A compreensão da fisiologia e dos mecanismos moleculares da sepse tem sido foco de muitos estudos. As infecções severas, como a sepse, são responsáveis por 10% do total de mortes registradas em Unidades de Tratamento Intensivo em todo o mundo. O desfecho da sepse ocorre devido a influência de fatores ambientais e genéticos, cuja expressão de variantes genéticas suportam ou não este desfecho. Muitos mecanismos estão envolvidos na sepse, incluindo a liberação de citocinas e a ativação de neutrófilos, de monócitos e de células endoteliais. Há associação entre superprodução de óxido nítrico, produção excessiva de radicais livres, depleção de antioxidantes, e déficit energético celular. Enzimas antioxidantes endógenas como a Superóxido Dismutase, a Glutationa Peroxidase e a Catalase protegem a célula do dano oxidativo. A enzima superóxido dismutase dependente de manganês é um potente antioxidante intracelular codificada por um gene (SOD2; 6q25-2) que tem sua expressão induzida por mediadores inflamatórios tais como interleucina 1, interleucina 4, interleucina 6, Fator de Necrose Tumoral – α, lipopolisacarídeos. O gene SOD2 apresenta um polimorfismo de mutação de base C47T no exon 2, o qual resulta na substituição do resíduo 16 (Ala16Val) pertencente ao peptídeo sinal da proteína. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito diferencial das variantes - 9Ala e -9Val da superóxido dismutase dependente de manganês sobre as células mononucleares de sangue periférico humano (in vitro) durante um processo infeccioso (induzido por lipopolisacarídeos), investigando sua implicação: (I) na produção de Espécies Reativas; (II) na atividade e imuno-conteúdo da Superóxido Dismutase dependente de Manganês; (III) na atividade e imuno- conteúdo da Catalase; (IV) na atividade e imunoconteúdo da Glutationa Peroxidase; (V) na produção de nitrotirosina; (VI) na produção de nitrito/nitrato; (VII) na liberação de Fator de Necrose Tumoral - α; (VIII) na produção de Carboximetil-lisina; (IX) dienos conjugados; (X) no imuno-conteúdo da Poli (ADP ribose) Polimerase; (XI) no imuno-conteúdo do Receptor de Produtos Avançados de Glicação; (XII) no imuno-conteúdo da Proteína de Choque Térmico; (XIII) no imuno-conteúdo do Fator Nuclear κB; (XIV) no dano ao DNA celular; (XV) na determinação das defesas antioxidantes totais não enzimáticas. Os resultados demonstraram que o polimorfismo Ala-9Val participa na regulação do ambiente redox celular, e que o alelo 47C permite que as células no estado basal (sem lipopolisacarídeos) respondam com mais eficiência ao estresse oxidativo celular. Este alelo apesar de produzir mais espécies reativas também aumenta o mecanismo de defesa antioxidante. Porém, quando em uma doença que produza estresse oxidativo, no caso a sepse, o alelo 47C torna o ambiente intracelular pró-oxidativo podendo agravar a condição celular. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o polimorfismo Ala-9Val é um alvo promissor para novos estudos com o objetivo de usar marcadores genéticos para direcionar a terapia necessária para cada paciente. / The understanding of the physiology and of molecular mechanisms of sepsis has been focus of many studies. The severe infections, as the sepsis, are responsible for 10% of total of deaths registered in Intensive Care Units all over the world. The outcome of sepsis happens due to influence of environmental and genetic factors, whose the expression of genetic variants supports or not this outcome. Many mechanisms are involved in sepsis, including the cytokines liberation and the neutrophils activation, of monocytes and of endothelial cells. There is association among overproduction of nitric oxide, excessive production of free radicals, depletion of antioxidants, and cellular energy deficit. Endogenous antioxidant enzymes as Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase and Catalase protect the cell of oxidative damage. The manganese superoxide dismutase enzyme it is a potent antioxidant intracellular codified by a gene (SOD2; 6q25-2) that has her expression induced by the inflammatory mediators such as interleukin 1, interleukin 4, interleukin 6, tumor necrosis factor – α, lipopolysaccharide. The SOD2 gene presents a single-nucleotide polymorphism C47T in the exon 2, which results in the substitution of the residue 16 (Ala16 Val) belonging to the signal peptide of the protein. The aim of this work was to study the differential effect of the variants -9Ala and -9Val of manganese superoxide dismutase on the Peripheral Blood Mononuclears Cells human (in vitro) during an infectious process (induced by lipopolysaccharide), investigating her implication: (I) in the production of Reactive Species; (II) in the activity and immunocontent of Manganese Superoxide Dismutase; (III) in the activity and immunocontent of Catalase; (IV) in the activity and immunocontent of Glutathione Peroxidase; (V) in the nitrotyrosine production; (VI) in the nitrite/nitrate production; (VII) in the production of tumor necrosis factor - α; (VIII) in the production of carboxymethyl lysine; (IX) conjugated dienos; (X) in the immunocontent of the Poly (ADP-ribose) Polymerase; (XI) in the immunocontent of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts; (XII) in the immunocontent of Heat Shock Protein; (XIII) in the immunocontent of the Nuclear Factor kappa B; (XIV) in the damage to cellular DNA; (XV) in the determination of the non-enzymatic antioxidant cellular defenses. The results demonstrated that the polymorphism Ala-9Val it participates in the regulation of the cellular redox environment, and that the 47C allele allows that the cells in the basal state (without lipopolysaccharide) they answer with more efficiency to the stress oxidative cellular. This allele in spite of producing more RS also increases the mechanism of antioxidant defense. However when in a disease that produces oxidative stress, in the case the sepsis, the 47C allele turns intracellular environmental pro-oxidative could worsen the cellular condition. In summary, the data presented here suggest that the polymorphism Ala- 9Val is a promising target for new studies with the goal of using genetic markers to guide therapy required for each patient.

