och en litteraturstudie, sedan utvecklades en mid-fi prototyp som följdes av användarupplevelsetester. Insamlad dataanalyserades med hjälp av top-down och en induktiv analysmetod varefter ett slutligt resultat togs fram. Resultatet säkerställde att det finns flera faktorer som behöver inkorporeras vid framtagandet avförklaringar till ett AI-systems rekommendationer för främjande av tillit och förståelse. För en ökad tillit behöver en förklaring kompletteras med data som tillåter slutanvändaren att validera förklaringen och bemöta användarens informationsbehov. För en ökad förståelse bör en förklaring innehålla information som tillåter användaren förstå anledningen till förklaringens huvudinnehåll, exempelvis ”X beror på Z och Y”. Tilliten och förståelsen i denna studie mättes endast vid ett tillfälle vilket gör att frågan om hur riktlinjerna skulle påverka tillit till och förståelse för AI-system över tid kvarstår. / The fields of application for artificial intelligence is constantly increasing, which is not suprising as the AI's ability to solve complex problems often exceeds the human counterpart. The development of AI systems has come so far that somtimes not even the developers themselves can explain how the system came to its conclusion; which has made the possibility of examining, understanding and troubleshooting outcomes almost non-existent. Since today's AI systems do not offer explanations for the outcomes, it has resulted in resistance on the part of the end user. The research are eXplainable AI (XAI) believes that using generated explanations, AI systems can become more understandable to the end user. One area that is in great need of AI systems is healthcare, especially for diagnosing sepsis where a rapid diagnosis drastically reduces the mortality of the disease. The purpose of this study was to develop design guidelines for the development of explanations that are intended to promote trust and understanding of AI-based clinical decision support intended for the diagnosis of sepsis.The study began with a feasibility study consisting of a questionnaire and a literature study, then amid-fi prototype was developed that was followed by user experience tests. Collected data were analyzed using top-down and an inductive analysis after which a final result was obtained.The results ensured that there are several factors that need to be incorporated in the development of explanations for the promotion of trust and understanding. For increased trust, an explanation needs to be supplemented with data that allows the end user to validate the explanation and meet the user's information needs. For an increased understanding, an explanation should contain information that allows the user to understand the reason for the main content of the explanation, for example "Xdepends on Z and Y".The trust and understanding in this study was only measured at one occasion, as such the question of how the guidelines would affect trust and understanding of AI systems over time remains.

Le sepsis est un problème mondial de santé publique du fait de son incidence croissante et de sa mortalité importante. Après une première phase très inflammatoire, les patients septiques présentent une profonde immunodépression, objectivée par un risque accru d’infections secondaires et de décès. Dans ce contexte, des thérapeutiques immunostimulantes sont actuellement testées. Afin d’identifier des cibles thérapeutiques pertinentes et des biomarqueurs permettant l’individualisation des traitements, la description exhaustive des mécanismes immunosuppresseurs mis en jeu est primordiale. Les lymphocytes B ont été peu étudiés au cours du sepsis. Des données récentes ont révélé l’existence de cellules B régulatrices dans différents contextes cliniques. Ainsi, nous avons fait l’hypothèse que des lymphocytes B / plasmocytes régulateurs pouvaient être impliqués dans l’établissement de l’immunodépression induite par le sepsis.Chez les patients en choc septique, nous avons montré que les lymphocytes B présentent une perte de leur fonction de prolifération et un phénotype d’épuisement cellulaire. Ils produisent de l’IL-10, cytokine suppressive (Journal of Immunology 2018). Enfin, une plasmocytose circulante apparait, confirmée par cytométrie de masse (Scientific Reports 2018). Dans un modèle murin de sepsis, ces plasmocytes inhibent la prolifération des lymphocytes T ex vivo et expriment des marqueurs phénotypiques suggérant pour la première fois la présence de plasmocytes régulateurs dans le sepsis.L’importance clinique des plasmocytes régulateurs reste à définir (mécanismes régulateurs, liens avec les paramètres cliniques, association avec les réactivations