OBJETIVOS: determinar a relação entre parâmetros de estresse oxidativo, gravidade de sepse e resposta ao tratamento com antioxidantes. MATERIAL E MÉTODOS: foram incluídos pacientes consecutivos admitidos na UTI de um hospital terciário com o diagnóstico de sepse, sepse grave ou choque séptico. Os pacientes foram avaliados diariamente e foi coletado sangue imediatamente após a inclusão no estudo (máximo de 12h após diagnóstico de sepse). Avaliou-se os níveis séricos de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), carbonilação de proteínas, atividade de superóxido dismutase (SOD) e catalase. Estas variáveis foram correlacionadas com desfecho e variáveis clínicas. Para determinar a relação dos parâmetros oxidativos na resposta ao tratamento, utilizamos o modelo de ligação cecal e perfuração (CLP) empregando ou não tratamento antioxidante (N-acetilcisteína mais deferoxamina). Coletou-se sangue da veia caudal 3h após a indução de sepse e correlacionou-se os parâmetros com resposta ao tratamento antibiótico e antioxidante. Para determinar se o tratamento antioxidante poderia ser retardado por 12h, em uma segunda amostra de animais coletou-se sangue da veia caudal e administrou-se ou não tratamento após 12h da indução de sepse. RESULTADOS: níveis elevados de proteínas carboniladas e de SOD no diagnóstico de sepse são relacionados com óbito por sepse nesta amostra. Estes parâmetros são correlacionados com a gravidade da doença avaliada pelos escores APACHE II e MODS. Níveis de atividade da SOD podem prever resposta ao tratamento com antioxidantes no modelo CLP, tanto 3 como 12h após a indução de sepse. CONCLUSÃO: Parâmetros oxidativos são associados com gravidade e desfecho de sepse em UTI geral, e podem prever resposta ao tratamento antioxidante em animas. / OBJECTIVE: determine the relationship between oxidative stress parameters, sepsis severity and treatment response to antioxidants. MATERIALS AND METHODS: were included consecutive patients admited on ICU at a tertiary care Hospital with sepsis, severe sepsis or septic shock. The patients were evaluated, blood samples were colected immediately after study inclusion (12h maximum after sepsis diagnosis). We determined plasma levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS), protein carbonyls, superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and correlate it to clinical parameters. To determine the relation between oxidative parameters and response to antioxidant treatment we used the cecal ligation and perforation (CLP) model of sepsis, using or not antioxidants (n-acetyilcysteine plus deferoxamine) 3 or 12 hours after CLP. RESULTS: non-survivor septic patients presented higher protein carbonyls and SOD activity when compared to survivor patients. These parameters were correlated to APACHE II and MODS in our sample. In addition, plasma SOD levels predicted response to antioxidant treatment in the CLP model, both 3 and 12 houras after sepsis induction. CONCLUSION: Oxidative parameters are correlated to severity and outcome in septic patients and could predict response to antioxidant treatment in the CLP model.

Acidose metabólica é um fenômeno comum e clinicamente significativo em pacientes com sepse grave ou choque séptico. Entretanto, sua composição não é bem estabelecida. Neste estudo, descrevemos a composição da acidose metabólica em pacientes com sepse grave ou choque séptico desde sua internação em unidade de terapia intensiva (UTI) até os quinto dia de internação em unidade de terapia intensiva (UTI). Na admissão à UTI, a acidose metabólica foi um fenômeno muito freqüente. Ela era composta principalmente pelo componente derivado dos íons inorgânicos (dado principalmente pela diferença sódio cloro), seguido em magnitude pelo componentes decorrentes de ânions não mensuráveis e lactato e atenuada por hipoalbuminemia. A magnitude da acidose metabólica e hipercloremia foram maiores entre os pacientes não-sobreviventes (considerando a mortalidade hospitalar). Em análise multivariada o grau de acidose por íons inorgânicos, além do escore de gravidade APACHE II e nível inicial de creatinina sérica, esteve associada a mortalidade hospitalar. Ao longo do período de estudo, os pacientes sobreviventes apresentaram melhora da acidose metabólica por diminuição dos níveis de ânions não-mensuráveis e lactato. Os não sobreviventes mantiveram a mesma magnitude de acidose metabólica e apresentaram queda do pH por aumento da PCO2 / Metabolic acidosis is frequently found in patients with severe sepsis and septic shock. Several studies have shown that the amount of metabolic acidosis measured by the standard base excess (SBE) at hospital admission and its evolution throughout the first days of intensive care unit (ICU) stay are correlated with clinical outcome. However, the precise composition of the metabolic acidosis in patients with severe sepsis and septic shock is not well known. In this study, we have described the composition of metabolic acidosis in patients with severe sepsis or septic shock at ICU admission and throughout the first five days of ICU