virales…). Elle pourrait conduire à l’établissement de nouveaux biomarqueurs pour le suivi immunitaire des patients et à de nouvelles approches thérapeutiques / Sepsis in a major health problem associated with rising incidence and high mortality rate. In septic patients, an initial proinflammatory response causing life-threatening organ failures is followed by the development of a deep immunosuppression, associated with increased risk of secondary infections and death. In this context, immunostimulating therapies are currently tested. However, success of this strategy requires identification of relevant therapeutical targets and biomarkers allowing individualisation of treatments. B lymphocytes have been poorly studied in sepsis. Moreover, existence of regulatory B cells was recently revealed in several clinical contexts. Thus, we made the assumption that regulatory B lymphocytes or plasma cells could be implied in sepsis-induced immunosuppression establishment.In septic shock patients, we showed that B cells present with decreased proliferation capacity and exhausted-like profile, and are able to produce immunosuppressive IL-10 (Journal of Immunology 2018). We also observed blood plasmacytosis in patients, confirmed by mass cytometry analysis (Scientific Reports 2018). In a murine model of sepsis, the ability of plasma cells to inhibit T cell proliferation ex vivo, and their phenotypic profile suggest for the first time the existence of regulatory plasma cells in sepsis.The role of regulatory plasma cells within sepsis-induced immunosuppression has to be further explored in patients (underlying regulatory mechanisms, associations with clinical outcomes and viral reactivations…). It could highlight novel biomarkers for patients’ monitoring and innovative therapeutical approaches

Le choc septique est une défaillance circulatoire aiguë déclenchée par un agent infectieux, entraînant des désordres hémodynamiques, métaboliques et viscéraux, en raison notamment de la libération de cytokines proinflammatoires. Le taux de mortalité est élevé (environ 40 %). L’évolution des sepsis sévères est souvent compliquée par des phénomènes thrombotiques qui résultent en partie de l’activation de la coagulation par les agents infectieux, mais aussi de la libération de Neutrophil Extracellular Traps (NETs) par les polynucléaires neutrophiles. Ainsi, chez ces patients, une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) est souvent observée, caractérisée par un état d’équilibre instable, où co-existent un risque thrombotique et un risque hémorragique, dû à la consommation des facteurs de coagulation.Plusieurs études ont suggéré que l’administration d’antithrombine (AT) ou de Protéine C activée diminuait la mortalité, non seulement en diminuant l’activation de la coagulation, mais aussi en ayant des effets cytoprotecteurs et anti-inflammatoires indépendants de leur activité anti-coagulante. Toutefois, leurs effets cytoprotecteurs nécessitent l’administration de doses élevées, responsables d’hémorragies.L’inhibiteur dépendant de la protéine Z (ZPI), appartient à la superfamille des serpines, comme l’AT, mais n’inhibe que les facteurs Xa (FXa) et XIa (FXIa). L’inhibition du FXa est potentialisée par la Protéine Z (PZ), un facteur vitamine K-dépendant, qui circule dans le plasma lié au ZPI. Dans un modèle en sang total, j’ai observé que le ZPI exerce un effet inhibiteur sur la production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et TNF-α) en réponse au lipopolysaccharide (LPS). A forte concentration (4 fois la concentration physiologique), l’effet anti-inflammatoire (EAI) du ZPI n’est pas modifié par l’ajout de PZ ou d’héparine non fractionnée, qui majorent l’effet anticoagulant du ZPI. De plus, l’EAI persiste avec un variant de ZPI muté sur son site actif (ZPI Y387A), suggérant que le ZPI possède un EAI indépendant de son activité anticoagulante. In vitro, en sang total, le ZPI augmente précocement la production de CCL-5, une chimiokine ayant des propriétés anti-inflammatoires. Ces observations ont été confirmées dans un modèle d’endotoxinémie in vivo, chez la souris, en injectant par voie intra-péritonéale du LPS. Les souris qui avaient reçu simultanément du ZPI recombinant humain ont un taux plasmatique plus faible d’IL-6 et de TNF α que les souris contrôles et un taux plus élevé de CCL-5 dans le lavage péritonéal.De plus, nous avons mis en évidence, en milieu purifié, que l’élastase neutrophile, une enzyme libérée à la surface des NETs induisait plusieurs clivages du ZPI. Le premier clivage se produit au niveau de la boucle réactive du ZPI, qui perd alors son activité inhibitrice sur les FXa et FXIa. La PZ ne protège pas le ZPI de sa