stay, by applying the quantitative physicochemical methodology. Metabolic acidosis was extremely frequent at admission to the ICU. Its main component was attributable to the inorganic ion difference disturbance (mainly determined by the Na Cl difference), followed in magnitude by unmeasured anions and lactate´s components. Hypoalbuminemia represented the most frequent and important alkalinizing component. The degree of metabolic acidosis and hyperchloremia was more pronounced in the non-survivors group (according to hospital mortality). In a multivariate analysis the degree of metabolic acidosis due to disturbances in innorganic ion difference was associated to hospital mortality. Acidosis in survivors was corrected during the study period due to a decrease in lactate and SIG levels, whereas non-survivors did not correct their metabolic acidosis and suffered a decrease in the pH due to an increase in PCO2 levels

Sepse é a primeira causa de morte em Unidades de Terapia Intensiva. A gravidade dessa doença é considerada conseqüência de um desequilíbrio da resposta inflamatória e, apesar dos avanços em diagnóstico e tratamento, os índices de mortalidade se mantêm inalterados. O papel dos receptores Fc de immunoglobulinas nesta situação é pouco esclarecido. Tais receptores deflagram respostas imunes opostas, que dependem do receptor envolvido e podem ser tanto ativatórias, quanto inibitórias. As respostas ativatórias são atribuídas a um motivo chamado ITAM, enquanto as inibitórias são relacionadas ao motivo ITIM. Camundongos apresentam dois receptores de IgG ativatórios (FcγRI e FcγRIII), que portam motivos ITAM, associados a uma sub-unidade conhecida como cadeia gamma, assim como um receptor de IgG que apresenta um motivo ITIM na sua porção intra-citoplasmática (FcγRII). Este trabalho teve como objetivo o estudo do papel destes receptores em bacteremias e sepse. Para isso, utilizamos um modelo de peritonite induzida por ligadura e punção cecal. Este projeto descreve pela primeira vez, um papel importante do FcRγII na indução de apoptose em linfócitos B, durante infecção bacteriana severa. Nossos resultados colocaram em evidência, ainda, o fato de que animais deficientes em cadeia gamma apresentam mortalidade diminuída, quando submetidos a esse modelo de peritonite, e que essa diminuição é associada a menores valores de TNFα no soro e nos fluidos peritoneais, menor recrutamento peritoneal de células inflamatórias, assim como a um surpreendente aumento na fagocitose de E. coli. Hemocultura e cultura do lavado peritoneal desses animais revelaram uma flora multimicrobiana, enquanto camundongos selvagens apresentaram uma forte predominância de E. coli e um número total bastante superior de bactérias. Esse papel inibitório da cadeia gamma pode estar relacionado a mecanismos de auto-tolerância. Lisado total de células peritoneais de camundongos deficientes em cadeia gamma apresentam fosforilação aumentada de diversas proteínas, quando comparados a lisados obtidos, a partir de camundongos selvagens. Estudos semelhantes realizados com camundongos transgênicos para o receptor de IgA (FcαRI), entretanto, não demonstraram um papel crucial desse receptor nesta doença. Este trabalho abre, portanto, novas perspectivas para o tratamento de doenças infecciosas, através de intervenção sobre a cadeia gamma e coloca em rediscussão os conceitos atuais de ITAM e ITIM. / Sepsis is the first cause of death in Critical Care Units and despite the development in its diagnosis and treatment, mortality remains unaffected. The role of immunoglobulin Fc receptors in sepsis is not clearly understood. These receptors initiate opposing responses, depending on their aggregation by the ligand and can induce activating or inhibitory responses. The activating responses are attributed to a motif known as ITAM, and the inhibitory responses to another one called ITIM. Mice express two activating IgG receptors (FcγRI et FcγRIII) which have ITAM motifs in the intracytoplasmic domain of an associated subunit, called the FcRγ chain, as well as an inhibitory IgG receptor which possesses an ITIM motif in its intracytoplasmic domain. The objective of this work is to study the importance of these receptors in bacteremia and in sepsis. To this aim, we have used a peritonitis model, induced by cecal ligation and puncture (CLP). This project describes for the first time, an important role of FcγRII in B lymphocytes apoptosis. Moreover, our results show that FcRγ chain knockout mice have a decreased mortality in this model, which is associated to diminished TNFα serum and peritoneal fluids levels, to a reduced recruitment of peritoneal inflammatory cells and to a surprising increase in E. coli phagocytosis. Blood and peritoneal fluid cultures have shown a polymicrobial flora 24 hours post-CLP for FcRγ-chain deficient mice, whereas wild-type mice present a strong predominance of E. coli in the same cultures and an increased bacteria total count. Lysates from FcRγ-chain deficient peritoneal cells revealed augmented phosphorylation of many proteins, as compared to wild-type cells. This FcRγ chain inhibitory role could be related to self-tolerance mechanisms. This work opens new perspectives for the treatment of bacterial diseases, proposing FcRγ chain targeting and the reexamination of the actual concepts of ITAM and ITIM.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / DoenÃas infecciosas constituem a principal causa de morte em todo o mundo. Dentre estas, as causadas por infecÃÃes bacterianas se destacam devido à diversidade de bactÃrias e à sua capacidade evolutiva e adaptativa. Respostas inflamatÃrias inadequadas estÃo associadas a essas infecÃÃes e em detrimento de avanÃos cientÃficos, o diagnÃstico precoce e o tratamento de quadros de infecÃÃes bacterianas sistÃmicas permanecem um desafio à saÃde pÃblica. Neste contexto, este estudo avaliou a capacidade da lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) e Cratylia argentea (CFL) em modular a inflamaÃÃo sistÃmica causada por Salmonella enterica sorotipo Typhimurium. As lectinas foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-50 e ensaios de avaliaÃÃo toxicolÃgica e seguranÃa farmacolÃgica foram realizados. Ambas as lectinas nÃo demonstraram toxicidade atà a mÃxima dose de 2000 mg/kg. EntÃo, camundongos foram inoculados, por via intraperitoneal, com as lectinas (10 mg/kg), 72, 48 e 24 horas antes de serem infectados com a Salmonella (107 UFC/mL). Foi observada uma sobrevida de 100% e 90% dos animais tratados com a ConBr e CFL, respectivamente, avaliados no sÃtimo dia. Este protocolo reduziu significativamente o nÃmero de bactÃrias no sangue, fluÃdo peritoneal e nos principais ÃrgÃos da infecÃÃo (baÃo e fÃgado). Foi observado ainda reversÃo da falÃncia na migraÃÃo de neutrÃfilos, leucopenia, bem como, reduÃÃo nos nÃveis de citocinas (TNF-α, IL-1 e IL-10) e Ãxido nÃtrico no soro. Foi tambÃm verificado um aumento na concentraÃÃo de Ãxido nÃtrico no fluido peritoneal e do nÃmero de plaquetas no sangue. AnÃlises in vitro mostraram que ambas as lectinas nÃo apresentam atividade bactericida, reduzem o tempo de ativaÃÃo do sistema complemento e aumentam o tempo de coagulaÃÃo intrÃnseca e extrÃnseca. As lectinas nÃo apresentaram efeito curativo quando administradas apÃs a infecÃÃo e nÃo demonstraram efeito preventivo quando inoculadas por via endovenosa ou oral. AtravÃs da anÃlise proteÃmica, proteÃnas relacionadas à infecÃÃo e à aÃÃo moduladora das lectinas foram identificadas. Assim, as lectinas possivelmente atuam sobre os macrÃfagos/monÃcitos, controlando sua ativaÃÃo, e desta forma, atenuando o processo inflamatÃrio e protegendo os animais do choque sÃptico. Estes resultados representam uma interessante perspectiva para o controle de infecÃÃes, com uso independente ou associado a antibiÃticos de aÃÃo direta sobre microrganismos / Infectious diseases are a leading cause of death throughout the world. Among these, bacterial infections stand out due to the enormous diversity of bacteria and their evolutionary and adaptive abilities. Inappropriate inflammatory responses have been associated with these infections and despite contemporaneous scientific approaches, timely diagnosis and proper treatment of systemic bacterial infection are still a challenge for public health. Thus, this study evaluated the ability of Canavalia brasiliensis (ConBr) and Cratylia argentea (CFL) lectin in modulating systemic inflammation caused by Salmonella enterica serovar Typhimurium. The lectins were purified by affinity chromatography on Sephadex G50. Toxicology and the pharmacological security of lectins was evaluated. Both lectins exhibited no toxicity up to 2000 mg/kg. Mice were inoculated intraperitoneally with lectins (10 mg/kg) within 72, 48 and 24 h before infection with Salmonella (107 CFU/mL). Animals treated with ConBr and CFL, respectively, showed 100% and 90% survival, seven days after infection. This protocol significantly reduced the bacteria in blood, peritoneal fluid and in main organs such as liver and spleen. It was also observed a reversal of the neutrophil migration failure, leukopenia, as well as reduction of cytokine levels (TNF- α, IL- 1 and IL -10) and nitric oxide on the serum. In addition, elevated peritoneal fluid concentration of nitric oxide and increase in the number of platelets were found. In vitro analyzes identified that both lectins did not exhibit antibacterial activity, can decrease the time of activation of complement system and increase intrinsic and extrinsic clotting time. Lectins had no curative effect when administered after infection and none protective effect when inoculated either intravenously or orally. Through proteomic analysis, proteins related to infection and to modulating action of lectins were identified. According to our results, we found that lectins can act on macrophages/monocytes, controlling their activation and thereby influencing the inflammatory process, protecting the animals from septic shock. These results represent an interesting approach for the control of infections, using lectins independently or associated with antibiotics whose action is directly on microorganisms.