dégradation par l’élastase. La dégradation du ZPI induite par les NETs pourrait participer à leurs propriétés procoagulantes.Enfin, en collaboration avec l’équipe du Service de Réanimation du CHU de Strasbourg, nous avons étudié les variations des taux plasmatiques de PZ et ZPI chez 100 patients atteints de sepsis sévère. Dans les premières 24 heures, nous avons observé une diminution du taux de PZ par rapport à une groupe de sujets sains, et à l’inverse, une augmentation d’environ 2,5 fois du taux de ZPI. Ce taux élevé de ZPI persiste à J3 et J7, alors que le taux de PZ augmente. Les variations de PZ ou ZPI ne sont pas prédictifs de la mortalité à 30 jours ni de l’apparition d’une CIVD.Ces résultats suggèrent que des doses élevées de ZPI (4 fois la concentration physiologique) pourraient constituer un traitement adjuvant du choc septique, en diminuant la production de cytokines pro-inflammatoires, avec un risque hémorragique faible, puisque l’inhibition du FXIa a des activités antithrombotiques dépourvues de risque hémorragique. / Septic shock is an acute circulatory failure caused by an infectious agent, resulting in hemodynamic, metabolic and visceral disorders, in particular due to pro-inflammatory cytokines. The mortality rate is high (about 40 %). Progression of severe sepsis is often complicated by thrombotic events, in part because of a direct coagulation activation by bacteria, but also because of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) released by polymorphonuclear neutrophils. Disseminated intravascular coagulation (DIC) is frequently present in these patients, characterized by an unstable equilibrium, where thrombotic and bleeding risks coexist, due to the consumption of coagulation factors.Several studies suggested that administration of coagulation inhibitors, such as antithrombin (AT) or activated Protein C, decreased mortality, not only by preventing the activation of coagulation, but also through their cytoprotective and anti-inflammatory effects, independent of their anticoagulant activity. However, the cytoprotective effects require the administration at very high doses, leading to a bleeding tendency.The protein Z-dependent protease inhibitor (ZPI) belongs to the serpin superfamily, as AT, but in contrast to AT, inhibits only factors Xa (FXa) and XIa (FXIa) of coagulation. FXa inhibition by ZPI is potentiated by Protein Z (PZ), a vitamin K-dependent factor, which circulates in plasma in a complex with ZPI. In a whole blood model, I observed that ZPI exerts an inhibitory effect on lipopolysaccharide (LPS)-induced pro-inflammatory cytokines production (IL-6 and TNF-α). At high concentration (4 times physiological concentration), ZPI anti-inflammatory effect (AIE) is not modified by PZ or unfractionned heparin, which increase ZPI anticoagulant activity. Moreover, this AIE is still present using a reactive center loop variant of ZPI (ZPI Y387A), suggesting that the AIE of ZPI is independent of its anticoagulant activity. In vitro, in whole blood, ZPI induced an early increased of CCL-5, a chemokine with anti-inflammatory properties. These data are confirmed in vivo in a murine model of endotoxin shock where LPS is injected intraperitoneally. Simultaneously injection of recombinant human ZPI (rhZPI) with LPS led to lower plasma levels of IL-6 and TNF-α than in control mice, whereas higher CCL-5 levels were observed in peritoneal lavages.In addition, using purified proteins, we have shown that neutrophil elastase, an enzyme which decorates NETs, induces several cleavages of rhZPI. A quick and first cleavage is observed on the reactive centre loop of ZPI, inducing a loss of inhibitory activity towards FXa and FXIa. PZ does not protect ZPI from elastase degradation. ZPI proteolysis induced by NETs could contribute to their procoagulant activity.Lastly, in collaboration with the intensive care unit of Strasbourg Hospital, we studied plasma levels of PZ and ZPI in 100 patients with severe sepsis. During the first 24 hours, there was a significant decrease of plasma PZ levels, compared to levels of healthy subjects, whereas an approximately 2.5 times increase was observed for ZPI levels. These high levels of ZPI were still present at D3 and D7, whereas PZ levels regularly increased. Variations of PZ and ZPI levels were not predictive of the 30-day mortality rate, and not associated with DIC development.These results suggest that elevated concentrations of ZPI (4 times physiological concentration) could be an adjuvant therapy to septic shock, by decreasing pro-inflammatory cytokines production, but devoid of bleeding risk, since FXIa inhibition has antithrombotic activity without inducing haemorrhages.