A sepse é causada por microorganismos tais como: bactérias Gram-negativas, Gram-positivas, fungos e vírus. A sepse grave e o choque séptico estão associados a taxas de mortalidade de 40 a 60%. O evento mais importante para a evolução do quadro séptico é a apoptose das células efetoras do sistema imune. A eliminação de um grande número de células do sistema imune compromete a defesa efetiva do hospedeiro. Para estudarmos o papel das células imunes na sepse utilizamos o modelo de tolerância ao LPS. Em nossos estudos induzimos tolerância ao LPS em camundongos Balb-C e analisamos os padrões da expressão gênica nos linfócitos do baço. Para o mapeamento dos genes, utilizamos o macroarray, identificamos o grupo funcional de genes que tem maior relevância na proteção induzida pela tolerância, e em seguida confirmamos os resultados encontrados através do RT-PCR, Western Blotting, atividade de caspase 1 e citometria de fluxo. Encontramos uma importante redução na expressão de genes, como heat shock proteins, óxido nítrico e apoptose. Após análise da membrana contendo os genes integradores da resposta produzida pela tolerância, optamos por enfatizar inicialmente os genes envolvidos no processo apoptótico devido à relevância deste processo no quadro séptico conforme mostraram os trabalhos encontrados na literatura. Demonstramos que animais tolerantes ao LPS apresentam diminuição dos eventos apoptóticos, com redução na expressão dos genes ligados às caspases 7, 8 e 11, assim como a redução dos genes ligados ao Bid e Apaf-1. Ao analisarmos o RNAm através do RT-PCR, encontramos redução na Caspase 3, Bax e Bcl2, resultado que se confirmou ao analisarmos a expressão protéica através do Western- Blotting. Realizamos citometria de fluxo para avaliarmos a ocerrência de apoptose nos linfócitos dos animais submetidos à ligadura cecal. Confirmamos uma redução da apoptose e necrose em linfócitos dos animais tolerantes em relação aos controles. Com estes resultados podemos propor que a tolerância seria benéfica na redução da apoptose e controle do quadro séptico, além disso, a diminuição na expressão do gene ligado à caspase 11 estaria contribuindo para a diminuição do quadro inflamatório, pois a caspase 11 é um mediador essencial na resposta ao choque séptico. / Sepses are caused by microorganisms such as: Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, fungus and virus. Several sepses and the septic shock have been associated with the mortality rates from 40 to 60%. One of the most important events for the septic evolution is the apoptosis cells of the immune system. The cells immune system elimination compromises the host. We induced LPS tolerance in Balb-C mice and analyzed genes expressions in spleens; we found an important reduction in the genes expressions like: heat shock proteins, nitric oxide and apoptosis. After analysis of the membrane containing the sepses genes produced by tolerance, we emphasized initially the genes involved in the apoptosis. Demonstrated that animals LPS tolerants presented decrease in apoptotic events, with reduction in the genes expression related caspases 7, 8, 11, Bid and Apaf-1. In the mRNA by RT-PCR, we found a reduction in Caspase 3, Bax and Bcl2, and these results were confirmed by Western-blot. We realized flow cytometry and we showed that the results are maintained, presenting reduction in both the apoptotic and necrotic events in tolerants animals. These results showed that the tolerance would be favorable in the apoptosis reduction and control of the sepsis, moreover, the expression reduction to caspase 11 genes would be contributing to the inflammatory reduction because Caspase 11 is an essential mediator in the septic shock.

OBJETIVOS: determinar a relação entre parâmetros de estresse oxidativo, gravidade de sepse e resposta ao tratamento com antioxidantes. MATERIAL E MÉTODOS: foram incluídos pacientes consecutivos admitidos na UTI de um hospital terciário com o diagnóstico de sepse, sepse grave ou choque séptico. Os pacientes foram avaliados diariamente e foi coletado sangue imediatamente após a inclusão no estudo (máximo de 12h após diagnóstico de sepse). Avaliou-se os níveis séricos de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), carbonilação de proteínas, atividade de superóxido dismutase (SOD) e catalase. Estas variáveis foram correlacionadas com desfecho e variáveis clínicas. Para determinar a relação dos parâmetros oxidativos na resposta ao tratamento, utilizamos o modelo de ligação cecal e perfuração (CLP) empregando ou não tratamento antioxidante (N-acetilcisteína mais deferoxamina). Coletou-se sangue da veia caudal 3h após a indução de sepse e correlacionou-se os parâmetros com resposta ao tratamento antibiótico e antioxidante. Para determinar se o tratamento antioxidante poderia ser retardado por 12h, em uma segunda amostra de animais coletou-se sangue da veia caudal e administrou-se ou não tratamento após 12h da indução de sepse. RESULTADOS: níveis elevados de proteínas carboniladas e de SOD no diagnóstico de sepse são relacionados com óbito por sepse nesta amostra. Estes parâmetros são correlacionados com a gravidade da doença avaliada pelos escores APACHE II e MODS. Níveis de atividade da SOD podem prever resposta ao tratamento com antioxidantes no modelo CLP, tanto 3 como 12h após a indução de sepse. CONCLUSÃO: Parâmetros oxidativos são associados com gravidade e desfecho de sepse em UTI geral, e podem prever resposta ao tratamento antioxidante em animas. / OBJECTIVE: determine the relationship between oxidative stress parameters, sepsis severity and treatment response to antioxidants. MATERIALS AND METHODS: were included consecutive patients admited on ICU at a tertiary care Hospital with sepsis, severe sepsis or septic shock. The patients were evaluated, blood samples were colected immediately after study inclusion (12h maximum after sepsis diagnosis). We determined plasma levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS), protein carbonyls, superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and correlate it to clinical parameters. To determine the relation between oxidative parameters and response to antioxidant treatment we used the cecal ligation and perforation (CLP) model of sepsis, using or not antioxidants (n-acetyilcysteine plus deferoxamine) 3 or 12 hours after CLP. RESULTS: non-survivor septic patients presented higher protein carbonyls and SOD activity when compared to survivor patients. These parameters were correlated to APACHE II and MODS in our sample. In addition, plasma SOD levels predicted response to antioxidant treatment in the CLP model, both 3 and 12 houras after sepsis induction. CONCLUSION: Oxidative parameters are correlated to severity and outcome in septic patients and could predict response to antioxidant treatment in the CLP model.

A compreensão da fisiologia e dos mecanismos moleculares da sepse tem sido foco de muitos estudos. As infecções severas, como a sepse, são responsáveis por 10% do total de mortes registradas em Unidades de Tratamento Intensivo em todo o mundo. O desfecho da sepse ocorre devido a influência de fatores ambientais e genéticos, cuja expressão de variantes genéticas suportam ou não este desfecho. Muitos mecanismos estão envolvidos na sepse, incluindo a liberação de citocinas e a ativação de neutrófilos, de monócitos e de células endoteliais. Há associação entre superprodução de óxido nítrico, produção excessiva de radicais livres, depleção de antioxidantes, e déficit energético celular. Enzimas antioxidantes endógenas como a Superóxido Dismutase, a Glutationa Peroxidase e a Catalase protegem a célula do dano oxidativo. A enzima superóxido dismutase dependente de manganês é um potente antioxidante intracelular codificada por um gene (SOD2; 6q25-2) que tem sua expressão induzida por mediadores inflamatórios tais como interleucina 1, interleucina 4, interleucina 6, Fator de Necrose Tumoral – α, lipopolisacarídeos. O gene SOD2 apresenta um polimorfismo de mutação de base C47T no exon 2, o qual resulta na substituição do resíduo 16 (Ala16Val) pertencente ao peptídeo sinal da proteína. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito diferencial das variantes - 9Ala e -9Val da superóxido dismutase dependente de manganês sobre as células mononucleares de sangue periférico humano (in vitro) durante um processo infeccioso (induzido por lipopolisacarídeos), investigando sua implicação: (I) na produção de Espécies Reativas; (II) na atividade e imuno-conteúdo da Superóxido Dismutase dependente de Manganês; (III) na atividade e imuno- conteúdo da Catalase; (IV) na atividade e imunoconteúdo da Glutationa Peroxidase; (V) na produção de nitrotirosina; (VI) na produção de nitrito/nitrato; (VII) na liberação de Fator de Necrose Tumoral - α; (VIII) na produção de Carboximetil-lisina; (IX) dienos conjugados; (X) no imuno-conteúdo da Poli (ADP ribose) Polimerase; (XI) no imuno-conteúdo do Receptor de Produtos Avançados de Glicação; (XII) no imuno-conteúdo da Proteína de Choque Térmico; (XIII) no imuno-conteúdo do Fator Nuclear κB; (XIV) no dano ao DNA celular; (XV) na determinação das defesas antioxidantes totais não enzimáticas. Os resultados demonstraram que o polimorfismo Ala-9Val participa na regulação do ambiente redox celular, e que o alelo 47C permite que as células no estado basal (sem lipopolisacarídeos) respondam com mais eficiência ao estresse oxidativo celular. Este alelo apesar de produzir mais espécies reativas também aumenta o mecanismo de defesa antioxidante. Porém, quando em uma doença que produza estresse oxidativo, no caso a sepse, o alelo 47C torna o ambiente intracelular pró-oxidativo podendo agravar a condição celular. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o polimorfismo Ala-9Val é um alvo promissor para novos estudos com o objetivo de usar marcadores genéticos para direcionar a terapia necessária para cada paciente. / The understanding of the physiology and of molecular mechanisms of sepsis has been focus of many studies. The severe infections, as the sepsis, are responsible for 10% of total of deaths registered in Intensive Care Units all over the world. The outcome of sepsis happens due to influence of environmental and genetic factors, whose the expression of genetic variants supports or not this outcome. Many mechanisms are involved in sepsis, including the cytokines liberation and the neutrophils activation, of monocytes and of endothelial cells. There is association among overproduction of nitric oxide, excessive production of free radicals, depletion of antioxidants, and cellular energy deficit. Endogenous antioxidant enzymes as Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase and Catalase protect the cell of oxidative damage. The manganese superoxide dismutase enzyme it is a potent antioxidant intracellular codified by a gene (SOD2; 6q25-2) that has her expression induced by the inflammatory mediators such as interleukin 1, interleukin 4, interleukin 6, tumor necrosis factor – α, lipopolysaccharide. The SOD2 gene presents a single-nucleotide polymorphism C47T in the exon 2, which results in the substitution of the residue 16 (Ala16 Val) belonging to the signal peptide of the protein. The aim of this work was to study the differential effect of the variants -9Ala and -9Val of manganese superoxide dismutase on the Peripheral Blood Mononuclears Cells human (in vitro) during an infectious process (induced by lipopolysaccharide), investigating her implication: (I) in the production of Reactive Species; (II) in the activity and immunocontent of Manganese Superoxide Dismutase; (III) in the activity and immunocontent of Catalase; (IV) in the activity and immunocontent of Glutathione Peroxidase; (V) in the nitrotyrosine production; (VI) in the nitrite/nitrate production; (VII) in the production of tumor necrosis factor - α; (VIII) in the production of carboxymethyl lysine; (IX) conjugated dienos; (X) in the immunocontent of the Poly (ADP-ribose) Polymerase; (XI) in the immunocontent of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts; (XII) in the immunocontent of Heat Shock Protein; (XIII) in the immunocontent of the Nuclear Factor kappa B; (XIV) in the damage to cellular DNA; (XV) in the determination of the non-enzymatic antioxidant cellular defenses. The results demonstrated that the polymorphism Ala-9Val it participates in the regulation of the cellular redox environment, and that the 47C allele allows that the cells in the basal state (without lipopolysaccharide) they answer with more efficiency to the stress oxidative cellular. This allele in spite of producing more RS also increases the mechanism of antioxidant defense. However when in a disease that produces oxidative stress, in the case the sepsis, the 47C allele turns intracellular environmental pro-oxidative could worsen the cellular condition. In summary, the data presented here suggest that the polymorphism Ala- 9Val is a promising target for new studies with the goal of using genetic markers to guide therapy required for each patient.