Introduktion: Sepsis är utan behandling ett livshotande tillstånd, en korrekt behandling behöver en snabb och tillförlitlig artidentifiering. Olika prepareringsmetoder av positiva blododlingar inför direkt identifiering med MALDI-TOF finns. MBT Sepsityper® IVD Kit är en CE-märkt metod. För att följa IVDR-direktivet behöver Sepsityper jämföras med den nuvarande in-house-metoden. Dessa två metoder jämfördes utifrån förmåga att ge ett tillförlitligt, snabbt resultat där även den praktiska metoden samt ekonomiska aspekten undersöktes Material och metod: Alla positiva blododlingar som undersöktes preparerades med in- house-metoden och Sepsityper innan analys med MALDI-TOF MS. Med in-house-metoden användes saponin för att lysera de humana cellerna medans Sepsityper använde lyseringsbuffert. Resultatets tillförlitlighet presenteras som scorevärde där >2 är tillförlitligt till speciesnivå, 1,7–1,99 till genusnivå och <1,7 är ej tillförlitligt. Resultat: 135 positiva blododlingar undersöktes där in-house-metoden gav 115 med ett scorevärde över 1,7 medans Sepsityper® gav 100 prover med ett scorevärde över 1,7. Bland dessa prover var det 62 gramnegativa bakterier och 53 grampositiva. Slutsats: En skillnad mellan antalet identifieringar med scorevärde över 1,7 sågs men var ej signifikant enligt CHI2 test där antalet var högre för house metoden. Den data som samlats ger ej inte tillräckligt med stöd för att inte avvika från IVDR och fortsätta med in-house- metoden. / Background: Sepsis without treatment is a life-threatening condition, a rapid as well as reliable identification of the bacteria is needed. Different preparation methods of positive blood cultures for rapid identification are available. MBT Sepsityper® IVD Kit is one of them and is a CE-marked method. To comply with the IVDR directive, Sepsityper® needs to be tested and compared with the current in-house method. These two methods were compared based on the ability to provide fast and reliable results. Material and method: All the positive blood samples that were examined were prepared by the two methods then analysed with MALDI-TOF MS. The in-house-method used saponin to lyse the blood cells, Sepsityper used a lysisbuffert. How reliable the results are presented as score value, >2 means that the result is reliable to species identification, between 1.7-1.99 to genus identification and <1.7 is not reliable. Results: 135 positive blood cultures were examined and the in-house-method gave 115 with a score value above 1.7 while Sepsityper® gave 100 bottles a score value over 1.7. Among the bottles there were 62 gram-negative bacteria and 53 gram-positive bacteria. Conclusion: A difference between the number of identifications with a score value above 1.7 were seen where the number was higher for the in-house method, but the difference was not significant according to the Chi2 test. The data collected do not provide sufficient support for not following IVDR and not switch to Sepsityper®.