Sepsis is the expression of a complex network of mediators of inflammation. To define which of these biological indicators discriminate the diagnosis and prognosis is the focus of current researches. To evaluate the role and the diagnostic and prognostic value of lactate, ultrasensitive C-reactive protein (CRP-US), procalcitonin (PCT) and interleukin-6 (IL-6) in adult patients at the ICU with sepsis. Observational, cohort study was conducted between October 2009 and April 2010, enrolling adult patients admitted to two general ICUs of Aracaju, Sergipe, Brazil, diagnosed with severe sepsis (S) or septic shock (SS). There was no interference of researchers in therapeutic regimens and the patients were followed until discharge, death or the 28th day of ICU stay. APACHE II score was calculated at admission (D1) and SOFA score, at D1 and D3. Lactate was measured at D1 and D2 and CRP-US, PCT and IL-6 at D1. The scores and biomarkers were compared between S and SS subgroups and among non-survivors (NS) and survivors (SU). Were evaluated 30 patients, of which S was diagnosed in 23.3% and SS in 76.7% . The mean age was 67.8 ± 18.9 years and it was a single factor predictive of death. Death was the outcome in 53.3% of patients (S = 14.3% and SS = 65.2%). The mean APACHE II was 22.1 ± 8.2 and had good accuracy to predict both the diagnosis and mortality; the mean SOFA at D1 was 9.2 ± 3.5; at D3 was 7.7 ± 3.5, with good accuracy to predict both the diagnosis and mortality; and the Δ SOFA was 1.5 ± 1.5, with no statistical significance. The average of lactate at D1 was 3.7 ± 1.6 mmol/l; at D2 was 2.7 ± 0.7 mmol/l (S = 2.2 ± 0.5; SS = 2.8 ± 0.7); and the lactate clearance was 19.0 ± 39.5. The average of CRP-US was 7.8 ± 14.4 mg / dl (S = 8.9 ± 4.9; SS = 16.0 ± 7.8). The average of PCT was 4.2 ± 8.5 ng / ml and the mean IL-6 was 2.9 ± 0.4 pg / ml. This study showed that the APACHE II and SOFA scores have good accuracy to predict both the diagnosis and mortality among patients with sepsis and that agewas the single factor predictive of death but did not discriminate the diagnosis; the lactate of the second day, and the US-CRP at the admission discriminated the diagnosis, but were unable to predict the outcome; and that the Δ SOFA, lactate clearance, PCT and IL-6 had no discriminatory power in predicting, separately, both the diagnosis and prognosis. Thus, no single biomarker to provide an absolute ability to distinguish sepsis from other inflammatory conditions, nor to monitor and predict its progression or response to treatment; all of them can be used in its proper clinical context, as adjuncts to decision making regarding diagnosis and treatment. / Sepse é a expressão de uma complexa rede de mediadores da inflamação. Definir quais desses indicadores biológicos discriminam o diagnóstico e o prognóstico é o foco das pesquisas atuais. Avaliar o valor diagnóstico e prognóstico do APACHE II, do SOFA, do lactato, da proteína C reativa ultrassensível (PCR-US), da procalcitonina (PCT) e da interleucina-6 (IL-6) em pacientes adultos internados em UTI com sepse. Estudo observacional, de coorte, desenvolvido entre outubro de 2009 e abril de 2010, com adultos admitidos em duas UTIs gerais de Aracaju, Sergipe, Brasil, com sepse grave (SG) ou choque séptico (CS). Não houve intervenção dos pesquisadores na terapêutica instituída e os pacientes foram seguidos até a alta, o óbito ou o 28° dia de permanência na UTI. O APACHE II foi calculado na admissão (D1) e o SOFA no D1 e D3. O lactato foi dosado no D1 e D2 e a PCR-US, a PCT e a IL-6 no D1. Estas variáveis foram comparados entre os subgrupos SG e CS e sobreviventes (S) e os não-sobreviventes (NS). Foram avaliados 30 pacientes, dos quais 23,3% com SG e 76,7% com CS. A média de idade foi de 67,8 ± 18,9 anos e foi significativo preditor da mortalidade. O óbito foi o desfecho em 53,3% dos pacientes (CS = 65,2%). A média do APACHE II foi de 22,1 ± 8,2 e apresentou significância para o diagnóstico e o desfecho. O SOFA do D1 foi de 9,2 ± 3,5 e o do D3 de 7,7 ± 3,5, com significância para o diagnóstico e o desfecho; o Δ SOFA de 1,5 ± 1,5, sem significância estatística. A média do lactato do D1 foi de 3,7 ± 1,6 mmol/l, do D2 de 2,7 ± 0,7 mmol/l (SG = 2,2 ± 0,5; CS = 2,8 ± 0,7) e o clearance do lactato foi de 19,0 ± 39,5%. A média da PCR-US foi de 14,4 ± 7,8 mg/dl (SG = 8,9 ± 4,9; CS = 16,0 ± 7,8). A PCT foi de 4,2 ± 8,5 ng/ml e a média de IL-6 foi de 2,9 ± 0,4 pg/ml. O estudo evidenciou que os escores APACHE II e SOFA têm boa acurácia para predizer o diagnóstico e a mortalidade entre pacientes com sepse e que a idade foi o fator isolado preditivo de morte, mas não discriminou o diagnóstico; que o lactato do segundo dia e a PCR-US da admissão discriminaram o diagnóstico, mas foram incapazes de predizer o desfecho; e que o Δ SOFA, o clearance do lactato, a PCT e a IL-6 não tiveram poder discriminatório em predizer, isoladamente, nem o diagnóstico nem o prognóstico. Assim, não há um único biomarcador que apresente habilidade absoluta para distinguir sepse de outras condições inflamatórias, nem para monitorizar e predizer sua progressão ou resposta ao tratamento; todos eles podem ser usados, em seu apropriado contexto clínico, como coadjuvantes para a tomada de decisão quanto ao diagnóstico e ao tratamento.

Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T05:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ananias_Marcelo_M.pdf: 2055583 bytes, checksum: 5fd8a44119cef5e936f452b0c65edb49 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A patogenicidade de Escherichia coli em infecções extra-intestinais (ExPEC) depende das propriedades de virulência bacterianas. Estas, geneticamente, distribuem-se por diversas ilhas associadas a patogenicidade ¿ blocos gênicos contíguos ¿ responsáveis por expressar fatores que permitem às bactérias colonizarem, sobreviverem e assim, agredirem a integridade do hospedeiro. Para setenta e três (73) amostras de E. coli oriundas de pacientes septicêmicos isoladas por hemocultura foram detectadas a sorogrupagem (antígeno O), produção de hemolisinas, produção de enzimas e letalidade em camundongos, assim como o estudo molecular pela PCR de genes dos principais FV relacionados a ExPEC: adesinas ¿ fímbria tipo 1 (fimH), fímbria S (sfaD/E) e fímbria P (papC), além dos alelos 1, 2 e 3 da adesina fimbrial P (papG), adesina afimbrial (afaB/C); cápsula K1/K5 (kpsMTII); sideróforos - aerobactina (iucD), yersiniabactina (fyuA) e salmoquelina (iroN); toxinas ¿ hemolisina (hlyA), fator necrozante citotóxico do tipo 1 (cnf1) e toxina autotransportadora secretada (sat); miscelâneos ¿ invasão do endotélio microvascular cerebral (ibeA), resistência sérica (traT), colicina V (cvaC) e proteína uropatogênica específica (usp). Nenhuma amostra demonstrou atividade proteolítica. A produção de hemolisina foi detectada em 20,5% das amostras. Os sorogrupos O associados a UPEC prevaleceram em 52,1% das amostras contra 13,7% de outros sorotipos. Rugosas e não-tipáveis totalizaram 34,2%. Os resultados da PCR identificaram prevalência acima de 70% para os genes fimH, fyuA, kpsMTII e iucD. Entre 30% e 70% estiveram prevalentes os genes papC e papG, sat, iroN, usp e traT. Os genes sfaD/E, hlyA, cnf1, cvaC, ibeA e afaB/C estiveram presentes em no máximo 20% das amostras. O alelo de maior incidência para papG foi o 2; contudo, o alelo 3 apresentou maiores índices de associação com os outros fatores de virulência e o alelo 1 não foi detectado. A alta prevalência de amostras encapsuladas (74,0%) e hábeis em seqüestrar ferro (75,3%) condiz com a origem septicêmicas das amostras em estudo, que necessariamente devem driblar o sistema imunológico do hospedeiro e seqüestrar ferro. Todavia, os genes com baixa prevalência parecem desempenhar significativa função na ausência dos genes com maior prevalência neste estudo / Abstract: The pathogenicity of Escherichia coli in extraintestinal infections (ExPEC) depends to virulence properties bacterial. This, genetically, spread by several pathogenicity associated islands ¿ genic blocks contiguous ¿ responsible to express factors that allow to bacteria colonize, survive and thus, hurt the host integrity. Seventh tree strains of E. coli isolated from septicemic patients by means of hemoculture, it was detected antigen O sorogroup, production of hemolysins, enzymes e mouse lethality, plus the molecular study by PCR of the main genes associated of virulence factors in ExPEC: adhesins ¿ type 1 fimbriae (fumH), S fimbriae (sfaD/E) and fimbriae P (papC), and the alleles 1, 2 and 3 of adhesin P fimbrial, afimbrial adhesin (afaB/C); capsule K1/K5 (kpsMTII); siderophores ¿ aerobactin (iucD), yersiniabactin (fyuA) and salmochelin (ironN); toxins ¿ hemolysin (hlyA), necrotizing cytotoxic factor type 1 (cnf1) and toxin autotransporter secreted (sat); miscellaneous ¿ brain microvascular endothelial cells invasion (ibeA), seric resistance (traT), colicin V (cvcA) and specific uropathogenic protein (usp). No strain showed proteolytic activity. Hemolysin production was detected in 20,5% of strains. The O sorogroups associated to UPEC prevalent in 52,1% of strains against 13,7% of others sorogroups. Wrinkled and no-type totalized 34,2%. The results of the PCR identified prevalence above 70% for the genes fimH, fyuA, kpsMTII and iucD. Between 30-70% are prevalent the genes papC and papG, sat, iron, usp and traT. The genes sfaD/E, hlyA, cnf1, cvaC, ibeA and afaB/C bave been presents in the maxim 10% of strains. The allele with higher prevalence to papG was 2; but, the allele 3 presented higher numbers of association with others virulence factors. The high prevalence of encapsulated strains (74,0%) and able to uptake iron (75,3%) is according to the origin septicemic of strains studied, that necessarily may escape of the immunological system of host and uptake iron. Howerver, the genes with low prevalence seems to display an important function in the lack of the genes prevalent in this study / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular